PLoS ONE: LAP2 er almindeligt overudtrykt i Diverse fordøjelseskanalen Kræft og Regulerer motilitet of Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Lamina-associerede polypeptider 2 (LAP2) er en nuklear protein, der forbinder nuklear lamina med kromatin. Selvom dens kritiske roller i genetiske sygdomme og hæmatopoietiske maligniteter er blevet beskrevet, har sit udtryk og roller i fordøjelseskanalen kræft blevet dårligt karakteriseret.

Metoder

For at undersøge ekspressionen af ​​LAP2 i patientens væv, udførte vi immunhistokemi og real-time PCR. For at undersøge motilitet af kræftceller, vi ansat Boyden kammer, sårheling og Matrigel invasion assays. For at afsløre sine roller i metastase in vivo, brugte vi en levermetastaser xenograftmodel. For at undersøge den underliggende mekanisme, blev et cDNA microarray udført.

Resultater

Immunhistokemi i patientens væv viste udbredt ekspression af LAP2 i forskellige fordøjelseskanalen cancere herunder mave, bugspytkirtel, lever, og galdegang kræftformer . Real-time PCR bekræftede, at LAP2β er overudtrykt i gastrisk cancer væv. Knockdown af LAP2β påvirkede ikke spredning af de fleste fordøjelsessystemet kræft tarmkanalen celler undtagen bugspytkirtelkræftceller. Imidlertid knockdown af LAP2β faldt motilitet af alle testede kræftceller. Desuden overekspression af LAP2β øget motilitet af gastriske og bugspytkirtelkræftceller. I levermetastaser xenograft model, LAP2β forøget metastatisk effektivitet af gastriske cancerceller og mortalitet hos testede mus. cDNA microarrays viste muligheden for, at myristoylerede alanin-rige C-kinase substrat (MARCKS) og interleukin6 (IL6) kan mediere LAP2β-reguleret motilitet af cancerceller.

Konklusioner Salg

Fra de ovenstående resultater, vi konkludere, at LAP2 er almindeligt overudtrykt i diverse fordøjelseskanalen kræft og LAP2β regulerer motilitet af kræftceller og foreslå, at LAP2β kan have nytte for diagnostik og terapi i fordøjelseskanalen kræft

Henvisning:. Kim HJ, Hwang SH, Han ME , Baek S, Sim HE, Yoon S, et al. (2012) LAP2 er almindeligt overudtrykt i Diverse fordøjelseskanalen Kræft og Regulerer motilitet af kræftceller. PLoS ONE 7 (6): e39482. doi: 10,1371 /journal.pone.0039482

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: September 8, 2011; Accepteret: 24 maj 2012; Udgivet: Juni 20, 2012 |

Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Medical Research Institute Grant (2010-25), Pusan ​​Rigshospitalet, det medicinske forskningscenter program for Undervisningsministeriet, Videnskab og Teknologi /Korea Science and Engineering Foundation (2011 til 0.006.190) og National Core Research center program fra Undervisningsministeriet, Videnskab og Teknologi (nr R15-2006-022-01001-0). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastase af kræftceller i høj grad påvirker prognosen for kræftpatienter. Overlevelsesraten for patienter med fjernmetastaser er betydeligt lavere end dem, der har lokaliseret tumor i de fleste typer cancer [1]. En af de kritiske faktorer i metastase er motilitet af cancerceller [2]. Mange kritiske molekyler, som regulerer motilitet af cancerceller er blevet identificeret. Fordi inhibering af migration er effektiv til behandling metastase i mange aspekter, mange migrationshæmmere er under klinisk udvikling [3]. For eksempel, Rho-kinase er en lille GTPase som regulerer actin og microtubulin netværk og cellulære fremspring. Så, en inhibitor, som er rettet Rho-kinase er under klinisk udvikling [3].

Lamina-associerede polypeptider 2 (LAP2) er en af ​​LEM-domæne proteiner, som er indre nukleare membranproteiner, som deler en fælles motiv af ca. 40 aminosyrer, kendt som LEM-domænet [4], [5]. LEM-domæne proteiner forbinde den indre nukleare membran og den nukleare lamina med kromatin gennem barrieren-til-autointegration faktor (BAF). Familien af ​​LEM-domæne proteiner omfatter LAP2 [6], [7], [8], emerin [9], MAN1 [4], LEM2 [10] og LEM3 [11]. Navnet LEM stammer fra LAP2, Emerin og MAN1 [4].

