PLoS ONE: Analyse af det humane prostata-specifikke Proteome Defineret ved Transcriptomics og antistofbaserede Profilering Identificerer TMEM79 og ACOXL som to formodede, diagnostiske markører i prostatakræft

Abstrakt

For bedre at forstå prostata funktion og sygdomme, er det vigtigt at definere og udforske de molekylære bestanddele der tilkendegiver prostata. Formålet med denne undersøgelse var at definere prostata specifikt transkriptom og proteomanalyse, i sammenligning med 26 andre humane væv. Dyb sekventering af mRNA (RNA-seq) og immunhistokemi-baserede protein profilering blev kombineret for at identificere prostataspecifikke genekspressionsmønstre og udforske væv biomarkører til potentiel klinisk anvendelse i diagnostik prostatakræft. Vi identificerede 203 gener med forhøjet ekspression i prostata, 22 som viste mere end fem gange højere ekspressionsniveauer sammenlignet med alle andre vævstyper. Ud over tidligere kendte proteiner identificeret vi to dårligt karakteriserede proteiner, TMEM79 og ACOXL, med potentiale til at skelne mellem godartede og ondartede prostata kirtler i vævsbiopsier. Som konklusion har vi anvendt et genom-dækkende analyse for at identificere prostata specifikt proteom under anvendelse transcriptomics og antistof-baserede protein profilering til at identificere gener med forhøjet ekspression i prostata. Vores data giver et udgangspunkt for yderligere funktionelle undersøgelser for at udforske den molekylære repertoire af normale og syge prostata, herunder potentielle prostatakræft markører såsom TMEM79 og ACOXL

Henvisning:. O’Hurley G, Busch C, Fagerberg L, Hallström BM, Stadler C, Tolf A, et al. (2015) Analyse af det humane prostata-specifikke Proteome Defineret ved Transcriptomics og antistofbaserede Profilering Identificerer TMEM79 og ACOXL som to formodede, diagnostiske markører i prostatakræft. PLoS ONE 10 (8): e0133449. doi: 10,1371 /journal.pone.0133449

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: April 10, 2015; Accepteret: 25 jun 2015; Udgivet: 3 August, 2015

Copyright: © 2015 O’Hurley et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af Knut og Alice Wallenbergs Stiftelse og den svenske Cancer Foundation og af Marie Curie erhvervslivet og den akademiske partnerskaber og Pathways program, FAST-PATH ( Nej. 285.910). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. OncoMark Ltd ydet støtte i form af løn til forfatteren GOH, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. OncoMark Ltd ydet støtte i form af løn til forfatteren GOH. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prostata specifikt antigen (PSA) er dukket op som en nyttig tumormarkør i onkologi og PSA-baserede screening er meget udbredt på trods af en relativ mangel på både specificitet, hvilket fører til overdiagnostik og behandling af tidlig fase prostatacancer, og følsomhed, hvilket fører til prostatakræft ikke at blive opdaget tidligt nok [1-5]. Der er således et behov for bedre markører for tidlig påvisning af prostatacancer.

PSA er en serinprotease og en af ​​tre mest udbredte proteiner udskilt fra prostatakirtlen [6]. I den maligne prostata, væv arkitektur er unormal, som letter PSA lækage til kapillærer i det stromale rum. Ikke-maligne prostata, herunder prostatitis og benign prostatahyperplasi (BPH), kan føre til forhøjet serum-PSA, begrænser specificiteten af ​​PSA elevation til påvisning af kræft [7]. Således afgøre, hvilke patienter kræver yderligere undersøgelse med transrektal ultralydsscanning (TRUS) -Guidede biopsier fortsat et stort problem.

Flere andre markører har været impliceret som potentielle biomarkører for prostatakræft, såsom alfa-methylacyl coenzym A racemase ( AMACR), som har vist sig at være signifikant opreguleret i prostatakræft og påviselig i både serum og cancervæv. Andre sådanne diagnostiske biomarkører omfatter prostata karcinom mucin-lignende antigen (PMA), GOLM1, fedtsyre syntase (FASN), TMPRSS2-ERG fusion prostatakræft antigen 3 (PCA3), KLK3, KLK2, HOXB13, GRHL2 og FOXA1 [8-12] . Men up-to-date, har ingen individuel markør bevist bedre end PSA.

