PLoS ONE: Hypoxi induceret aggressivitet prostatacancerceller er knyttet til dereguleret ekspression af VEGF, IL-6 og miRNA der dæmpes af CDF

Abstrakt

Tumor hypoxi med deregulerede udtryk for hypoxi inducerende faktor (HIF) og dens biologiske konsekvens fører til dårlig prognose for patienter diagnosticeret med solide tumorer, hvilket resulterer i højere dødelighed, tyder på, at forståelsen af ​​den molekylære forhold hypoxi med andre cellulære funktioner i tumor aggressivitet ville være uvurderlig for at udvikle nyere målrettet terapi for solide tumorer. Emerging beviser også foreslå, at hypoxi og HIF signalveje bidrager til erhvervelse af epitel-til-mesenkymale overgang (EMT), vedligeholdelse af kræft stamceller (CSC) funktioner, og også fastholder den onde cirkel af inflammation, der alle bidrager til stråling og kemoterapi modstand. Imidlertid er de detaljerede mekanismer, som hypoxi /HIF drive disse begivenheder ikke fuldt forstået. Her har vi vist, at hypoxi fører til forøget ekspression af VEGF, IL-6, og CSC markørgener såsom Nanog, Oct4 og EZH2, og også øget ekspression af MIR-21, et onkogent miRNA, i prostatacancer (PSA) celler (PC-3 og LNCaP). Behandlingen af ​​PCA celler med CDF, et hidtil ukendt Curcumin-afledt syntetisk analog viste tidligere antitumoraktivitet

in vivo

, inhiberede de produktioner af VEGF og IL-6, og ned-reguleres ekspressionen af ​​Nanog, Oct4 , EZH2 mRNA’er, samt mIR-21 under hypoxiske tilstand. Desuden CDF behandling af PCA-celler førte til nedsat cellemigration under hypoxiske tilstand. Taget sammen tyder disse resultater på, at anti-tumor effekt af CDF er delvist medieret gennem deregulering af tumor hypoxiske veje, og således CDF kunne blive nyttige til cancerterapi

Henvisning:. Bao B, Ahmad A, Kong D, Ali S, Azmi AS, Li Y, et al. (2012) Hypoxi induceret aggressivitet prostatacancerceller er knyttet til dereguleret ekspression af VEGF, IL-6 og miRNA der dæmpes af CDF. PLoS ONE 7 (8): e43726. doi: 10,1371 /journal.pone.0043726

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 13 juni, 2012; Accepteret: 23, 2012; Udgivet: August 27, 2012 |

Copyright: © Bao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne tak Puschelberg og Guido Foundations for deres generøse finansielle bidrag. Yde støtte fra National Cancer Institute, National Institutes of Health giver 5R01CA131151, 5R01CA132794 og 1R01CA154321 (FHS), og det amerikanske forsvarsministerium Exploration-Hypotese Development Award PC101482 (BB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd, og det er den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA [1]. De fleste PCA patienter kan behandles, men patienterne normalt dør på grund af lægemiddelresistens og metastatisk sygdom. Således er der et stort behov for udvikling af nye strategier, hvorved lægemiddelresistens og metastatisk sygdom kan bekæmpes med nye midler, som kan forbedre behandlingsresultatet. Hypoxi er en af ​​de fundamentale biologiske fænomener, der uløseligt er forbundet med udvikling og aggressivitet af en række forskellige faste tumorer, herunder PSA. Hypoxi-inducerbare faktorer (HIF) fungerer som en mester transskription faktor, som regulerer hypoxi responsive gener og er blevet anerkendt for at spille kritiske roller i tumor invasion, kemo-strålebehandling modstand og øget celleproliferation, overlevelse, angiogenese og metastase [2]; [3]. Derfor tumor hypoxi med dereguleret ekspression af HIF og dens biologiske konsekvens fører til dårlig prognose af patienter diagnosticeret med faste tumorer, hvilket resulterer i højere dødelighed, tyder på, at forståelsen af ​​den molekylære forhold af hypoxi med andre cellulære funktioner i tumor aggressivitet ville være uvurderlig for udvikling nyere målrettet terapi for solide tumorer.