Ud over deres strukturelle roller i kernemembranen, har LEM-domæne proteiner blevet vist at spille kritiske roller i forskellige cellulære processer, såsom DNA-replikation og regulering af genekspression. LAP2β regulerer DNA-replikation ved at interagere med HA95 i G1-fasen af ​​cellecyklussen [12]. Denne interaktion med HA95 fører de prereplication komplekser til replikation oprindelse og stabiliserer det. Forstyrrelse af denne interaktion forårsager frigivelse af prereplication komplekse komponenter og udløser proteolyse af Cdc6.

patologiske konsekvenser er blevet beskrevet for LEM-domæne proteiner i genetiske sygdomme hos mennesker og er kollektivt kaldes laminopathies [5], [13 ]. For eksempel Emerin mangel forårsager Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD) [9], [14], [15] og MAN1 mangel fører til osteopoikilosis, Buschke-Ollendorf syndrom og melorheostosis [16]. Ud over disse laminopathies, er blevet beskrevet inddragelse af LAP2 i carcinogenese. For eksempel har LAP2β vist sig at være involveret i proliferation af maligne lymfocytter [12], [17], [18]. Desuden blev overekspression af LAP2α rapporteret i larynx, lunge, mave, bryst og tyktarmskræft væv [19]

LAP2 familie af LEM domæne proteiner, består af mindst seks isoformer i pattedyr:. Α, β , γ, δ, ε, ζ, [6], [20], [21], [22]. Disse isoformer dannes ved alternativ splejsning af samme transkript. Alle isoformer undtagen pattedyrs LAP2α og LAP2ζ er indre nukleare membranproteiner og deler en lignende domæne organisation. Den N-terminale segment indeholder LEM-domænet og LEM-lignende domæne. I modsætning til LEM-domæne, kan LEM-lignende domæne interagerer direkte med kromatin uden hjælp fra BAF. Den C-terminale segment af LAP2 proteiner har Lamin-bindende domæner. Især det C-terminale segment af α-isoformen mangler et formodet transmembrandomæne, så proteinet er fordelt over hele kernen. Selv LAP2α, β, og γ er udtrykt ubikvitært i de fleste mammale celler, differentiel ekspression af LAP2 isoformer er blevet beskrevet. Differentierede væv stærkt udtrykker LAP2γ isoform dog væv med prolifererende celler udtrykker flere af de LAP2α og LAP2β isoformer [23].

Selvom sine kritiske roller i genetiske sygdomme og hæmatopoietiske maligniteter er blevet beskrevet, udtryk og roller LAP2 i andre celler eller sygdomme er dårligt karakteriseret. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi for første gang en hidtil ukendt rolle LAP2β i reguleringen af ​​motilitet af cancerceller og overekspression af LAP2 i forskellige fordøjelseskanalen kræftformer.

(A) Immunohistokemisk farvning viste overekspression af LAP2 i forskellige kræftformer fordøjelseskanalen herunder bugspytkirtel, lever, mave og galde rørledning kræft. Bemærk overekspression af LAP2 i metastatiske cancerceller. Scale bar, 200 pm. (B) Overekspression af LAP2β i gastrisk cancer væv blev undersøgt ved real-time PCR under anvendelse af specifikke primere for β-isoformen. GAPDH blev anvendt til at normalisere alle data.

Western blotting (A, B) og real-time PCR (C, D) blev anvendt til at bestemme effektiviteten af ​​knockdown (A, C) eller overekspression ( B, D) på LAP2β i SNU638 eller PANC1 celler. Dataene er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg (* P 0,01, Students t-test). (E) Effekt af LAP2β knockdown på proliferation af cancerceller. WST-1 assay blev anvendt til måling proliferation af cancerceller i nærvær af 10% FBS. Fem dage efter transfektion med med 100 nM LAP2β siRNA eller 100 nM forvrænget (SCR) siRNA, WST-1 proliferation assay blev udført. (F) Effekt af LAP2β overekspression på proliferation af cancerceller. WST-1 assay blev gennemført i SNU638 eller PANC1 celler, der overudtrykker LAP2β genet eller kontrol vektor. Dataene er de midler ± SD af tre uafhængige forsøg i fem eksemplarer (* P 0,01, t-test).