Prostatakræft er diagnosticeret baseret på histopatologisk undersøgelse af flere trus-styrede prostata kerne biopsier. Identifikationen af ​​cancer i prostata er udsat for subjektivitet og fejl på grund af afhængigheden af ​​menneskelig fortolkning og at biopsier kun give en lille mængde væv, som ofte omfatter kun nogle få maligne kirtler og histologiske godartede efterligninger af kræft. Opdagelsen af ​​en specifik markør for enten prostatacancer eller godartet prostata kirtler, også kunne måles i serum ville være en fordel at undgå unødvendige invasive diagnostiske tests.

Fortolkningen af ​​kvantitative transcriptomics data baseret på mRNA sekventering af vævsprøver er en udfordring på grund af heterogenitet celletyper, der omfatter forskellige vævstyper. Her har vi analyseret gener udtrykt i normal human prostata og sammenlignet disse data med de trancriptomes af 26 andre normale humane vævstyper baseret på nyligt offentliggjorte RNA-seq data [13]. Den transcriptomics analyse blev kombineret med immunohistokemi-baserede protein profilering data fra det humane protein Atlas (www.proteinatlas.org) [14, 15] for at give et kort over genekspression på både RNA og protein niveau i prostata. Ekspressionsmønsteret for to proteiner kodet fra tidligere karakteriserede gener, TMEM79 og ACOXL, med forhøjet ekspression i prostata blev yderligere analyseret ved anvendelse af væv microarrays (TMA), herunder normale prostata og prostatakræft, at udforske deres potentielle værdi som diagnostiske biomarkører.

Materialer og metoder

vævsprøver

Frisk frosset humant væv, der repræsenterer 27 forskellige normale typer humant væv blev medtaget i RNA-seq analyse som tidligere beskrevet [13], herunder 4 prøver af prostatavæv. Morfologisk normal, ikke-kræft prostata væv blev udtaget fra prostatektomi prøvemateriale fra 4 mandlige patienter (alder 62-68 år) med lokaliseret prostatacancer.

Formalin fast, paraffin indlejrede (FFPE) menneskelige vævsprøver blev indsamlet fra den kliniske Patologisk Institut, Uppsala Universitetshospital, Uppsala, Sverige og samlet i TMAs. TMA’erne blev skabt og anvendt til proteinprofilering som tidligere beskrevet [16]. Screeningen TMA indeholdt 1 mm kerner af 46 forskellige normale væv i tre eksemplarer, herunder tre normale prostata prøver, og 216 kræft væv, der repræsenterer de 20 mest almindelige kræftformer, herunder 12 tilfælde af prostatakræft [17]. De fire validering TMAs indeholdt normale og cancerøs prostata væv; detaljerne for hver validering TMA er vist i tabel 1 og er blevet beskrevet tidligere [18, 19]. Prostata intraepithelial neoplasi blev udelukket fra dette studie.

Alle menneskelige vævsprøver anvendes til RNA-seq og screening af protein-ekspression blev anonymiseret og bruges i overensstemmelse med godkendelse og rådgivende rapport fra Uppsala Etisk Review Board (reference # 2002 -577, 2005-338 og 2007-159 (protein) og # 2011-473 (RNA)). De validering TMA kohorter blev godkendt af Den Centrale Etiske Review Board i Sverige (DNR Ö25-2006, dato 2006-06-29) og det regionale Etisk Review Board ved Lunds Universitet, Sverige (godkendelsesnummer DN. 445-07). Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke.

