PLoS ONE: Multimodal behandling fjerner Cancer Stamceller og fører til langsigtet overlevelse i primære humane bugspytkirtelkræft Tissue Xenografter

Abstrakt

Formål

På trods af intens forskningsindsats, pancreas duktalt adenocarcinom er stadig en af ​​de mest dødbringende maligniteter i verden. Vi og andre har tidligere identificeret en subpopulation af bugspytkirtelkræft stamceller inden tumoren som en kritisk terapeutisk mål og desuden vist, at tumoren stroma udgør ikke kun en restriktiv barriere for vellykket levering af narkotika, men også fungerer som en parakrin niche for cancer stamceller . Derfor har vi gået i gang med en storstilet undersøgelse af virkningerne af at kombinere kemoterapi, pindsvineoverføringsvejen hæmning, og mTOR hæmning i en præklinisk musemodel af kræft i bugspytkirtlen.

Eksperimentel Design

Prospective og randomiseret test i et sæt af næsten 200 subkutane og ortotopisk implanteret hel-væv primære humane tumorxenoplantater.

Resultater

Den kombinerede målretning af meget kemoterapi cancer stamceller såvel som deres mere differentierede afkom, sammen med ophævelse af tumormikromiljøet ved at målrette stroma og styrke væv penetration af det kemoterapeutiske middel udslag i betydeligt forlænget overlevelse i prækliniske modeller for human pancreascancer. De fleste udtalte terapeutiske virkninger blev observeret i gemcitabin-resistent patient-afledte tumorer. Interessant nok kunne den foreslåede tredobbelt behandling tilgang forbedres yderligere ved hjælp af en PEGyleret formulering af gemcitabin, som i væsentlig grad øget sin biotilgængelighed og væv penetration, hvilket resulterer i en yderligere forbedret samlede resultat.

Konklusioner

Dette multimodal terapeutisk strategi bør undersøges nærmere i den kliniske indstilling som dens succes i sidste ende kan forbedre dårlig prognose for patienter med pancreas duktalt adenokarcinom

Henvisning:. Hermann PC, Trabulo SM, Sainz B Jr, Balic A, Garcia E , Hahn SA, et al. (2013) Multimodal behandling fjerner Cancer Stamceller og fører til langsigtet overlevelse i primære humane bugspytkirtelkræft Tissue Xenografter. PLoS ONE 8 (6): e66371. doi: 10,1371 /journal.pone.0066371

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: November 13, 2012; Accepteret: 7 maj 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Hermann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende arbejde blev støttet af ubegrænset forskningsbevilling fra Siena Biotech, et ERC Advanced Investigators Grant (Pa-CSC 233.460), den Subdirección General de evaluering y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 /02129, Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanien ) og Programa Nacional de Internacionalización de la i + D, Subprogramma: FCCI 2009 (Modalidad ACI-PLAN e Células Madre Proyectos PLE2009-0105 og Modalidad ACI-Colobra Indien, både Ministerio de Ciencia e Innovación). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. To af forfatterne er i øjeblikket (Patrizia Tunici) eller var indtil for nylig (Annette Bakker ) ansat af den kommercielle bidragyder af denne forskning ‘Siena Biotech SpA «. Patrizia Tunici og Annette Bakker udviklet og valideret SIBI-C1, men var ikke involveret i design og dataanalyse af den foreliggende undersøgelse. Forfatterne bekræfter også, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Ingen andre relevante erklæringer bevirker vedrørende beskæftigelse, rådgivning, patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter, osv