Det er blevet godt anerkendt, at kræft stamceller (CSCS) og epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT) fænotypiske celler er forbundet med terapeutisk modstand og bidrager til aggressiv tumorvækst, invasion og metastase, og menes at være årsag til tumortilbagevenden [4]. Nye beviser tyder på, at hypoxi og HIF pathway forbedre fænotyper og funktioner CSCS og EMT [5] – [9], der bidrager til tumor aggressivitet, som kunne også skyldes deregulering af microRNA (miRNA). De miRNA er kendt for at spille kritiske roller i en bred vifte af biologiske processer, herunder celledifferentiering, proliferation, celledød, stofskifte og energi homeostase [10]; [11]. Akkumulerende beviser har foreslået, at miRNA kan have en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​tumorer. Den ændrede ekspression af miRNA er blevet forbundet med klinisk prognose af tumor, modstandsdygtighed over for kemo-strålebehandling, og tumortilbagevenden [12] – [14]. Et stort antal miRNA er blevet rapporteret at reagere på hypoxi og HIF pathway i en lang række celler og væv, herunder cancerceller [15] – [18]. Det er blevet rapporteret, at hypoksi årsager nedsat ekspression af MIR-101, en potentiel anti-oncogen miRNA, og forøget ekspression af MIR-21 og MIR-210, oncogene miRNA i forskellige cancerformer, herunder PCa [13]; [19]. Således kan hypoxi-medieret deregulering af miRNA spiller en vigtig rolle i tumor aggressivitet medieret gennem regulering af cellulære signalveje, herunder HIF vej. Derfor målrette disse hypoxi-medierede miRNA bruger nye midler kan give innovativ terapeutisk strategi til forebyggelse og /eller behandling af PSA.

Her har vi undersøgt virkningerne af hypoxi på celle migration, invasion, angiogenese, og ekspressionen af ​​VEGF, IL-6, CSC-gener, og mIR-21 og mIR-210 i PCA-celler under hypoxiske tilstand. Vi undersøgte også den rolle, miR-21 i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​VEGF, IL-6, CSC markørgener, og deres sammenhæng med dannelse af prostaspheres i PCA celler under hypoxiske betingelser. Endvidere har vi undersøgt virkningerne af en hidtil ukendt curcumin-afledt syntetisk analog (CDF), der viste antitumoraktivitet med en større systemisk og målvævet biotilgængelighed, på celleoverlevelse, migration, invasion, angiogenese, dannelsen af ​​prostaspheres, og ekspressionen af HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC markørgener, og miRNA i PCA celler under hypoxiske betingelser. Vi fandt, at hypoksi førte til forøget ekspression af VEGF, IL-6, og CSC markørgener såsom Nanog, Oct4 og EZH2, og også øget ekspression af MIR-21 i humane PCA-celler. Behandlingen af ​​celler med CDF inhiberede de produktioner af VEGF og IL-6, og ned-reguleres ekspressionen af ​​Nanog, Oct4 og EZH2 mRNA’er, samt MIR-21 i disse celler under hypoxiske tilstand. CDF faldt også cellemigrering af PCA-celler under hypoxiske tilstand. Ud fra disse resultater konkluderer vi, at den anti-tumor effekt af CDF er delvist medieret gennem deregulering af tumor hypoxiske signalveje.

Materialer og metoder

Cell Culture, Narkotika og reagenser

human prostatacancer-cellelinier PC-3 og LNCaP-celler blev holdt under standard dyrkningsbetingelser (21% O

2 og 5% CO

2, 37 ° C). Hypoksisk (1% O

2) og 5% CO

2 betingelser blev frembragt ved at styre input strømningshastigheder af nitrogen og carbondioxid, henholdsvis i kulturen inkubator. Alle cellelinier blev opretholdt i 10% FBS-RPMI-1640 medium under standard cellekultur tilstand. CDF blev syntetiseret som beskrevet i vores tidligere publikationer [20]; [21].