Transcript profilering (RNA-seq) og dataanalyse

transkriptom profilering er blevet beskrevet tidligere [13]. Kort beskrevet hæmatoxylin-eosin (HE) farves frosne snit (4 um) blev fremstillet ud fra hver prøve ved anvendelse af en kryostat og CryoJane Tape-Transfer System (Instrumedics, St. Louis, MO, USA) og gennemgået af en patolog til at sikre korrekt væv morfologi. Tre 10 um snit blev skåret fra hver frossen væv blok og homogeniseres inden ekstraktion af totalt RNA under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ved at følge producentens instruktioner. De ekstraherede RNA-prøver blev analyseret under anvendelse af enten en Agilent 2100 Bioanalyzer systemet (Agilent Biotechnologies, Palo Alto, USA) med RNA 6000 Nano Labchip Kit eller Experion automatiseret elektroforese systemet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) med standarden -sensitivity RNA chip. Kun prøver af høj kvalitet RNA (RNA Integrity Number ≥7.5) blev anvendt i den følgende fremstilling mRNA prøve til sekventering. Illumina HiSeq2000 og 2500 maskiner (Illumina, San Diego, CA, USA) blev anvendt til at udføre mRNA sekventering under anvendelse af standard Illumina RNA-seq protokol med en læse længde på 2×100 baser.

Raw læser opnået fra sekventering systemet blev trimmet for lav kvalitet ender med softwaren Sickle. En Phred kvalitet på 20 blev anvendt. Læser kortere end 54 bp efter trimningen blev kasseret. Det forarbejdede læser blev kortlagt til GRCh37 version af det humane genom med Tophat v2.0.3 [20]. Potentielle PCR dubletter blev elimineret anvende MarkDuplicates modul af Picard 1,77. At opnå kvantificering scorer for alle 20,050 humane protein-kodende gener, FPKM (fragmenter pr kilobase i exon model per million kortlagt læser) værdier blev beregnet med Manchetknapper v2.0.2 [20], som korrigerer for transkript længde og det totale antal kortlagt læser fra biblioteket for at kompensere for forskellige læste dybder til forskellige prøver. Den gennemsnitlige procentdel af succes kortlagt læser var 77%. Genet modeller fra Ensembl bygge 69 [21] blev anvendt i Manchetknapper. Foruden Manchetknapper blev HTSeq v0.5.1 køre til beregning læste tæller for hvert gen, der blev anvendt til analyser af differentielt udtrykte gener under anvendelse af DESeq pakke [22]. Alle data blev analyseret med R Statistisk Environment [23] og et netværk analyse blev udført ved anvendelse Cytoscape 3.0 [24]. For analyser, der udføres i denne undersøgelse, hvor en log2 skala af data blev brugt, pseudo-tællinger af 1 blev sat til datasættet.

Specificitet klassifikation

Den gennemsnitlige FPKM værdi i alle prøver til et bestemt væv blev anvendt til at estimere den samlede genekspression niveau. En cut-off værdi på 1 FPKM, groft svarer til et gennemsnit på 1 mRNA-molekyle per celle, blev defineret som detektionsgrænsen [25]. Hver af de 20,050 gener blev klassificeret i én ud af ni kategorier baseret på udtrykket mønster i prostata i forhold til alle andre væv (tabel 2)

Antibody validering:. SiRNA transfektion, immunfluorescens, billedbehandling og statistisk analyse

Udvidet antistof validering til der er anført på HPA-databasen (www.proteinatlas.org) for alle proteiner, blev udført for yderligere at kontrollere specificiteten af ​​de primære antistoffer mod TMEM79 (HPA055214) og ACOXL (HPA035392 ). Dette blev udført ved anvendelse af siRNA-baserede knock-down af genekspression. U-2 OS og MCF-7-celler blev anvendt til siRNA knock-down eksperimenter ACOXL og TMEM79. U-2 OS-celler blev dyrket i McCoys medier suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og MCF-7-celler i EMEM suppleret med 10% FBS, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) og 1% L-glutamin ( alle fra FisherScientific, Stockholm, Sverige).