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (i det følgende benævnt “kræft i bugspytkirtlen” eller PDAC ) er den fjerde hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [1], [2], [3] og er kendetegnet ved en høj grad af metastase og udtalt resistens mod kemoterapi og strålebehandling. Trods omfattende forskningsindsats i de seneste årtier er der gjort lidt betydelige fremskridt i retning af at forbedre de kliniske endpoints [4]. Selvom indførelsen af ​​den anti-metabolit gemcitabin i 2007 har forbedret klinisk respons ved at reducere smerter og vægttab [5], har sygdommen prognose forblevet ekstremt fattige med en 5 års overlevelse på ~3-4% og en median overlevelse periode på 4 -6 måneder [1], [6]. Faktisk har flere undersøgelser konsekvent vist, at gemcitabin behandling meste mål differentierede kræftceller resulterer i en relativ berigelse af cancer stamceller [7], [8], [9]. For patienter med metastatisk sygdom, men god performance status, den nylige kombinationsbehandling FOLFIRINOX (oxaliplatin, irinotecan, fluoruracil og leucovorin) viste en signifikant overlevelsesfordel men med forøgede toksiske bivirkninger [10]. Alternativt regime af nab-paclitaxel plus gemcitabin viste betydelig anti-tumor aktivitet med mere tålelige bivirkninger i en fase I /II studie, berettiger fase III-evaluering [11]. Men i alle disse forsøg størstedelen af ​​patienterne i sidste ende bukket fra sygdomsprogression. , Udvikling af nye kræftlægemidler og /eller nye behandlingsmetoder forbliver således en høj sundhedspleje prioritet.

Med stigende beviser for eksistensen af ​​cancer stamceller, er en ny horisont spirende i udviklingen af ​​terapeutiske strategier mod kræft i bugspytkirtlen. Cancer stamceller udgør en subpopulation af celler, kan skelnes fra hovedparten af ​​tumoren baseret på deres eksklusive evnen til at føre tumorgenese og metastase. Disse celler spiller også en afgørende og kørsel rolle i sygdom tilbagefald [12], [13], [14], [15], [16]; derfor, belysning af de mekanismer, der ligger til grund bugspytkirtlen tumorigenese og især bugspytkirtelkræft stamceller er af afgørende betydning for udviklingen af ​​mere effektive klinisk tilgængelige behandlinger. Faktisk har vi for nylig udviklet roman tilgange, at begge mål cancer stamceller og overvinde deres mekanismer kemo-resistens [9], [17], [18]. For eksempel har vi vist, at selv-fornyelse kapacitet af kræft i bugspytkirtlen stamceller er afhængig af både

Hedgehog

mTOR

signalering, og samtidig målretning af disse to veje, i kombination med gemcitabin , repræsenterer en ny strategi behandling for epiteliale cancere, såsom pancreascancer [9]. Med udgangspunkt i disse undersøgelser, vi her undersøger anvendeligheden, sikkerhed, og potentialet for yderligere optimering af denne kombinationsbehandling tilgang i et stort sæt af primære patient-afledte tumorer.

Resultater

Triple Therapy Markant reducerer tumorstørrelse og Øger Survival

Vi har tidligere vist, at kugle kulturer af bugspytkirtelkræftceller berige for cancer stamceller [8], [9], [17], og at kombineret målretning af Sonic Hedgehog (SHH ) og mTOR veje kan tilbyde en ny behandlingsmulighed. Her er vi kontrollere i fire forskellige primære kræft i bugspytkirtlen cellelinjer afledt patientens tumorer, kræft stamcelle-beriget kugle kulturer faktisk show markeret overekspression af SHH og Hedgehog målgener GLI-1 og GLI-2 (fig. 1A), samt øget mTOR pathway aktivitet (fig. 1B). Den efterfølgende

in vivo

evaluering af kombinationsbehandlingen blev udført i klinisk mest relevante modeller for patient-afledte bugspytkirtlen kræft hel-væv xenografter (se fig. 1C til studiedesign). Stykker af kortvarigt

in vivo

udvidede primære humane pancreas tumorer indeholder heterogene populationer af kræftceller, herunder kræft stamceller [9] samt stromale celler [7], pancreas stjerneformige celler, inflammatoriske celler og ekstracellulær matrix blev implanteret subkutant og ortotopisk ind immunkompromitterede mus. Tumor take rate blev bekræftet ved tumorvækst i to på hinanden størrelse målinger, og tumorbærende mus blev randomiseret til behandling. Efterfølgende blev tumorerne målt en gang om ugen enten ved caliper (subkutane tumorer) eller med en lille animalsk ultralyd billeddannende system (ortotopisk tumorer). Som Gemcitabin (perle) repræsenterer den nuværende standard behandling for kræft i bugspytkirtlen, vi brugte Gem-behandlede mus som referencegruppe.