Metoder

cellekulturer og transfektion

følgende fordøjelseskanalen cancerceller blev anvendt; gastriske kræftceller (SNU216, SNU638), kolangiokarcinom celler (SNU1079, HuCCT1), bugspytkirtelkræftceller (PANC1, MIA-PACA2), hepatocarcinoma celler (Huh7, HepG2). HuCCT1, HepG2, SNU216, SNU638, SNU1079 og Huh7 celler blev dyrket i RPMI1640 tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 ug /ml penicillin /streptomycin. PANC1 og MIA-PACA2 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DME) /høj glucose suppleret med 10% FBS og 100 ug /ml penicillin /streptomycin. De fleste celler blev dyrket ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Celler blev transficeret med siRNA hjælp DhamaFECT Reagens 3 (Dhamacon, Lafayette, CO, USA) ifølge producentens anvisninger. Sekvenserne af siRNA er som følger: LAP2β siRNA (Bioneer, Daejeon, Sydkorea), 5’ACA AGA GGG UCA AGA AGA A (DTDT) -3 ‘og 5’UUC UUC UUG ACC CUC UUG U (DTDT) -3 ‘; scrambled (SCR) siRNA (Dhamacon, Lafayette, CO, USA), 5’GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (DTDT) -3 ‘og 5’UUU CGC UCU UUU CGC GAU C (DTDT) -3 “.

overekspression af LAP2β

DNA ekspressionskonstruktion pCMV-SPORT6-LAP2β (Thermo videnskabelig åben Biosystem, Huntsville, AL, USA) blev anvendt til at drive overekspression og G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA) blev anvendt til selektion. Celler blev co-transficeret med pCMV-SPORT6-LAP2β /pIRES-Neo i en 05:02 procent med FuGENE HD (Roche, Nutley, NJ) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Mock celler blev etableret samtidig benytter tom styrevektor.

Western Blotting

Efter gelelektroforese og overførsel til en PVDF-membran, blev membranen blokeret i en time. Efter tilsætning primære antistoffer (muse-anti-humant LAP2β (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 1:1000) og muse-anti-α-tubulin (Biogenex, 1:10000)) i blokeringsopløsning blev membranen inkuberet i det primære antistof ved 4 ° C natten over på et rysteapparat. Den passende sekundære antistof blev påført (1:2000, peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse) og inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer på et rysteapparat. Endelig blev påvist proteinerne ved hjælp LAS3000.

Boyden kammer assay (A-G) og sårheling assay (H, SNU638 celler) blev anvendt til at måle migrering af cancerceller. LAP2β siRNA hæmmede FBS- eller EGF-induceret migration væsentligt i forhold til SCR siRNA i SNU638 (A, C), PANC1 (A, D) eller andre fordøjelsesforstyrrelser kræft tarmkanalen celler (G). Overekspression af LAP2β i SNU638 (B, E) eller PANC1 (B, F) celler signifikant forøget migration sammenlignet med kontrolvektoren (B, E, F). EGF (100 ng /ml) eller 10% FBS blev anvendt til at inducere kemotaxi. Mitomycin C (0,01 ug /ml) blev tilsat for at fjerne virkningerne af proliferation. To dage efter transfektion med 100 nM LAP2β siRNA eller 100 nM forvrænget (SCR) siRNA begge til migration assays blev udført. Fire eller seks timer senere efter tilsætning af EGF eller FBS i Boyden kammer assay blev cellerne fikseret. Efter en ridse i sårheling assay blev migrerede celler fastsat til de angivne tidspunkter. Repræsentativt farvning af migrerede celler blev præsenteret (A, B). Migrerede celler blev talt, og dataene præsenteres som grafer (C-G). Data er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg i triplikat (C-G, * P 0,01, t-test).