på dagen for transfektion blev 10.000 U-2 OS-celler eller 12.000 MCF-7 celler podet i 96 brønde glasbund plader (VWR, Stockholm, Sverige) præ -belagt med fibronectin. Efter cellevedhæftning blev mediet erstattet med 100 pi Optim-MEM indeholdende 0,5 pi Lipofectamine 2000 (kat. Nr 11.668.019, Life Technologies) og 2,5 pmol af ACOXL siRNA (Lyddæmper Select Pre-designede siRNA produkt s30651, Life Technologies) eller TMEM79 siRNA (Lyddæmper Select Pre-designede siRNA produkt s228349, Life Technologies). En scrambled siRNA-sekvens (Lyddæmper Vælg Negativ kontrol nr. 1, kat. Nr 4.390.843, Life Technologies) blev anvendt som negativ kontrol og AllStar (SI04381048, Qiagen) blev anvendt som en positiv kontrol for at sikre en vellykket transfektion.

efter 72 timer af inkubation blev cellerne fikseret ved anvendelse af 4% paraformaldehyd (PFA) og permeabiliseret under anvendelse af 0,1% Triton X-100 som tidligere beskrevet [26]. Celler blev farvet med antistoffer rettet ACOXL eller TMEM79, både i en koncentration på 2 ng /ul. Celler blev også farvet med et antistof rettet mod mikrotubuli (ab7291, ABCAM) ved en koncentration på 3 ng /pl, og med det nukleare probe 4 ‘, 6-diamidini-2-phenylindol (DAPI) i en koncentration på 300 nM, til aktivere automatisk billedbehandling og kvantificering af den reducerede farvningsintensitet.

billedbehandling og analyse udlæsning af siRNA forsøgene blev udført som beskrevet tidligere [27]. Den knock-down blev målt som den relative fluorescensintensitet (RFI) sammenlignet med den negative kontrol. Dataene blev grafisk præsenteret i box-plots og en Mann-Whitney-test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​medianen RFI af tavshed cellepopulation sammenlignet med RFI af den tilsvarende negative kontrol.

Antistof-baserede væv profilering

TMAs blev skåret i 4 mikrometer tykke snit og anvendes til immunhistokemisk farvning, som tidligere beskrevet [16]. De immunhistokemisk farvede og monterede dias blev scannet ved hjælp af en Aperio ScanScope XT Slide Scanner (Aperio Technologies, Vista, CA) til generering af høj opløsning digitale hele lysbilederne, efterfulgt af anmærkning af certificerede patologer. Kort fortalt blev den manuelle score på IHC-baserede protein-ekspression for alle proteiner screenet bestemmes som den del af positive celler defineret i forskellige væv: 0 = 0-1%, 1 = 2-25%, 2 = 26-75%, 3 75% og intensiteten af ​​immunoreaktivitet: 0 = negativ, 1 = svag, 2 = moderat og 3 = stærk farvning. Alt annotation og immunhistokemiske data til screening TMA sammen med valideringsdata for alle primære antistoffer er offentligt tilgængelige i det humane protein Atlas (www.proteinatlas.org) [28]. Primære antistoffer, der anvendes til immunfarvning af validering TMAs inkluderet HPA055214 (fortynding 1: 250) til påvisning af transmembrane protein 79 Tmem 79) og HPA035392 til påvisning af Acyl-CoA oxidase-lignende protein (ACOXL) (fortynding 1:. 1000)

Scoring eller TMEM79 og ACOXL proteinekspression

immunoreaktiviteten af ​​TMEM79 blev vurderet i membranen og cytoplasma, og ACOXL i cytoplasmaet af epitelceller i prostata. Antistoffer svarende til begge proteiner var immunhistokemisk farvede og resultatet blev analyseret på alle validering TMAs. Scoring blev udført af to uafhængige observatører (GOH, CB)

Med henblik på statistisk analyse, blev den immunhistokemisk farvning mønster af begge antistoffer bedømmes efter følgende skala:. 0, fravær af reaktivitet, 1, svag men klart kan spores reaktivitet i 30% af epitelceller, 2, moderat reaktivitet i 30% af epitelceller og 3, stærk reaktivitet i 30% af epitelceller