(A) Fold øge mRNA ekspressionsniveauer af SHH, GLI-1, og GLI-2 af kugle-afledte vs. adhærerende celler. (B) Western blot-analyse af mTOR pathway aktivitet via vurderingen af ​​S6 kinase-ekspression (øverste felt) og phosphorylering (nederste panel) i adhærente primære celler versus stamcelle-berigede sfære-afledte celler. (C) Illustration af forsøgsopstillingen. Varigheden af ​​tredobbelt behandling er præget af en mørk grå boks (dag 21 til 48), Gem monoterapi med en lys grå boks (dag 48-81).

Et sæt af repræsentative tumorer blev valgt baseret på deres forskelligartede respons på Gem behandling [7]. PDAC-265 og 185 var meget modstandsdygtige over for perle behandling, der viser hurtig vækst tumor, således at den første mus måtte fjernes fra undersøgelsen inden for 3 uger efter påbegyndelsen af ​​behandlingen (fig. 2A-E) på grund af overdreven vækst tumor. I modsætning hertil i tumorer PDAC-JH051, 247, og Pax22, perle behandling resulterede i indledende behandling respons og stabilisering sygdom; men efter fjernelsen af ​​kemoterapi, tumorerne reproducerbart begyndte at vokse ud igen (fig. 2C-E). Af alle de undersøgte tumorer, kun PDAC-354, som ikke medtager

Kras

mutationer [19], viste signifikant respons på Gem behandling indtil udgangen af ​​observationsperioden (fig. 2F) og nøje efterlignede behandlingen respons observeret i selve patient (data ikke vist).

(A-F) Tumor vækstkurver for primære hel-væv xenografter PDAC-265, PDAC-185, JH051, 247, Pax22, og 354 implanteret subkutant og orthotopisk. Kontinuerlig linje forestiller Gem + køretøj, stiplet linje viser Gem + SIBI, stiplede linje viser Gem + SIBI + Rapa (n≥6 per gruppe). (G) Kaplan-Meier kurve skildrer kumulativ overlevelsestid for alle mus poolede behandlingsgruppe.

Det er vigtigt, vi var i stand til at forbedre behandlingen respons ved at kombinere kemoterapi med romanen pindsvineoverføringsvejen inhibitor SIBI-C1 ( SIBI, Siena Biotech) [20]. SIBI hæmmer kraftigt genekspression af SHH og nedstrøms målgener som GLI2 i primære bugspytkirtelkræftceller

in vitro

(fig. S1A i File S1). SIBI blev administreret for kun 3 uger for at reducere potentielt skadelige virkninger. Perle blev givet for en samlet periode på 60 dage i henhold til almindelig klinisk praksis (Fig. 1C). På grund af den kraftige reaktion på kemoterapi alene, havde co-behandling af mus med PDAC-354 xenotransplantater med enten SIBI ikke viser en yderligere effekt på niveauet af tumorstørrelse (fig. 2F) eller overlevelse (data ikke vist). For alle de andre tumorer, dog dobbelt behandling med perle + SIBI førte til en markant reduktion i tumorstørrelse (stiplet linje, figur 1 . 2), signifikant forsinkelse i tumorvækst, og dermed væsentligt forlænget overlevelse sammenlignet med mus, der modtog enten ingen behandling eller perle + Vehicle (fig. 2G). Vigtigere er imidlertid, tumorer med tiden tilbagefald begrænsende overlevelse i mus, der fik denne dobbelte terapi. Disse data er i overensstemmelse med forbedret levering af gemcitabin efter udtømning af beskyttende stromale væv [21]. Som tidligere vist, hæmning af hedgehog signalering alene ikke fuldstændigt ophæver kræft stamcellepopulation (Fig 3A . B) [9]

(A) repræsentant flowcytometri plots og (B) kvantificering af cancer. stamcelle (EpCAM

+ CD133

+ CD44

+) indhold af tumorer i den respektive behandlingsgruppe (kumulative resultater af celler opnået fra forskellige xenografter). (C) Repræsentative billeder og kvantificering af sekundær sfære dannelse af behandlede PDAC-Pax22 tumorer eksplanterede ved afslutningen af ​​forsøget (D200).