Cell Survival Assay

For at undersøge effekten af ​​CDF på celleoverlevelse i humane PCA-celler under hypoxiske tilstand, blev MTT-assay udført under anvendelse af humant PCa (PC-3 og LNCaP) celler. 3000 celler blev udpladet i hver brønd af 96-brønds plader og inkuberet ved standard dyrkningsbetingelser (21% O

2 og 5% CO

2) natten over. Cellerne blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af CDF (0,5 uM) og inkuberet i 8 timer under hypoxiske tilstand efterfulgt af 16 timer under normoxiske betingelse hver dag. Efter 3 dages behandling blev cellerne høstet til standard MTT-assayet, som beskrevet i vores tidligere publikationer [22]; [23]. Hvert forsøg blev udført i fire replikater og gentaget to gange uafhængigt af hinanden.

klongenicitetsassayet

Klonogen assay blev udført for at undersøge virkningen af ​​CDF på cellevækst af PCA-celler under hypoxiske tilstand, som tidligere beskrevet [ ,,,0],22]. Kort fortalt, 5 × 10

4-celler blev udpladet i en seks-brønds plade og efter 3 dages eksponering for 0,5 uM af CDF (8 h af hypoxisk tilstand og 16 timer af normoxisk betingelse hver dag), blev cellerne trypsiniseret, og 1.000 enkelt levedygtige celler blev udpladet i 100 mm petriskåle. Cellerne blev derefter inkuberet i 10 til 12 dage ved 37 ° C i en CO 5%

2/5% O

2/90% N

2 incubator. Kolonier blev farvet med 2% krystalviolet, vasket med vand og talt. Hvert forsøg blev udført i tre gentagelser og gentages to gange uafhængigt af hinanden.

Invasion Assay

in vitro

invasion assay af PCA celler blev udført under hypoxiske betingelser ved hjælp Costar Transwell 24 Tja-plader med polycarbonatmembran (Corning Incorporated, Corning, NY) som beskrevet tidligere [23]. Kort beskrevet 4 × 10

4 af cancerceller (PC-3 og LNCaP) påvirkes 3 dages inkubation under normoxiske eller hypoxisk tilstand blev podet i hver brønd på Matrigel præcoatede Transwell-plader. De nederste brønde i systemet blev fyldt med komplet medium. Efter 20 timers inkubation enten i fravær eller nærvær af CDF (0,5 uM), blev den invaderede cancerceller farvet med 4 ug /ml af calcein-AM (Invitrogen) i PBS-opløsning ved 37 ° C i 1 time, efter fabrikantens manuel. Fotografierne blev taget under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Hvert forsøg blev udført i tre gentagelser og gentages to gange uafhængigt af hinanden.

Sårheling Assay

For at undersøge effekten af ​​CDF på celle migration af PCA celler under hypoksisk tilstand, gennemførte vi sårheling assay som beskrevet tidligere [24]. Kort fortalt, når PC-3-celler blev 90-95% sammenflydende, blev såret genereret ved at ridse overfladen af ​​pladerne med en pipettespids. Cellerne blev derefter inkuberet i fravær og nærvær af CDF (0,5 uM) og blev dyrket under hypoxiske tilstand i 4 timer, efterfulgt af 16 timer af normoksiske betingelser, og derefter fotograferet med et Nikon Eclipse TS100 mikroskop som tidligere beskrevet [23] . Hvert forsøg blev udført i tre gentagelser og gentages to gange uafhængigt af hinanden.

Tube Forming Assay

For at undersøge effekten af ​​CDF på angiogenese

in vitro

i vaskulære endotelceller under hypoxisk tilstand, gennemførte vi kanaldannelse assay som tidligere beskrevet [25]; [26]. Kort fortalt, 3 × 10

4 kanin vaskulære endotelceller blev udpladet i hver brønd i Matrigel-præ-coatede 96-brønds plade i 100 pi 10% FBS-DMEM-medium, og udsat for normoxiske eller hypoxiske betingelser i 4 timer inkubation ved 37 ° C efterfulgt af 16 timer af normoxiske betingelser. Fotografiet blev taget på 4 timer og 20 timer, hhv. Hvert eksperiment blev gentaget to gange uafhængigt af hinanden.