Statistisk analyse

For statistisk analyse af TMEM79 og ACOXL udtryk versus histopatologiske træk, blev farvningen intensiteten af ​​epitelceller opdelt i to grupper:. Lav ekspression (immunhistokemisk score på 0 eller 1) herunder tilfælde med negative eller svag farvning, og høj ekspression (immunhistokemisk score på 2 eller 3) herunder tilfælde med moderat eller stærk farvning. Pearson Chi-kvadrat test og Spearman og Pearson Korrelationsfaktorer tests blev udført for at teste forbindelsen mellem proteinekspression og histopatologiske træk på to-vejs kontingenstabeller. Diagnostiske kriterier for ydeevne blev testet ved at generere ROC kurver. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og multivariate Cox regressionsanalyse blev også udført på en undergruppe af patienter, hvor biokemisk tilbagefald (BCR) data var tilgængelige (N = 148), at analysere associationen mellem BCR og proteinekspression, serum PSA værdi pre-prostatektomi og Gleason score. Alle beregninger blev udført med IBM SPSS 20 til Windows (SPSS, New York, NY, USA).

Resultater

Den transkriptom analyse af prostata væv

De transcriptomes af fire prostata prøver blev kvantificeret ved RNA-seq og normaliseret mRNA-niveauer, beregnet som FPKM værdier [13], blev bestemt for hver prøve. I alt 14,040 gener blev detekteret i prostata, ved anvendelse af en cutoff på gennemsnitlig ekspression værdi 1 FPKM. Således blev omkring 70% af alle formodede proteinkodende gener (n = 20,050) påvist i prostata. Fordelingen af ​​FPKM værdier (mRNA ekspression niveauer) varierede fra 0 FPKM op til 8238, hvilket giver et dynamisk område på 10

4

mellem de højeste og laveste udtrykte gener. De 30 gener med de højeste niveauer af udtryk i prostata, er opført i S1 tabel. Et flertal af disse gener koder for proteiner med “hus-føring” -funktioner udtrykkes i alle analyserede væv.

Den biologiske variation mellem de fire individuelle prostata prøverne blev analyseret ved at sammenligne ekspressionsniveauerne af alle protein-kodende gener i parvise scatterplots. Korrelationen samlede var høj med Spearman koefficienter spænder fra 0,98 (Fig 1A) til 0,91, med en gennemsnitlig korrelationskoefficient på 0,96 for alle fire prostataprøver. Disse resultater viser lav inter-individuel variation på tværs af hele genomet udtryk mønster og demonstrere høj teknisk reproducerbarhed mellem prostata prøver. Som forventet blev der observeret en højere grad af variation, når lignende sammenligninger blev udført mellem prostata og andre vævstyper. Den laveste korrelation blev noteret mellem prostata og testikler med en Spearman koefficient på 0,72 (Fig 1B), hvorimod vævet med den højeste lighed med prostata var endometrium med en Spearman koefficient på 0,92 (Fig 1C).

Genekspression scatterplots viser alle FPKM værdier og de parvise Spearman og Pearson korrelationskoefficienter mellem: (A) de to prostata prøver med højeste korrelationskoefficient, (B) den laveste korrelation til enhver anden vævstype (prostata vs. testesprøver), og (C) den højeste korrelation til andre vævstype (prostata vs. endometrium). (D) PieChart viser fordelingen af ​​den del af alle menneskelige protein-kodende gener i hver af kategorierne, baseret på udskrift ekspressionsniveauer i prostata sammenlignet med alle andre væv.

Klassificering af generne udtrykkes i prostata

de transcriptomics data fra de 27 væv muligt for os at klassificere alle de 20,050 protein-kodende gener i fire hovedkategorier, først baseret på deres ekspressionsniveauer i prostata (figur 1D). Disse store kategorier inkluderet i) gener, der ikke blev registreret i prostata (30%), ii) gener, som viste en blandet ekspressionsmønster, der udtrykkes i flere, men ikke i alle vævstyper (23%), iii) gener, som blev udtrykt i alle væv og således karakteriseres som “hus-føring” gener (46%) og iv) gener med et forhøjet niveau af ekspression i prostata sammenlignet med andre vævstyper (1%). Derefter de 203 gener i kategori iv, som viste en forhøjet ekspressionsmønster i prostata, blev yderligere opdelt i fire andre underkategorier afhængigt grad af vævsspecificitet.