Da vi har vist i omfattende

in vitro

undersøgelser, at kræft stamceller faktisk kan fjernes ved tilsætning af en inhibitor af mTOR veje [9], vi næste undersøgt effekten af ​​et behandlingsregime bestående perle, SIBI, og etablerede mTOR-hæmmer rapamycin (Rapa) på vores repræsentativt panel af primære kræft i bugspytkirtlen væv implanteret. Interessant, observerede vi en meget stærk reaktion på denne tredobbelte terapi, hvilket resulterer i en stabilisering sygdom eller endda regression i undersøgte næsten alle tumorer (stiplet linje, figur 1 . 2). Dette omsættes til en væsentligt forbedret kumulativ overlevelse i forhold til alle andre behandlingsgrupper (fig. 2E).

Kombinationsterapi udtømmer Cancer Stem Cell Indhold og Alters Tumor Sammensætning

For at vurdere

in vivo

effekter ved kombinationsbehandling om kræft stamceller populationer, vi eksplanteret og fordøjet repræsentative tumorer i hver gruppe efter afslutningen af ​​de 3 ugers tredobbelt behandling, og analyseret ved flowcytometri udtryk for overflademarkører tidligere knyttet til en cancer stamcelle-fænotype [8], [9], [13]. Procentdelen af ​​EpCAM

+ CD133

+ CD44

+ -celler i perle-behandlede tumorer var regelmæssigt 2-3 gange højere sammenlignet med ubehandlede tumorer [data ikke vist og [8]]. I modsætning hertil Gem + SIBI allerede viste et mindre fald i kræft stamceller numre sammenlignet med perle alene (Fig 3A . B). Vigtigt er, kun kræver tilsætning af Rapa til behandlingsplanen stort set elimineret cancer stamceller fra tumoren. Desuden ved ophør af studietiden (dag 200) undersøgte vi sekundær sfære dannelse som en funktionel analyse for kræft stamceller aktivitet i PDAC-Pax22 tumorer og observeret, at kugle dannelse kapacitet lidt blev formindsket for kulturer afledt af tumorer behandlet med perle + SIBI sammenlignet med perle alene. Interessant, men det var først efter tredobbelt behandling, som vi kunne iagttage fuldstændig ophævelse af kugle dannelse aktivitet (fig. 3C), hvilket tyder på, at tredobbelt kombinationsbehandling effektivt havde udtømt kræft stamceller pool i tumoren.

Mere detaljeret histologisk undersøgelse af tumorerne viste, at de forskellige behandlingsregimer også ændret den cellulære sammensætning af tumoren. Mens de primære tumorafledte xenotransplantater anvendt til denne undersøgelse viste en rimelig høj mængde stroma (35-70%) i grupperne behandlet med perle (Fig. 4A, venstre paneler), tilsætning af et hedgehog inhibitor markant nedsat den stroma indhold (fig. 4A, midterste paneler), en observation, der er i god overensstemmelse med tidligere offentliggjorte rapporter [21]. Denne virkning var lidt mere udtalt efter tilsætningen af ​​Rapa (fig. 4A, højre paneler), og var statistisk signifikant sammenlignet med tumorer behandlet med perle alene (fig. 4B). Som forventet, vi observerede de samme virkninger efter behandling af Gem-følsomme tumorer (fig. S1B i File S1). Interessant, vi observerede lignende virkninger i ortotopisk tumorer (fig. 4A) som i subkutane tumorer (fig. S1B i File S1).

(A) Repræsentative histologiske billeder, der viser stroma indhold i de respektive behandlingsgrupper i gemcitabin resistente ortotopisk tumorer (PDAC-185, øverste panel), (Pax22, nederste panel). (B) Kvantificering af stroma indhold i de forskellige behandlede xenotransplantater.