Ekspression af VEGF og IL-6

ELISA blev udført for at undersøge virkningen af ​​CDF hypoxi-induceret ekspression af VEGF og IL-6 i PCA-celler. Kulturen medier fra PCA celler under hypoxiske eller normoksiske forhold for 16 timer blev høstet til måling af VEGF og IL-6 ved hjælp af ELISA-assay kits (R [27]. CD44 eller EpCAM mærkede prostaspheres blev fotograferet under et Nikon ESLIPSE E800 med 100x forstørrelse. Konfokal mikroskopi (Leica TCS SP5) blev gennemført i MIRL Core facilitet, Wayne State University School of Medicine. Hvert forsøg blev gentaget to gange uafhængigt af hinanden.

Forbigående og stabil transfektion af PCA celler med cDNA og miRNA

De transfektioner af cDNA og miRNA blev udført ved hjælp af ExGen 500 transfektion reagens (Fermentas, Tyskland) og DharmaFECT transfektion reagens (Dharmacon) henholdsvis efter fabrikantens manualer, som tidligere beskrevet [24]. Den stabile transfektion af cDNA’er blev udført under udvælgelsen af ​​G418-holdigt medium (Sigma) og verificeret ved Western blot-analyse, som tidligere [25] beskrevne. Hvert eksperiment blev gentaget to gange uafhængigt af hinanden.

Protein Extraction og Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført for at måle de relative niveauer af HIF-1α protein i PCA-celler under hypoxiske betingelser. Totale cellelysater af de celler udsat for 16 timers hypoxisk tilstand blev opnået ved at lysere cellerne i protein lysepuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholat, 2 mM natriumfluorid, 2 mM Na

3VO4

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og 1 × proteaseinhibitorcocktail (Roche Diagnostics, Tyskland), og Western blotting blev udført som beskrevet tidligere [24], og signalintensiteten blev målt ved anvendelse kemiluminescerende påvisningssystem (Pierce Rockford, IL). Hvert forsøg blev gentaget to gange uafhængigt af hinanden.

Real-time (RT) revers transkriptase-polymerase kædereaktion (PCR) til måling af ekspressionen af ​​mRNA og miRNA

For bestemme mRNA udtryk, to mikrogram af totale RNA’er ekstraheret fra hver prøve blev anvendt til RT-reaktionen i 20 ul reaktionsvolumen under anvendelse af en revers transkription-system (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. SYBR Green Assay kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) blev anvendt til real time PCR reaktion, under anvendelse AB StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) efter fabrikantens protokol. Sekvenser af PCR-primere blev beskrevet tidligere [23]. Data blev analyseret ved hjælp af C

t fremgangsmåde og blev normaliseret ved GAPDH-ekspression i hver prøve. For at bestemme ekspressionen af ​​miRNA i cellerne, blev TaqMan MicroRNA Assay kit (Applied Biosystems) anvendes efter fabrikantens protokol. Totalt RNA blev ekstraheret fra cellerne og 5 ng RNA blev revers transkriberet som beskrevet tidligere [28]. MiRNA primere blev opnået fra AB Systems. Real-time PCR-reaktioner blev derefter udført i et samlet volumen på reaktionsblandingen 10 pi som tidligere beskrevet [24], under anvendelse StepOnePlus Real Time PCR System (AB Systems). Data blev analyseret ved hjælp af C

t fremgangsmåde og blev normaliseret ved RNU48 ekspression i hver prøve. Hvert forsøg blev udført i tre gentagelser og gentages to gange uafhængigt af hinanden.