Seks gener blev defineret som stærkt beriget i prostata (tabel 3 ), karakteriseret som det højeste niveau af vævsspecificitet med mindst 50 gange højere FPKM niveau i prostata sammenlignet med andre vævstype. Seksten gener blev defineret som moderat beriget i prostata (tabel 3), med mindst 5 gange højere FPKM niveau i prostata sammenlignet med alle andre væv; 85 gener blev defineret som gruppe beriget (S2 tabel), med 5 gange højere gennemsnitlig FPKM niveau i en gruppe med 2-7 væv, herunder prostata sammenlignet med alle andre væv; og 96 gener blev prostata forstærket (S3 tabel), defineret som havende en 5 gange højere FPKM niveau i prostata sammenlignet med den gennemsnitlige FPKM værdien af ​​alle 27 væv. To velundersøgte gener i prostata, SLC45A3 og MSMB, blev identificeret i denne kategori.

Et netværk plot af de gruppevise beriget gener i prostata er præsenteret i figur 2, som viser antallet af gener delt mellem en særlig gruppe af væv (op til fire forskellige væv), såvel som antallet af højt og moderat væv beriget gener i prostata. Ud af de 27 vævstyper analyserede, 22 vævstyper havde fælles gruppe berigede gener med prostata. Vævstypen med de fleste gruppe beriget gener til fælles med prostata er spiserøret (n = 15), efterfulgt af testis (n = 6), hjerne og hjerte (n = 5). De delte gener mellem spiserøret og prostata er domineret af gener udtrykt i forskellige muskelceller, indeholdt i væggen af ​​spiserøret og integreret i prostata.

Grupper af udtrykte gener er repræsenteret som Blue Circle knudepunkter og forbundet med den respektive berigede væv repræsenteret grå cirkler. Størrelserne af knudepunkter er relateret til antallet af berigede gener. Den lyseblå cirkel viser det samlede antal højt og moderat væv beriget gener. Netværket repræsenterer en oversigt over de grupperede berigede gener med maksimalt 4 væv kombineres.

Antistof baseret profilering af prostata specifikke gener

De gener med forhøjet udtryk i prostata (n = 203) blev evalueret ved brug af online humant protein Atlas database (HPA, www.proteinatlas.org) for at sammenligne de kvantitative RNA-seq data med rumlige udtryk data af tilsvarende protein niveauer. For yderligere at undersøge protein ekspressionsmønstre i prostata af dette sæt af proteiner, som omfatter både tidligere velundersøgte samt ukarakteriserede proteiner, blev immunhistokemisk farvning visuelt evalueret med hensyn til benign prostata specificitet og cellulære fordeling. Eksempler på ekspressionsmønstre i normal prostata af proteiner med forhøjet ekspression i prostata er vist i fig 3.

Eksempler på ekspression i benigne kirtelceller er vist for et undersæt af proteiner, der svarer til gener med forhøjet ekspression i prostata. Scale, 100 um.

differentielt udtrykte proteiner i benigne og maligne prostata væv

transmembrane protein 79 (TMEM79).

Differential proteinekspression i godartet prostata væv versus prostatakræft væv blev næste evalueret for ukarakteriserede gener, hvortil validerede antistoffer rettet mod tilsvarende proteiner var til rådighed.

TMEM79

, med dokumentation for eksistens kun på udskrift niveau ifølge UniProt [29], blev identificeret som en “gruppe beriget” gen med en FPKM værdi på 39 i prostata. TMEM79 genekspression blev også observeret i spiserøret (54 FPKM) og huden (65 FPKM) i højere niveauer end i prostata (se S2 tabel). Men på proteinniveauet viste TMEM79, en mere distinkt immunoreaktivitet i normale prostata kirtler sammenlignet med ekspressionsmønsteret i pladeepitel i huden, spiserøret, mundslimhinde, vagina og livmoderhalsen. Stærk membranøs immunfarvning blev observeret i 3/3 tilfælde godartede prostata væv, mens der ikke var nogen tydelig membranøs farvning i tumorceller fra 12/12 tilfælde af prostatakræft (billeder af immunfarvet normale og kræft prostata væv findes på www.proteinatlas.org og i figur 4).