Matrigel invasion assay blev anvendt til måling invasion af cancerceller. Knockdown af LAP2β inhiberede signifikant FBS- og invasion EGF-induceret forhold til SCR siRNA i SNU638 (A, C) eller PANC1 (A, D) celler. Overekspression af LAP2β i SNU638 (B, E) eller PANC1 (B, F) celler signifikant forøgede invasion sammenlignet med kontrolvektoren. EGF (100 ng /ml) eller 10% FBS blev anvendt til at inducere invasion. Mitomycin C (0,01 ug /ml) blev tilsat for at fjerne virkningerne af proliferation. To dage efter transfektion med 100 nM LAP2β siRNA eller 100 nM forvrænget (SCR) siRNA, invasionen assays blev udført. Repræsentativt farvning af invaderede celler blev præsenteret (A, B). Invaderede celler blev talt, og dataene præsenteres som grafer (C-F). Dataene er de midler ± SD af tre uafhængige forsøg i tre eksemplarer (CF, * P 0,01, t-test)

Real-time blev opnået PCR

mavekræft væv. med skriftligt informeret samtykke fra patienter, som gennemgik kirurgisk resektion ved Pusan ​​National University Hospital og Pusan ​​nationale Universitet Yangsan Hospital, og undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse hospitalerne (Permit Number 2009-13). Total RNA fra væv eller celler blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Calsbad, CA, USA) eller RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. cDNA blev syntetiseret med MMLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA), dNTP og oligo-dT-primere. Primersekvenserne var som følger: LAP2β, 5’AGG GCA GAG CAA AGA CTC CAG TAA SLV -3 “og 5’TTA TTC CAG CTT GAG AAT AGC TCT GAT TGT GC -3« MARCKS, 5’GTG CCC AGT TCT CCA AGA CCG CA -3 ‘og 5’GGC CAT TCT FTT GTC CGT TCG CT -3 «, IL6; 5’TAG CCG CCC CAC ACA GAC AGC C -3 ‘og 5’TTC TGC CAG TGC CTC TTT GCT GCT -3 « STAT3, 5’AAC ATG GCT GGC AAG GGC TTC TCC T-3 ‘og 5’AGT GCT CAA GAT GGC CCG CTC CC-3’; GAPDH, 5’GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 ‘og 5’TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G – 3’. Real-time RT-PCR blev udført ved anvendelse Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i en ABI Prism 7500-sekvens detektor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. GAPDH blev anvendt til at standardisere cDNA inputniveauer.

Immunhistokemi

Efter deparaffination og rehydrering blev objektglassene underkastet 0,3% hydrogenperoxid i 30 min for at standse endogen peroxidaseaktivitet. Blokering blev udført med 10% normalt æsel serum (NDS) og 1% BSA i 1X PBS. Derefter blev objektglassene inkuberet natten over ved 4 ° C i blokeringspuffer indeholdende følgende primært antistof; anti-humant LAP2 (1:200, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anti-STAT3 (1:100, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-IL6 (1:100, ABCAM, Cambridge, UK) eller anti-MARCKS (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) antistof. Sekundært antistof (peberrodsperoxidasekonjugeret) binding blev udført ved en 1:200 fortynding i blokeringsbuffer i 2 timer ved stuetemperatur. Detektion blev udført med HRP (Vector Laboratories) ved anvendelse af DAB-substrat kit (Vector Laboratories). Kontrastfarvning blev gjort i 1 min med hæmatoxylin farvning buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Cell Proliferation Assay

To, tre eller fem dage efter transfektion med siRNA, tilføjede vi 10 pi forblandet vandopløseligt tetrazoliumsalt-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, USA) celleproliferation reagens i hver brønd. Disse celler blev inkuberet i to timer i inkubatoren. Cellelevedygtighed blev målt ved absorbans ved 450 nm med en ELISA-læser (TECAN, Mannedorf, Schweiz).