luciferasereportergen Assay

For at undersøge effekten af ​​CDF eller miR-21-mangel på miR-21 bindingsaktivitet til 3 ‘ -UTR i PCA-celler under hypoxiske tilstand, gennemførte vi mIR-21-medieret luciferase reportergenassay i PC-3-celler ved hjælp af mIR-21-medieret luciferasereportergen vektor (Signosis, Sunnyvale, CA), hvori mIR-21 binding til sit DNA bindingssted på luciferasegenet vektor undertrykker luciferaseaktiviteten. Kort fortalt blev 10

4 PC-3-celler podet i hver brønd af 96-brønds plader og inkuberet natten over ved standard dyrkningsbetingelser. Cellerne blev derefter transficeret med MIR-21-undertrykt luciferasereportergen vektor (Signosis, Sunnyvale, CA) ved anvendelse ExGen 500 transfektionsreagens (Fermentas, Tyskland) eller cotransficeret med luciferase vektor og anti-MIR-21 ved hjælp DharmaFECT transfektionsreagens (Dharmacon) ved at følge fabrikantens protokol, som beskrevet ovenfor. Efter natten over for transfektion blev transfektanter behandlet med CDF i yderligere 20 timer under standard dyrkningsbetingelser, og udsættes for 4 timer af hypoxisk tilstand. Endelig blev transfektanterne høstet for luciferaseaktivitet assay ved anvendelse af Luciferase Assay System (Promega) efter producentens manual. Hvert forsøg blev gentaget to gange uafhængigt af hinanden.

statistiske metoder

Sammenligninger af behandlingsresultatet blev testet for signifikant forskel ved den parrede

t

test. Statistisk signifikans blev antaget på et

P

værdi på mindre end 0,05.

Resultater

Effekt af CDF om Cell Overlevelse og Clonogenicity af PCA celler under hypoxiske Betingelse

dataene fra MTT-assay indikerer, at CDF bemærkelsesværdigt inhiberede overlevelsescelle af PC-3 og LNCaP-celler under hypoxiske betingelser i en dosisafhængig måde (figur 1A). CDF behandling faldt også clonogenicity af PC-3 og LNCaP-celler under hypoxiske betingelser (figur 1B). Disse resultater foreslog, at CDF kunne hæmme celle overlevelse og klonogenisk vækst af PCA celler under hypoxiske betingelser.

panel A, B, og C repræsenterer data for celleoverlevelse, clonogenicity, og Western blot-analyse, hhv. Søjlerne i tallene indikerer standardafvigelse for n = 4.

Effekt af CDF om HIF-1α Protein og produktioner af VEGF og IL-6 i PCA Celler under hypoxiske Betingelse

Som vist i figur 1C, CDF behandling faldt det relative niveau af HIF-1α i PC-3 og LNCaP-celler under hypoxiske tilstand. Cellerne inkuberes under hypoksiske tilstand ført til øget VEGF-produktion, sammenlignet med celler inkuberet under normoxiske betingelser (figur 2). CDF behandling bemærkelsesværdigt faldt produktionen af ​​hypoxi-induceret VEGF i PCA-celler (figur 2). HIF-1α over-udtrykkende PC-3-celler viste øget VEGF-produktion under hypoxiske tilstand sammenlignet med dens parentale PC-3-celler. CDF behandling inhiberede også hypoxi-induceret VEGF-produktion i HIF-1α over-udtrykkende PC-3-celler. Disse resultater antyder, at cellerne dyrket under hypoxiske tilstand fører til forøget IL-6-produktion, sammenlignet med celler inkuberet under normoxiske betingelser (figur 2). CDF behandling bemærkelsesværdigt faldt produktionen af ​​hypoxi-induceret IL-6 i PCA-celler (figur 2). CDF også faldet hypoxi-induceret IL-6-produktion i HIF-1α over-udtrykkende PC-3-celler (figur 2).

De konditionerede medier blev opsamlet fra celler dyrket under normoxiske og hypoxiske betingelser som beskrevet under metoderne sektion. Målingerne af VEGF og IL-6 blev udført ved ELISA. Søjlerne i tallene indikerer standardafvigelse for n = 3.