(a) TMEM79 membranøs ekspression i en godartet kirtel med manglende TMEM79 ekspression i omgivende tumor. (B) Dobbelt IHC-farvning af TMEM79 (rød) og TP63 (blå basal cellefarvning) i en godartet kirtel. (C) En mangel på TMEM79 proteinekspression i prostatacancer (Gleason grad 3). (D) Manglende TMEM79 proteinekspression i prostata metastatisk tumor (knoglemetastaser). Scale, 100 um.

For at validere de første protein screening resultater observeret for TMEM79 i prostata, blev IHC udført på fire uafhængige prostatakræft kohorter. Væv fra 333 sager var til rådighed til analyse (156 godartede tilfælde, 162 primære prostatakræft tilfælde og 15 metastatisk prostatacancer tilfælde). Ca. 81% (127/156) af godartede prostata vævsprøver viste en positiv membranøs ekspression af TMEM79 og ca. 84% (148/156) af prostatakræft vævsprøver udtrykte ikke TMEM79 (tabel 4). Således TMEM79 viste en høj følsomhed (81%) og specificitet (84%) til at skelne benigne prostata kirtler fra prostatacancer. Til statistisk vurdering af hypotesen om, at positive TMEM79 udtryk omvendt er associeret til prostatakræft, blev en to-vejs kontingenstabel oprettet (tabel 4), som er klassificeret test variabler i kategorier; godartet væv versus tumor (Gleason grad 2-5 og metastase). Til statistisk vurdering af de diagnostiske kriterier for ydeevne af TMEM79 en ROC-kurve blev genereret (S1 Fig), som producerede en AUC-værdi på 0,825 og en betydelig

P-værdi

af 0.000 indikerer, at TMEM79 er en god diagnostisk test til at skelne mellem godartet kirtler og tumor i prostata. Ingen sammenhæng mellem BCR, serum PSA værdi pre-prostatektomi, Gleason score og TMEM79 ekspression blev observeret af enten Kaplan-Meier overlevelsesanalyse eller multivariat Cox regressionsanalyse på den delmængde af 148 patienter analyseret.

acyl- CoA-oxidase-lignende protein (ACOXL).

Svarende til TMEM79 blev ACOXL identificeret som en ny væv markør af godartet prostata efter screening af proteinekspression i det humane protein Atlas. I modsætning til den membranøs ekspression af TMEM79 viste ACOXL en stærk granulær, cytoplasmatisk ekspressionsmønster i benign prostata kirtler.

ACOXL

blev identificeret som en “gruppe beriget” gen også med en FPKM værdi af 3 i prostata væv. Andre væv, der blev klassificeret som “gruppe beriget” til ACOXL genet var lunge (15 FPKM), urinblære (13 FPKM) og testikel (4 FPKM). Immunfarvning af ACOXL protein viste en stærk granulær, cytoplasmatisk farvning også i bronkier og æggelederen samt en svagere og diffus farvning mønster i lunge, hud, galdeblæren, spytkirtel, skjoldbruskkirtel, binyre, vagina og hjernen.

3/3 tilfælde godartede prostata væv viste en positiv farvning for ACOXL ekspression og ingen farvning blev observeret i 8/12 prostatakræft (se fig 5 og www.proteinatlas.org for billeder af immunfarvet normal og cancerøs prostata).

(a) Granular, cytoplasmatisk ekspression af ACOXL i en godartet prostatahyperplasi. (B) Manglende ACOXL proteinekspression i prostatacancer (Gleason grad 3). (C) En mangel på ACOXL proteinekspression i prostata metastatisk tumor (lymfeknudemetastase). (D) Granular, cytoplamic ekspression af ACOXL i en godartet kirtel med manglende TMEM79 ekspression i omgivende tumor. Scale, 100 um.