PEGylering af Gemcitabin forøger virkningen af ​​kombinationsbehandling

yderligere

Da tidligere rapporter har vist, at modificere den kemiske struktur af perle ved PEGylering fører til signifikant øget cirkulation tid og væv penetration

in vivo

og kan derfor være en roman mulighed for forbedret behandling af patienter med (pancreas) kræft [22], [23], besluttede vi som en næste trin at bestemme virkningerne af polyethylenglycol-bundne perle (PEG-perle) som forlænget

in vivo

cirkulationstid og højere vævsgennemtrængning af PEG-Gem kan generere overlegen virkninger som sammenlignet med standard perle. Først, vi vurderet den

in vitro

effekter af PEG-Gem sammenlignet med perle på frisk isolerede primære humane bugspytkirtelkræftceller. Til dette formål fire matchende primære cellekulturer frembragt fra

in vivo

-expanded bugspytkirtelkræft væv blev behandlet i 48 timer med enten standard perle eller PEG-Gem og efterfølgende analyseret ved flowcytometri for induktion af apoptose eller celledød, samt for deres indhold cancer stamceller. Med hensyn til procentdelen af ​​apoptotiske og døde celler, kunne observeres ingen forskelle mellem behandlingsgrupperne (fig. 5A venstre panel, og data ikke vist). Derudover har vi ikke observere forskelle mellem standard perle og PEG-perle behandling om indholdet af CD133

+ celler

in vitro

(fig. 5A højre panel).

(A )

In vitro

effekter af Gem og PEG-perle på apoptose og celledød samt CD133 udtryk (kumulative resultater af celler opnået fra forskellige xenografter). (B) Kaplan-Meier kurve afbilder kumulativ overlevelsestid for alle mus poolede behandlingsgruppe. Til illustrative formål valgte overlevelseskurverne i fig. 2D er afbildet igen. (C) Tumor vækstkurver for primære hel-væv xenografter implanteret subkutant og orthotopisk hhv. Kontinuerlig linje forestiller Gem + køretøj, stiplet linje viser Gem + SIBI, stiplede linje viser Gem + SIBI + Rapa. (D) Kaplan-Meier Curve afbilder kumulativ overlevelsestid for alle mus poolede behandlingsgruppe. Til illustrative formål valgte overlevelseskurverne i fig. 2D er afbildet igen.

Næste vi behandlede mus bærer ortotopisk eller subkutane primære tumor-afledte hel-væv xenografter med PEG-perle, svarende til behandling regime til standard perle. Vi valgte tumorer, der viste utilstrækkelig respons med perle. Mens vi ikke oplever en betydelig forskel for median overlevelse mellem PEG-Gem og standard perle for disse tumorer (fig. 5B), er det vigtigt at bemærke, at den begyndende tumor-relaterede dødsfald i mus behandlet med PEG-perle var langt senere end med standard perle (Time indtil progression: PEG-Gem 91d vs. Gem 19d). Opmuntret af disse lovende resultater, vi næste erstattet standard perle behandling med PEG-perle i den tredobbelte terapi tilgang (PEG-perle + SIBI + Rapa) og evalueret virkningerne på tumorvækst og overlevelse i mus med PDAC-185 patient-afledte xenotransplantater. Mens i vores indledende

in vivo Salg studier perle + SIBI + Rapa behandling medførte signifikant reduceret tumorvækst og kortfristet vedvarende sygdom sammenlignet med standard perle behandling (fig. 2D), mange tumorer til sidst recidiverende. Som reaktion på behandling med PEG-Gem + SIBI + Rapa dog observerede vi næsten fuldstændig regression af tumorerne (fig. 5C), hvilket resulterede i 100% overlevelse frem til udgangen af ​​observationsperioden (dag 125) (fig. 5D ).