Boyden Chamber Assay

Migration af cancerceller blev målt i en Boyden kammer. Ca. 5 x 10

4 celler i 0,05 ml serumfrit RPMI1640 medium blev podet til brønden membran-belagt med Type I kollagen. At fjerne virkningerne af proliferation blev mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) tilsat. Cellerne fik lov til at migrere i fire eller seks timer. Membraner blev fikseret og farvet under anvendelse Diff-quik opløsning (Sysmex, Kobe, Japan) i en min og vasket med destilleret vand. Celleantal i 10 tilfældigt udvalgte felter blev bestemt ved anvendelse af et lysmikroskop. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange.

Sårheling Assay

cellemonolaget blev ridset med en gul pipettespids og migration af celler til det sårede område blev observeret under et omvendt mikroskop. At fjerne virkningerne af proliferation blev mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) tilsat. Billeder blev taget på de angivne tidspunkter. Målinger blev taget fra fem individuelle mikroskopiske felter i hvert forsøg, og de repræsentative data fra tre forsøg er vist.

Matrigel Invasion Assay

evne kræftceller til at invadere blev bestemt ved anvendelse af 24 brønde BioCoatTM MatrigelTM kammer indsatser (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Den indvendige indsats af invasionen kamre blev coatet med 0,5 mg /ml vækstfaktor-reduceret Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og den ydre insert med 0,5 mg /ml fibronectin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celler blev podet i inserter med en densitet på 5 x 10

4 per insert i serum-frit medium og derefter overført til brønde fyldt med dyrkningsmediet indeholdende 10% FBS eller 100 ng /ml EGF som kemoattraktant. At fjerne virkningerne af proliferation blev mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) tilsat. Efter 24 (10% FBS) eller 52 timer (100 ng /ml EGF) inkubation blev ikke-invaderende celler på toppen af ​​membranen fjernes ved skrabning. Invaderet celler på bunden af ​​membranen, er fastsat, efterfulgt af farvning med Diff-quik opløsning. Eksperimenter blev udført tre gange, og mindst 10 felter blev talt i hvert eksperiment.

levermetastaser xenograftmodel

Evnen af ​​transfektanter til at metastasere til leveren blev evalueret ved langsomt intravenøse celler ( 5 × 10

6 /0,05 ml) i milten af ​​nøgne mus via en 27-gauge kanyle (NK4 gruppe, mock gruppe, n = 5 /gruppe). For patologiske undersøgelser blev alle mus aflivet på 5 uger og levere blev isoleret, fikseret i 10% neutral – bufret formalin, og indlejret i paraffin. Snit blev farvet med hematoxylin og eosin. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Den Pusan ​​Nationale Universitet Institutional Animal Care og brug Udvalg (PNUIACUC) godkendte de eksperimentelle procedurer (tilladelsens nummer: PNU-2010-00.083).

cDNA Microarray

Total RNA blev ekstraheret fra SNU638-LAP2 og SNU638 mock celler under anvendelse RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Kvantitetsbestemte RNA blev derefter anvendt til microarray analyse på human HT-12_v4_Bead chips (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Total RNA-prøver blev mærket under anvendelse af Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, Applied Biosystem, CA, USA) til cDNA-syntese og in vitro-transkription. Enkeltstrenget RNA (cRNA) blev dannet og mærket ved inkorporering biotin-NTP (Ambion). I alt 0,5 ug af biotin-mærket cRNA blev hybridiseret ved 58 ° C i 16 timer til Illumina Human HT-12_v4_BeadChip (Illumina). Den hybridiseret biotinyleret cRNA blev påvist med streptavidin-Cy3 og kvantificeret under anvendelse af en BeadArray Reader Scanner (Illumina) ifølge producentens instruktioner. Array data blev behandlet og analyseret af Illumina BeadStudio version 3.0 software (Illumina). Scannede data blev normaliseret ved fraktil-fraktil normaliseringsmetode og log-transformeret (ved bunden to). Alle data er MIAME kompatibel og de rå data blev forelagt den offentlige repository. (NCBI s GEO tiltrædelse nummer: GSE31450)

Gastric cancerceller overeksprimerer LAP2β gen eller kontrol vektor injiceret i milten og metastase til leveren blev undersøgt 5 uger senere. Metastatiske tumor områder blev angivet med stiplede cirkler. Repræsentative immunfarvninger med anti-LAP2, anti-IL6, anti-STAT3, og anti-MARCKS antistoffer og H 0,05, som blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

