PLoS ONE: Udvikling af et innovativt 3D Cell Culture System til Study Tumor – Stroma Interaktioner i ikke-småcellet lungekræft celler

Abstrakt

Introduktion

Vi beskriver en ny 3D co-kultur model ved hjælp af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer i kombination med lungefibroblaster. Denne model giver mulighed for undersøgelse af tumor-stroma interaktioner og omhandler vigtigheden af ​​at have en mere in vivo som cellekultur model.

Metoder

Automation-kompatibel multi-godt hængende drop mikrotiterplader blev brugt til fremstilling af 3D mono- og co-kulturer. I disse hængende falder to NSCLC cellelinjer A549 og Colo699 blev dyrket enten alene eller co-dyrket med lungefibroblaster. Levedygtigheden af ​​tumor sfæroider blev bekræftet efter fem og ti dage ved hjælp af Annexin V /propidiumiodidfarvning til flow-cytometri. Tumor fibroblast sfæroid dannelse blev karakteriseret ved scanningselektronmikroskop (SEM), semi-tynde snit, fluorescensmikroskop og immunhistokemi (IHC). Foruden konventionel histologi, protein ekspression af E-cadherin vimentin, Ki67, fibronectin, cytokeratin 7 og α-glatmuskelactin (α-SMA) blev undersøgt ved IHC.

Resultater Salg

Lavere levedygtighed blev observeret i A549 monokulturer i forhold til co-kulturer, mens Colo699 monokulturer viste bedre levedygtighed i forhold til co-kulturer. Ki67 udtryk varierede betydeligt mellem mono- og co-kulturer i begge tumorcellelinier. En stigning på vimentin og faldt E-cadherinekspression kunne påvises i løbet af dyrkningen tyder en overgang til en mere mesenchymal fænotype. Endvidere viste fibroblast cellelinje et udtryk for α-SMA kun i co-kultur med cancercellelinie A549, og derved indikerer en mesenchymal til mesenchymal skift til en endnu mere myofibroblastdifferentiering fænotype.

Konklusion

Vi viser at vores fremgangsmåde er et lovende redskab til generering af tumor sfæroid co-kulturer. Desuden er disse sfæroider tillader undersøgelse af tumor-stroma interaktioner og en bedre afspejling af in vivo betingelser for kræftceller i deres mikromiljø. Vores metode rummer potentiale til at bidrage til udviklingen af ​​anti-cancer midler og støtte søgningen efter biomarkører

Henvisning:. Amann A, Zwierzina M, Gamerith G, Bitsche M, Huber JM, Vogel GF, et al. (2014) Udvikling af et innovativt 3D Cell Culture System til Study Tumor – Stroma Interaktioner i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 9 (3): e92511. doi: 10,1371 /journal.pone.0092511

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: Juni 3, 2013; Accepteret: 24. februar, 2014 Udgivet: Marts 24, 2014

Copyright: © 2014 Amann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret ved hjælp af en Ph.D tilskud på den østrigske Society Hæmatologisk og onkologi (OeGHO) og yderligere økonomisk støtte fra Verein für Tumorfoschung. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Med hensyn Insphero (J. Kelm) og affilation til forfatternes arbejde: Denne forfatteren har bidraget med sin lange erfaring i 3D cellekultur til denne artikel. Endvidere blev forfatterne støttet af selskabet i form af 3D cellekultur plader til deres eksperimenter. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

På grund af den stigende forståelse af de mekanismer der er relevante for tilblivelsen af ​​kræft, er vi oplever en overgang fra sygdom til at målrette-orienteret terapi. Som en konsekvens, fremtiden for molekylær målrettet behandling af kræft ligger i at identificere undergrupper af patienter, der nyder godt af særlige behandlinger, der ramte specifikke strukturer udtrykt af den maligne celle. En væsentlig forhindring for udviklingen af ​​disse individualiserede terapeutiske regimener, er imidlertid den begrænsede tilgængelighed af prædiktive in vitro-modeller. Den afgørende udfordring er at udvikle cellekultur modeller bedre afspejler in vivo forhold og derved understøtte undersøgelse af prædiktive biomarkører, der har potentiale til at øge værdien af ​​kræft medicin og mindske størrelse, omkostninger og fejlrater af kliniske forsøg.

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er en af ​​de førende årsager til kræftdødsfald i mandlige og kvindelige patienter i hele verden.

Kun 15% -20% af dem er diagnosticeret på et tidligt stadium [1] . Prognosen er stadig fattige med en 5-års overlevelse i intervallet fra ca. 60% for fase I til mindre end 5% for fase IV tumorer [2].