Effekt af CDF på angiogenese

in vitro

i vaskulære endotelceller under hypoxiske Betingelse

Vores resultater indikerer, at hypoxiske betingelser forøgede dannelsen rør kapacitet af vaskulære endotelceller ved 4 timer og 20 timer af inkubationer, sammenlignet med normoxisk tilstand. CDF behandling inhiberede hypoxi-induceret rør-dannelse i vaskulære endotelceller (figur 3A). For at afklare, hvorvidt CDF-medierede molekyler eller CDF selv bidrager til hæmning af dannelsen rør, indsamlet vi ikke CDF-behandlede (kontrol) og CDF-behandlet tilstand medier fra kræftceller og gennemførte røret dannelse assay under normoxisk tilstand. Vi fandt, at de vaskulære endotelceller inkuberet med kontrol betingelse medier havde forøget dannelse rør ved 4 timer og 20 timer, sammenlignet med celler inkuberet med CDF-forbehandlet tilstand medier. Tilsætning af CDF til kontrolgruppen tilstand medier inhiberede signifikant kanaldannelse, sammenlignet med cellerne inkuberet ved kontrolbetingelse medier og CDF-forbehandlet tilstand medier (figur 3B). Disse data antyder, at CDF sig selv bidrager til inhiberingen af ​​dannelsen rør

panelerne A . B, C cellemigration blev evalueret ved sårheling assay; invasion blev evalueret ved kammer invasion assay.

Effekt af CDF om Cell Migration og Invasion

in vitro

i PCA Celler under hypoxiske Betingelse

Hypoxi-eksponerede PC 3 celler havde øget kapacitet på sårheling sammenlignet med cellerne dyrket under normoxi (figur 3C). CDF behandling inhiberede sårheling kapacitet PCA-celler under hypoxiske tilstand (figur 3C og D). Som vist i figur 3D, over-ekspression af HIF-1α forøgede sårheling kapacitet PC-3-celler eksponeret for 16 timer af hypoxisk tilstand. CDF behandling inhiberede sårhelende kapacitet i begge HIF-1a-over-udtrykkende PC-3-celler under hypoxiske betingelser (figur 3D). Disse resultater er overbevisende data viser, at CDF kunne inhibere hypoxi-induceret cellemigration af PCA-celler, selv i HIF-1a-over-udtrykkende PCA-celler.

in vitro

invasion assay viser, at begge PC-3 og LNCaP-celler udsat for hypoksiske tilstand havde øget kapacitet af invasion, sammenlignet med de celler, der udsættes for normoxisk tilstand (figur 3E). CDF behandling hæmmede kapacitet hypoxi-induceret invasion af PCA celler.

Effekt af CDF om Gene Expression af CSC Markers og miRNA ekspression i PCA Celler under hypoxiske Betingelse

Data fra realtid RT-PCR-assayet indikerer, at hypoxi induceret de relative niveauer af Nanog, Oct4 og EZH2 mRNA’er samt mIR-21 og mIR-210 i PC-3 og LNCaP-celler henviser CDF faldt niveauerne af Nanog, Oct4 og EZH2 mRNA’er samt mIR-21 og mIR-210 i PCA-celler under hypoxiske tilstand (figur 4).

Real time RT-PCR blev udført som beskrevet i afsnittet Metoder. Søjlerne i tallene indikerer standardafvigelse for n = 3.

Effekt af CDF eller Anti-miR-21 på CSC Self-fornyelse Kapacitet og celleoverflademarkører CD44 og EpCAM i Human PCA celler under hypoxiske betingelse

dataene fra kuglen formation assay indikerer, at anti-mIR-21 faldt dannelsen af ​​prostaspheres af PC-3-celler (figur 5A). Disse data tyder på, at miR-21 kan spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​selvfornyelse kapacitet på CSC-lignende PCA celler. CDF behandling også decesased dannelsen af ​​prostaspheres af PCA celler under hypoxiske betingelser (figur 5A). Desuden har vi gennemført konfokal imaging mikroskopi for at vurdere ekspression af CD44 og EpCAM på området-dannende celler af PC-3 celler. Resultaterne viser, at anti-MIR-21 faldt ekspressionen af ​​CD44 og EpCAM i PC-3-sfære-dannende celler under hypoxiske tilstand, i overensstemmelse med CDF behandling (figur 5B). Disse data antyder, at CDF faldt dannelsen af ​​prostaspheres og ekspressionen af ​​CD44 og EpCAM delvis medieres ved at målrette ekspressionen af ​​MIR-21.