LAP2 er almindeligt overudtrykt i Diverse fordøjelseskanalen Kræft

For at undersøge ekspressionsmønstre af LAP2 i fordøjelseskanalen spor kræftformer, herunder mave, bugspytkirtel, lever, og galdegang kræft, vi udført immunhistokemi hjælp patient væv (n = 15 pr hver kræft type). LAP2 protein var bredt overudtrykt i ondartede område af væv sammenlignet med ikke-kræft områder (fig. 1A, 47% i mavekræft, 27% i pancreas cancer, 30% i leverkræft, 40% i galdegang kræft). Især ekspression af LAP2 blev observeret i metastatiske cancerceller af patienternes væv. Fordi LAP2 har mange isoformer, fokuserede vi på LAP2β. For at bekræfte resultaterne af immunohistochemistsry udførte vi realtids-PCR under anvendelse LAP2β-specifikke primere i gastrisk cancer væv. Selvom alle testede væv ikke overekspression LAP2β blev det overudtrykt i 13 tilfælde (i alt 24 tilfælde, fig. 1B).

Roller LAP2β i spredning, Migration, og invasion af kræftceller

for at undersøge roller LAP2β i carcinogenese, vi bankede-down eller overudtrykt LAP2β hjælp siRNA eller cDNA hhv. Vi kontrollerede effektiviteten af ​​modulationen af ​​LAP2β genet ved Western blotting eller real-time PCR (fig. 2A-D). LAP2β siRNA (100 nM) faldt mRNA niveauet af LAP2β i SNU638 eller PANC1 celler i forhold til SCR siRNA med 42% eller 61%. Overekspression af LAP2β ved cDNA-transfektion forøgede mRNA-niveauet af LAP2β i SNU638 eller PANC1 celler (klon # 6) sammenlignet med kontrolvektoren med 1,7 eller 19,6 gange henholdsvis.

Dernæst undersøgte vi rolle LAP2β i proliferation af cancerceller. Fem dage efter transfektion med SCR eller LAP2β siRNA blev WST-1 proliferation assay udført. Knockdown af LAP2β påvirkede ikke spredning af de fleste testede cancerceller undtagen bugspytkirtelkræftceller (Fig. 2E). LAP2β siRNA hæmmede spredning af MIA-PaCa2 og PANC1 bugspytkirtlen kræftceller i forhold til SCR siRNA med 74% og 46% (fig. 2E). Vi observerede lignende resultater, når vi udførte WST-1 proliferation assay to eller tre dage efter transfektion. Overekspression af LAP2β i SNU638 eller PANC1 celler svagt påvirket proliferation (fig. 2F).

For at fastlægge den rolle, LAP2β i migration af kræftceller, vi gennemført undersøgelser ved hjælp af en Boyden kammer assay. I alle testede kræftceller, knockdown af LAP2β inhiberede migration af cancerceller (fig. 3). F.eks LAP2β siRNA inhiberede FBS- eller EGF-induceret migrering af SNU638 celler sammenlignet med SCR siRNA med 47% og 70% (figur 3A, . 3C). I constrast, overekspression af LAP2β øget FBS- og EGF-induceret migrering af SNU638 celler sammenlignet med mock celler ved 145% og 387% (fig 3B . 3E). Lignende resultater blev opnået i LAP2β- overudtrykker PANC1 celler (Fig 3B . 3F). Denne virkning på migration af cancerceller blev yderligere bekræftet ved en sårhelende assay i SNU638 celler (Fig. 3H). Disse resultater førte os til at undersøge den rolle, LAP2β i invasionen af ​​kræftceller. I en Matrigel invasion assay LAP2β siRNA inhiberede FBS- og EGF-induceret invasion af SNU638 celler sammenlignet med SCR siRNA med 93% og 47% (. Figur 4A 4C). Lignende resultater blev opnået i PANC1 (Fig 4A . 4D) eller SNU216 (data ikke vist) celler. I modsætning hertil overekspression af LAP2β øget FBS- og EGF-induceret invasion af SNU638 celler sammenlignet med kontrol vektor ved 725% og 1.223% (fig 4B . 4E). Lignende resultater blev opnået i PANC1 (Fig 4B . 4F). Celler