IHC blev yderligere udført på de fire uafhængige prostatakræft kohorter. Ca. 86% (132/154) godartede prostata vævsprøver havde positive cytoplasmatisk ACOXL udtryk og ca. 72% (129/179) prostatakræft vævsprøver ikke udtrykke ACOXL, hvilket tyder på en høj specificitet og følsomhed også ACOXL at identificere godartede prostata kirtler.

En lignende kontingenstabel og statistiske analyser, som blev gjort for TMEM79 blev udført på de ACOXL data (tabel 5). Både Pearson og Spearman korrelationer viste også, at der er en moderat omvendt forhold mellem den membranøs ekspression af TMEM79 og prostatacancer. Adskillelse af tumor kategori i Gleason kvaliteter og metastatiske tumorer viste en tendens til reduceret ACOXL udtryk i mere avancerede og aggressive tumorer. Ingen sammenhæng mellem BCR og ACOXL udtryk i prostatakræft væv blev observeret. Til statistisk vurdering af de diagnostiske kriterier for ydeevne af ACOXL en ROC-kurve blev genereret (S1 Fig), som producerede en AUC-værdi på 0,788 og en betydelig

P-værdi

af 0.000 indikerer, at ACOXL er en god diagnostisk test til at skelne mellem godartet kirtler og tumor i prostata. Ingen sammenhæng mellem BCR, serum PSA værdi pre-prostatektomi, Gleason score og ACOXL ekspression blev observeret af enten Kaplan-Meier overlevelsesanalyse eller multivariat Cox regressionsanalyse på den delmængde af 148 patienter analyseret.

Antibody validering til Kanin Polyklonalt anti-TMEM79 (HPA 055.214) og kanin Polyklonalt anti-ACOXL (HPA035392)

for at vurdere specificiteten af ​​de primære antistoffer rettet mod ACOXL (HPA035392) og TMEM79 (HPA055214), målet proteiner blev slået ned hjælp siRNA i U-2 OS og MCF-7-celler, og analyseret under anvendelse immunofluorescens (S2 fig). Den immunfluorescensfarvning af ACOXL viste en overvejende cytoplasmatisk farvningsmønster, der blev reduceret betydeligt efter silencing af det tilsvarende transkript i både U-2 OS og MCF-7-celler, hvilket indikerer en specifik binding af ACOXL antistof til det tilsigtede mål protein med en RFI af 58 og 70% (S2 fig).

i TMEM79, blev et signifikant fald i farvningsintensitet observeret i begge cellelinier (RFI på 74 og 70% for U-2 OS og MCF-7), også indikerer en specifik binding af antistoffet til TMEM79 protein (S2 fig). Foruden farvning i cellemembranen, som set med IHC blev immunfluorescensfarvning fundet i nucleoli. Yderligere billedanalyse af den nukleare farvningsintensitet, viste et lille fald i de tavse celler sammenlignet med kontrollerne (data ikke vist). Men dette fald var ikke signifikant.

Diskussion

Nuværende kliniske biomarkører for prostatakræft mangler specificitet og sensitivitet til pålideligt skelne aggressiv versus ikke-aggressiv prostatakræft [2-5]. Således afgøre, hvilke patienter kræver behandling og lagdeling af patienter, der nyder godt aggressive behandlingsstrategier fortsat en diagnostisk og klinisk dilemma.

Mens store fremskridt inden proteomisk og metabolomiske forskning er blevet set i det seneste årti producerer potentielle biomarkører for kræft de fleste har undladt at erstatte eksisterende markører på grund af manglende merværdi [30]. En konkret metode til at opdage og identificere specifikke biomarkører er at søge efter proteiner, som specifikt udtrykkes i vævet af interesse forud for søgningen efter sådanne diskriminerer proteiner i blodet eller urinen [31].

I modsætning til andre tidligere offentliggjorte væv specifikke udtryk undersøgelser, vi kombinerede en tilstand af RNA-seq datasæt kunst beskriver prostata specifikt transkriptom med tilsvarende

in situ

proteinekspression i godartet prostata. Vores RNA-seq analyse identificeret 6 meget beriget gener i prostata, 16 moderat berigede gener, 85 gruppe beriget gener og 96 prostata forbedret gener.