kombinationsbehandling viser ingen signifikant toksicitet

Potentiel toksicitet er fortsat en stor bekymring for kombinationsbehandling tilgange. For at vurdere kumulative toksicitet af de administrerede behandlinger og deres respektive kombinationer, indspillede vi legemsvægt for alle behandlede mus på en ugentlig basis, startende på dagen for randomisering indtil dag 100. Eksklusive kakeksi som en potentiel behandling-induceret bivirkning, ingen signifikante forskelle i kropsvægt blev observeret mellem behandlingsgrupperne (fig. 6A) endvidere for at udelukke potentielt skadelige virkninger på funktionen af ​​normale stamceller (fx i det hæmatopoietiske system), vi derudover overvåges hvide blodlegemer numre i de behandlede mus ved afslutningen af ​​de 3 ugers enkelt versus kombinerede terapier. Mens på dette tidspunkt af undersøgelsen forventede kumulativ toksicitet ville være den højeste, blev ingen signifikant reduktion i hvide blodlegemer observeret i nogen af ​​behandlingsgrupperne sammenlignet med standard perle behandling (p = 0,792) (fig. 6B), hvilket tyder ingen omfattende ændringer af bloddannende stamceller fra den tredobbelte kombinationsbehandling. Interessant, selv den øgede cirkulation tid og forbedret væv penetration af PEG-perle ikke øge forventede bivirkninger i forhold til standard perle behandling (Fig 6A . B).

(A) Kropsvægt var registreret for alle mus i de første 100 dage af forsøget. (B) Hvide blodlegemer i alle mus blev vurderet ved slutningen af ​​administrationen periode af den tredobbelte kombination.

Diskussion

Her er vi validere begrebet multimodal terapi for omfattende målrette de forskellige celle rum i bugspytkirtelkræft ved hjælp af et repræsentativt sæt næsten 200 subkutane og ortotopisk hel-væv primære tumorxenoplantater, hvilket gør dette en af ​​de største undersøgelser i kræft stamceller felt. Tumorer blev udvalgt på grundlag af deres tidligere beskrevet forskelligartet respons på gemcitabin [7]. Kemoterapi og stråling primært målrette differentierede cancerceller, og mens disse behandlinger inducere apoptose og celledød i tumorceller, en population af cancer stamceller er meget modstandsdygtigt [8], [9], [18], [24], overlever standarden terapi og opretholder evnen til at re-udfylde en tumor i al sin heterogenitet. Dobbelt behandling, som kombinerer perle og den nye Smoothened inhibitor SIBI konsekvent forlængede overlevelsen hos mus transplanteret med tumorer. Vigtigere er det, dog kun i mus behandlet med tredobbelt terapi kræft stamceller blev næsten fuldstændig ophævet, og vi observerede en langvarig sygdom stabilisering eller regression, og efterfølgende langsigtede overlevelse. I denne kombinationsbehandling, kan behandlingseffekten af ​​konventionel perle forbedres yderligere ved brug af PEGyleret perle via øge dets biotilgængelighed.

På det histologiske niveau, er kræft i bugspytkirtlen karakteriseret ved meget tætte stroma og dårlig vaskularisering. Olive et al. viste i en gensplejset musemodel af pancreascancer, at stroma er stærkt afhængig af hedgehog signalering, og inhibering af pindsvineoverføringsvejen med smoothened inhibitorer fører til “præferentiel” drab af stromaceller og øget kardensitet [21], hvilket således gør tumorceller mere tilgængelige for terapeutisk intervention. Mens disse observationer blev opnået i en musemodel af pancreascancer, har vi for nylig vist, at også i patient-afledte hel-væv xenotransplantater co-behandling med en udglattet inhibitor øger drug delivery [17] og markant reducerer tumorassocieret stromadannelse . Vigtigt er det, vi nu sætter pris på, at stroma ikke kun hæmmer drug delivery [21], men også giver en støttende niche for cancer stamceller fremmer deres selvfornyelse kapacitet og invasionsevne [25]. Således eliminering eller ophævelse af stroma bliver bedre væsentligt behandlingsregimer ved tydelig mekanisme, men er kun i stand til at eliminere kræft stamceller, hvis de kombineres med Gem.