LAP2β Forbedrer Metastatisk Effekt af gastrisk kræftceller i en levermetastaser xenograftmodel

Regulering af motilitet af cancerceller ved LAP2β foreslog den mulighed, at LAP2β regulerer metastase af cancerceller in vivo. For at undersøge denne mulighed injicerede vi gastriske kræftceller i milten af ​​nøgne mus og derefter observeret metastase i leveren. Interessant overekspression af LAP2β øget effektivitet og størrelsen af ​​levermetastaser (fig. 5) og mortalitet af testede mus. 67% af mus injiceret med gastrisk cancer celler, der overudtrykker LAP2β døde 8 uger senere efter injektionen, mens alle kontrolmus injiceret med gastrisk cancer celler, der udtrykker kontrolvektor overlevede. I den histologiske undersøgelse af xenograft væv, bekræftede vi overekspression af LAP2β i xenotransplantat afledt fra mus injiceret med LAP2β-overudtrykker celler (Fig. 5).

LAP2β-inducerede ændringer i mRNA-ekspression

for at afsløre den underliggende mekanisme af LAP2β-regulerede motilitet, vi udførte en cDNA microarray (NCBI s GEO tiltrædelse nummer: GSE31450). Selvom mRNA-niveauet af LAP2β blev overudtrykt i den stabile cellelinje 1,7 gange, de af mange gener blev ændret af overekspression (figur 2 . Tabel 1). Blandt de væsentligt ændrede gener ved LAP2β fokuserede vi på myristoylerede alanin-rige C-kinase substrat (MARCKS), signaltransducer og aktivator for transcription3 (STAT3) og interleukin6 (IL6), da disse gener er blevet rapporteret at regulere motilitet af celler. Real-time PCR for hvert gen bekræftet væsentlige ændringer i mRNA-niveauer for hvert gen (fig. 6). Overekspression af LAP2β forøgede mRNA-niveauerne af MARCKS og IL6 sammenlignet med kontrolgruppen vektor ved 193% og 79% (fig. 6). Desuden øgede udtryk for MARCKS, IL6 og STAT3 blev observeret i xenotransplantat afledt fra mus injiceret med LAP2β-overudtrykker celler (Fig. 5).

Genekspression mellem gastriske cancerceller overepxressing LAP2β gen eller kontrol vektorer blev sammenlignet ved cDNA-mikroarray. Real-time PCR blev anvendt til at bekræfte LAP2β-induceret ændring i genekspression af

MARCKS, STAT3 og IL-6

i SNU638 celler. Dataene er plottet som fold ændringer i forhold til mock celler. Dataene er de midler ± SD af tre uafhængige forsøg i fem eksemplarer (* P 0,01, t-test).

Diskussion

LAP2, en af ​​LEM domæne proteiner, har været hovedsageligt beskrevet at spille en strukturel rolle i kernemembranen og at være involveret i flere genetiske sygdomme. Men her præsenterer vi for første gang sit udtryk og roller i diverse fordøjelseskanalen kræftformer. I særdeleshed fandt vi, at LAP2β kan styre motilitet af kræftceller samt bidrage til metastaser af kræftceller.

Metastase af kræftceller i høj grad påvirker prognosen for kræftpatienter. Adskillige resultater i den foreliggende undersøgelse understøtter, at LAP2β regulerer motilitet og metastase af cancerceller. In vitro eksperimenter i Boyden kammer, sårheling og Matrigel invasion analyser viste, at knockdown faldt mens overekspression af LAP2β øget migration og invasion af cancerceller (Fig 3 . 4). Endvidere i xenotransplantatmodellen, LAP2β forbedret metastase af cancerceller (fig. 5). Selvom styrevektor-transficerede celler forårsaget metastase i xenograftmodel, effekten var ganske ineffektiv og langsom. I modsætning hertil viste LAP2β-overudtrykte celler en mere aggressiv opførsel i xenotransplantat. Endvidere fandt vi overekspression af LAP2 i metastatiske cancerceller af væv fra patienter (Fig. 1).