panel A og B repræsenterer dataene for dannelsen af ​​prostaspheres, de ekspression af CD44 og EpCAM, og produktionen af ​​VEGF og IL-6 i CSC-lignende sfære-dannende celler af PCA-celler, hhv. Kuglen formation assay blev udført for at undersøge selvfornyelse kapacitet CSCS af PCA-celler som beskrevet i afsnittet Metoder. Konfokal mikroskopi blev udført for at måle ekspressionen af ​​CSC overflademarkører CD44 og EpCAM på området-dannende celler afledt fra PCA-celler som beskrevet i afsnittet Metoder. Søjlerne i tallene indikerer standardafvigelse for n = 3.

Effekt af CDF eller Anti-miR-21 på VEGF og IL-6 Produktionen i Sphere-dannende celler af PC-3 celler under Hypoxic betingelse

Vi undersøgte effekten af ​​CDF på VEGF og IL-6 produktioner på området-dannende celler af PC-3 celler under hypoxiske tilstand ved ELISA-assay. Vi fandt at PC-3 sfære-dannende celler produceret en større mængde VEGF under hypoxiske tilstand sammenlignet med dens parentale PC-3-celler (3.172 pg /ml /10

4 PC-3 sfære-dannende celler vs 3192 pg /ml /10

6 PC-3-celler, figur 2 og 5C), hvilket antyder, at PC-3-sfære-dannende celler kan fremme angiogenese ved opregulering af ekspressionen af ​​VEGF-produktion. Vi fandt også, CDF behandling faldt hypoxi-induceret VEGF-produktion i PC-3-sfære-dannende celler, i overensstemmelse med resultaterne fra PC-3-sfære-dannende celler med betinget inhibering af MIR-21. Endvidere fandt vi, at i lighed med VEGF-produktion, Kuglen-dannende celler producerede et bemærkelsesværdigt højere mængde hypoxi-induceret IL-6, i forhold til sine parentale celler (129,3 pg /ml /10

4 PC-3 kugle-dannende celler vs 457,6 pg /ml /10

6 PC-3 celler; Figur 2 og 5C). CDF behandling eller betinget mangel på miR-21 ved sin inhibitor /siRNA faldt produktionen af ​​hypoxi-induceret IL-6 af kugle-dannende celler (Figur 5C). Vi undersøgte også, hvorvidt CDF behandling eller MIR-21-mangel kunne regulere genekspression af HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, og EMT markører i PC-3 sfære-dannende celler under hypoxiske tilstand. Vi fandt, at betinget undertrykkelse af MIR-21 resulterede i et signifikant fald i de relative mRNA-niveauer af HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, og mesenchymale markører for EMT fænotype såsom ZEB1, vimentin og Twist, og øget de relative mRNA-niveauer af epitel markør E-cadherin i PC-3-sfære-dannende celler under hypoxiske betingelser (data ikke vist). Tilsvarende CDF faldt mRNA-niveauerne af HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, og mesenchymale markører ZEB1, ZEB2, vimentin og Twist i PC-3-sfære-dannende celler under hypoxiske tilstand. Men CDF faldt også genekspressionen af ​​E-cadherin i PC-3-sfære-dannende celler under hypoxiske betingelser (data ikke vist).