Men trods den temmelig beskedne respons cancer stamceller på hedgehog pathway hæmning som et enkelt middel, var vi i stand til at vise, at smoothened inhibitorer er stadig afgørende for at kunne eliminere kemoterapi kræft i bugspytkirtlen stamceller hvis de kombineres med andre stamcelle-målrettede midler [9], [17]. Konkret har vi tidligere vist for kræft i bugspytkirtlen, at en kombination af kemoterapi og hæmmere af både mTOR og pindsvin signalering eliminerer differentierede celler samt kræft stamceller

in vitro

[9], og at dette udmønter sig i lang overlevelse sigt

in vivo

. For nylig, Wang et al. forudsat en vigtig mekanistisk link for den kombinerede hæmning af pindsvin og mTOR pathway. Konkret forfatterne viser, at mTOR /S6K1 signalering resulterer i phosphorylering af Gli og efterfølgende udtryk for downstream mål. Hæmning af begge veje langt mere pro-apoptose effekt af hæmning af enten hæmning alene [26]. I den foreliggende undersøgelse har vi nu oplevede en næsten fuldstændig eliminering af cancer stamceller til denne kombinationsterapi i en stor og repræsentativ række primære xenotransplantater. Henviser flowcytometri under anvendelse af overflademarkører CD133, EpCAM, og CD44 allerede foreslået, at indhold kræft stamcelle var stærkt reduceret, funktionelle assays (fx sfære dannelse assay) valideret, at cellerne er isoleret fra de eksplanterede tumorer faktisk var ude af stand til at danne tumor sfærer

in vitro,

kraftigt antyder, at kræft stamceller befolkning som roden af ​​sygdommen, var blevet effektivt målrettet af den tredobbelte kombination.

selvom resultaterne ved hjælp perle-SIBI-Rapa var meget konsekvent og opmuntrende tværs et panel af patient-afledte tumorer, gjorde vi observerer tumorgenvækst i nogle mus (f.eks PDAC-185 xenotransplantater) og efterfølgende et fald i overlevelsen af ​​disse xenograft-bærende dyr. Da dette kan være relateret til den begrænsede biotilgængelighed af det kemoterapeutiske middel som en væsentlig del af denne kombinationsterapi, vi yderligere avancerede vores behandlingsstrategi ved at ændre kemoterapi. Specifikt Vandana et al. har for nylig vist, at modificering gemcitabin via PEGylering fører til forbedret biotilgængelighed i kredsløbet i sammenligning med nativt gemcitabin. Selv om de også har vist bedre

in vitro

respons af etablerede bugspytkirtelkræftceller hjælp PEGyleret gemcitabin i forhold til den almindelige formulering [22], observerede vi ingen signifikante forskelle mellem Gem og PEG-Gem

in vitro

på niveau med cancer stamceller indhold eller induktion af apoptose eller celledød under anvendelse xenograft-afledte primære celler. Mens disse data er ikke overraskende, da narkotika levering og tilgængelighed er ikke et kritisk problem

in vitro

resultaterne understreger klart vigtigheden af ​​at udnytte primær cancer væv til yderligere

in vivo

evaluering af narkotika effekt .

Faktisk var vi så i stand til at validere og udvide dette koncept til

in vivo

indstilling ved at vise, at PEG-Gem behandling betydeligt forsinket tidspunktet for tumorprogression med 72 dage. Denne forbedrede behandling respons er bestemt imponerende, da det udgør mere end halvdelen af ​​den undersøgte periode. Som forventet er imidlertid tumorer i sidste ende skred resulterer i stort set ingen forskel i median overlevelse PEG-Gem behandlede mus sammenlignet med mus behandlet med traditionel perle alene. Mens disse data bekræfter, at PEGylering af perle rent faktisk forbedrer narkotika tilgængelighed og levering henholdsvis ved at øge cirkulationen tid og væv penetration, som forventet, PEG-Gem alene er tydeligvis ikke tilstrækkeligt til at overvinde kemoresistens af cancer stamceller. Derfor vi næste undersøgt virkningerne af at erstatte regelmæssig perle med PEG-perle i vores multimodal tilgang til målretning pancreas tumorer, som oprindeligt havde reageret på Gem + SIBI + Rapa behandling, men til sidst fik tilbagefald under denne særlige behandling regime. Interessant, ved hjælp af PEG-Gem + SIBI + Rapa kombination vi ikke kun observeret næsten komplet tumorregression, men vigtigst opnåede vi 100% overlevelse i hele 125d studieophold i denne meget terapi-resistent tumor. Mens denne observation ikke udelukker senere fornyet vækst, som ses i PDAC-Pax22 disse data er meget lovende og er i overensstemmelse med den opfattelse, som er obligatorisk yderligere forbedring af udformningen af ​​de kombinerede lægemidler til at udvide

in vitro

resultater til den meget mere kompleks

in vivo

indstilling.