Hvordan kan LAP2β bidrage til motilitet og metastase af cancerceller? Vi fandt flere gener, der blev induceret ved LAP2β i cDNA microarray analyse (tabel 1), der blev yderligere bekræftet ved real-time PCR (fig. 6) og immunhistokemi i xenograft (fig. 5). En af dem, MARCKS, er ansvarlig for binding og krydsbinding af actinfilamenter direkte til membranen [24]. Overekspression af MARCKS er blevet fundet i forskellige cancerformer, herunder hepatocellulær carcinom [25], pancreascancer [26], glioblastoma [27] og cholangiocarcinom [28]. Desuden MARCKS spiller en kritisk rolle i EGFR-induceret invasion af glioblastomceller [29]. Mange andre undersøgelser har vist inddragelsen af ​​MARCKS i cellulær motilitet [30].

En anden kandidat-gen, som medierer LAP2β-induceret motilitet er IL-6, som primært produceres under akut og kronisk inflammation. Cancerceller, der udsættes for IL-6 eller udskiller cytokinet som en autokrin faktor show øget invasionsevne [31], [32], [33]. Endvidere inaktivering af gp130, en transducer af IL-6-signalering, reduceret aggressivitet brystcancerceller in vivo [34]. Adskillige IL-6-signalvejen gener herunder STAT3 er også forbundet med migration og invasion af cancerceller [35], [36], [37]. IL-6 er bredt udtrykt i mange faste cancere, herunder prostatacancer [38], bryst [39], lunge [40] kræft, og glioblastom [41].

Hvordan kan LAP2β regulere genekspression? LEM-domæne proteiner er blevet vist at være i stand til at regulere genekspression ved sekvestrering transkriptionelle regulatorer til den nukleare lag. MAN1 binder til receptor-regulerede R-Smads og antagoniserer signalering ved transformerende vækstfaktor β (TGFp), activin og knoglemorfogenetisk protein (BMP) [42]. MAN1 mangel fører til embryonale vaskulære remodeling defekter i mus og knogleudvikling hos mennesker [16], [43]. Et andet eksempel er emerin binding til p-catenin, et nedstrøms mål for Wnt signalering, hvilket fremmer dens udgang fra kernen [44]. Emerin mangel fører til nuklear akkumulering af β-catenin. LAP2β er blevet vist at interagere med HDAC3 og regulere E2F, p53 og NF-KB transskriptionsfaktorer [5], [45]. I fremtidige studier, hvordan LAP2β kan regulere MARCKS eller IL-6-ekspression berettiger yderligere undersøgelse.

Inddragelsen af ​​LAP2β i replikation blev foreslået af en undersøgelse, hvor afkortet LAP2β ændret DNA replikation effektivitet [18]. Reguleringen af ​​DNA replikation ved LAP2β er blevet foreslået at være medieret af to mulige veje. LAP2β kan reducere aktiviteten af ​​E2F kompleks alene eller med kønsceller mindre (GCL) [46]. Den anden vej er gennem interaktion med HA95 i G1-fasen af ​​cellecyklussen [12]. Denne interaktion med HA95 bidrager til stabiliteten af ​​prereplication komplekser. I den foreliggende undersøgelse havde knockdown af LAP2β ikke påvirke proliferation af de fleste fordøjelses cancer tarmkanalen celler undtagen bugspytkirtelkræftceller (fig. 2). Desuden har overekspression af LAP2β ikke forårsage betydelig ændring i proliferation (fig. 2), hvilket tyder på reguleringen af ​​spredning af LAP2β i fordøjelseskanalen kræft tarmkanalen celler er ikke så kritisk.

Udbredt overekspression af LAP2 i forskellige fordøjelseskanalen kræft er beskrevet for første gang i den foreliggende undersøgelse (fig. 1). Ekspression af LAP2β er blevet beskrevet i forskellige normale væv, herunder hud, thymus, lunge, testikel og ovarie. Imidlertid blev dets ekspression i normalt mavetarmkanalen sjældent detekteres [47]. Overekspression af LAP2β blev rapporteret i forskellige hæmatologiske maligne celler og neuroblastomceller [17], [48].