Virkning af CDF på ekspressionen af ​​miRNA i PC-3 Sphere-dannende celler under hypoxiske tilstand

Vi undersøgte virkningen af ​​CDF på Let-7, mIR-21, mIR-101, og mIR-210 i PC-3-sfære-dannende celler under hypoxiske tilstand. Resultaterne viste, at CDF øgede relative miRNA niveauer af lad-7c, d, og MIR-101 og faldt det relative niveau af MIR-210 i PC-3-sfære-dannende celler under hypoxiske betingelser (figur 6A). Disse data antyder, at CDF kunne deregulere ekspressionen af ​​hypoxi-associerede miRNA i CSC-lignende celler af PCA-celler.

panel A og B repræsenterer data for miRNA i CSC-lignende sfære-dannende celler afledt af humane PCA-celler og luciferaseaktiviteter i PCA celler. Transfektion af MIR-21-medieret reportergen luciferase vektor og anti-MIR-21 blev udført i PC-3-celler, som beskrevet detaljeret i afsnittet Metoder. Luciferaseaktiviteten blev målt ved hjælp af Promega luciferase assay-system kit, ifølge producentens vejledning. Søjlerne i tallene indikerer standardafvigelse for n = 3.

Effekt af CDF behandling eller miR-21 Mangel på miR-21 Bindende aktivitet til 3′-UTR i PCA Celler under hypoxiske Betingelse som vurderet ved luciferase assay

Vi undersøgte effekten af ​​CDF behandling eller mIR-21-mangel på mIR-21 bindingsaktivitet til 3′-UTR i PCA-celler under hypoxiske tilstand ved hjælp mIR-21-medieret luciferasereportergen assay. Som vist i figur 6B, fandt vi, at hypoksi faldt luciferaseaktiviteten i PC-3-celler transficeret med MIR-21-medieret luciferase vektor, sammenlignet med de samme celler under normoxiske tilstand, hvilket antyder, at hypoksi forøgede MIR-21 bindingsaktivitet, fører til fald i luciferaseaktiviteten. Anti-MIR-21 steg luciferaseaktiviteten i PC-3-celler under hypoxiske tilstand sammenlignet med de samme celler uden behandling, hvilket antyder, at anti-MIR-21 nedsatte MIR-21 DNA-binding, hvilket fører til en stigning i luciferaseaktiviteten i PC-3-celler under hypoxiske tilstand. Tilsvarende viste CDF behandling øget luciferaseaktivitet i PC-3-celler under hypoxiske tilstand på en dosis-afhængig måde, hvilket antyder, at CDF kunne inhibere MIR-21 DNA-binding i PC-3-celler.

Diskussion

En række epidemiologiske og kliniske undersøgelser har vist, at hypoxi og hypoxi-induceret signaleringsveje er associeret med dårlig prognose for patienter diagnosticeret med faste tumorer, herunder prostatacancer (PSA). Emerging beviser også foreslå, at hypoxi øger celle migration, invasion, og angiogenese, der fører til tumor aggressive fænotyper. Her bekræfter vi, at hypoxi inducerer celle migration, invasion, og angiogenese, og øget produktion af VEGF i PCA celler. Vi bemærkede også, at hypoxi inducerer dannelsen af ​​prostaspheres i PCA celler, i overensstemmelse med øget ekspression af CSC markører gener såsom Nanog, Oct4, EZH2, CD44, og EpCAM i PCA celler. Det har vist sig, at hypoxi spiller en central rolle i reguleringen af ​​CSC egenskaber gennem HIF proteiner, og HIF nedstrøms target gener, Oct4 og Notch-1 [6]; [7]. Disse resultater tyder på, at hypoxi kan spille en central rolle i reguleringen af ​​CSC egenskaber, hvilket fører til tumor aggressive fænotype.

Nye beviser tyder på, at miRNA spiller kritiske roller i udviklingen og progressionen af ​​tumorer gennem regulering af mRNA nedbrydning eller proteintranslation medieret gennem deres binding til den 3 ‘utranslaterede region (3’-UTR) af målgenerne. Det er blevet dokumenteret, at MIR-21 betragtes som en pro-onkogen molekyle, der fremmer tumorigenese. [31]. [21].