udnyttet nye smoothened inhibitor SIBI-C1 (Siena Biotech, Italien) var også meget effektiv

in vivo

, som dåse ses af reduceret tumorvækst i kombination med perle og dermed væsentligt forbedret overlevelsestid. Desuden kan SIBI administreres sikkert

in vivo

, som vi så ingen bivirkninger på kroppens samlede vægt eller hvide blodlegemer. Vigtigt er det, det er i god overensstemmelse med tidligere observationer ved hjælp af andre smoothened hæmmere [9], [15]. Perle + SIBI + Rapa kombinationsterapi viste heller ingen signifikant toksicitet sammenlignet med perle-behandling alene i løbet af forsøgene. PEG-Gem + SIBI + Rapa kombinationsbehandling, mens meget mere effektiv

in vivo

, kun svagt, men ikke-signifikant nedsat antal hvide blodlegemer og havde ingen virkning på kropsvægten af ​​dyrene, sammenlignet med respektive kontroller. Det er vigtigt at bemærke, at de sunde og relativt unge mus anvendt til denne undersøgelse sandsynligvis bedre i stand til at kompensere for formodede bivirkninger på de normale stamceller rum under tredobbelt terapi behandling. Derfor vil det være vigtigt at yderligere validere sikkerheden ved dette behandlingsregimen i humane patienter for endeligt at anvende den på de overvejende ældre og døende patienter pancreascancer.

Afslutningsvis her giver vi overbevisende dokumentation for effektiviteten af ​​en multimodal terapi målretning differentierede celler såvel som cancer stamceller i bugspytkirtelkræft, hvilket resulterer i langvarig overlevelse hos mus. Således er disse data bekræfter og udvider tidligere resultater fra vores laboratorium i en meget stor kohorte af dyr med patient-afledte bugspytkirtelkræft xenografter [9], [15], [17]. Derudover tilbyder vi også en ny og hidtil ukendt perspektiv på, hvordan man forbedrer de nuværende terapeutiske tilgange ved at ændre den molekylære struktur af de obligatoriske kemoterapeutiske midler ved anvendelse PEGylering. Tilsammen skal disse resultater signifikant indvirkning den fremtidige udvikling af nye anti-pancreas kræftmidler og /eller behandlingsmodaliteter.

Materialer og metoder

tumorprøver

Efter patienter ‘ var blevet indhentet informeret samtykke, overskydende væv fra reseceret bugspytkirtelcarcinomer var xenotransplanteret på Johns Hopkins Medical institutioner (JHMIRB: 05-04-14-02 “En forundersøgelse til individualiseret behandling af patienter med fremskreden kræft i bugspytkirtlen”) og Hospital de Madrid – Centro Integral Oncológico Clara CAMPAL (FHM.06.10 “Etablering af bank for tumorer og sundt væv hos patienter med cancer”), henholdsvis under de angivne Institutional Review Board-godkendte protokoller [7]. Kort fortalt overskydende tumorvæv ikke nødvendigt for klinisk diagnose i løbet af rutinemæssige Whipple resektioner udføres af kirurger, der ikke var involveret i den foreliggende undersøgelse blev efterfølgende implanteret i immunkompromitterede mus. Alle patientinformation blev anonymiseret ved fjernelse af alle oplysninger, som identificerer eller kan føre til identifikation af patienten. Ingen af ​​patienterne havde gennemgået neoadjuverende strålebehandling eller kemoterapi før resektion af tumoren.

dyreforsøg

blev udført Alle dyreforsøg i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier og blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug Komité CNIO (protokol PA34 /2012- “xenotransplantation model for human bugspytkirtelkræft”). Dyrene blev huset og vedligeholdes i laminare flow kabinetter under specifikke patogenfrie betingelser.