Patienter diagnosticeret med lokalt fremskreden sygdom kræver multimodalitet behandling for at opnå lang -term remission eller endda kurere mens patienter med metastatisk sygdom modtage platinbaseret kemoterapi, enten alene eller i kombination med EGFR eller alkaliske hæmmere [3] -. [5]

Talrige andre molekylære målrettede agenter er blevet afprøvet i kliniske forsøg, men undlod at vise en fordel for patienter med hensyn progressionsfri overlevelse og samlet overlevelse [6]. Flere af disse forsøg har til formål at definere biomarkører i et prospektivt eller retrospektivt måde men kun et meget begrænset antal er blevet identificeret [7], [8].

Indtil videre cellebaserede assays at udforske cellebiologi og drug effektivitet sigte på voksende celler på todimensionale plastoverflader eller i enkelt cellesuspension [4]. Biologi celler, men bliver dybt påvirket af deres mikro-miljø kræver cellebaserede assays, der afspejler virkningerne af faktorer såsom den ekstracellulære matrix (ECM), celle-celle kontakter, celle-matrix interaktioner, cellepolaritet og ilt profiler [ ,,,0],5] – [8].

Konventionelle todimensionale (2D) cellekultursystemer dyrket på plast overflader har store begrænsninger. For eksempel kræver de høje ikke-fysiologiske koncentrationer føtalt kalveserum (FCS) og genfodring ved at ændre medium hver 2-3 dage. I modsætning til dette, 3D teknikker undgå plastoverflader tillader celler at danne deres ECM og kræver betydeligt reduceret FCS-koncentrationer. Ikke kun cellemorfologi men også lægemiddelfølsomhed af cancerceller i 2D systemer er anderledes i forhold til i 3D cellekulturer [9], [15]. Celler dyrket på plastoverflader normalt udviser en øget følsomhed over for cytotoksiske lægemidler, mens forbindelser målrettet celle – celle sammenvoksninger, celle modning, epitelial-mesenkymale overgang (EMT) og stemness funktioner ofte vise en reduceret effekt i 3D cellekultur. Således 3D cellekultur modeller afspejler in vivo tumorvækst mere pålideligt og kan give bedre læse outs for test af lægemidler [9], [15], [10].

De fleste 3D-systemer bruger celle sfæroide aggregater og stillads kultur systemer . Disse systemer understøtter 3D cellevækst ved kunstigt fremstillede ekstracellulære homologe (fx collagen, matrigel, stilladser) letter celleadhæsion og aggregering. Andre 3D systemer bruger flydende overlay teknologier, fiber meshwork lavet af biokompatible polymerer, faste eller porøse perler eller ekstracellulære matricer og deres erstatninger og kræver tilsætning af kunstigt fremstillede kosttilskud for at opnå 3D voksende cellekulturer [16] -. [19]

hængende drop teknik er en veletableret cellekultur metode til at danne kugleformede microtissues fra udødeliggjort og primære cellelinjer [20] – [22]. I modsætning til de fleste flydende overlay teknologier, hængende dråbe fremgangsmåde tillader præcis kontrol over den oprindelige celle præparat i hver microtissue [23], [24]. For at generere multi-celle typen co-kultur microtissues hverken yderligere tillæg eller kunstige stilladser efterligner ekstracellulære matrix komponenter (f.eks kollagen matrigel) skal udfyldes.

Baseret på en automatisering og high-throughput kompatibel hængende drop teknologi vi etableret en organotypisk samdyrkning modeller sammensat af to forskellige ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer i kombination med lungefibroblaster. Denne metode gør det muligt ikke blot undersøgelse af tumor-stroma interaktioner og repræsenterer en mere in vivo som 3D cellekultur-model til at studere medicin tumor interaktioner, men kan også blive implementeret i fremtidige lægemiddelforskning kampagner.

Materialer og metoder

Cell kultur

NSCLC cellelinjer A549 og Colo699 (DSMZ, ACC107, ACC196) og lungerne fibroblast cellelinje SV-80 (CLS, 300.345) blev anvendt til vores eksperimenter. For 2D kultur, cellelinier blev dyrket som monolag i DMEM low glucose (PAA, Pasching, Østrig) suppleret med 10% FCS (Sigma-Aldrich, München, Lot 010M3396) og 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin opløsning, 2 mM L-glutamin (PAA). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2-holdige atmosfære.

3D cellekultur

Til fremstilling af 3D mono- og co-kulturer GravityPLUS ™ microtissue dyrkningssystem (InSphero AG, Zurich, Schweiz) blev anvendt. Pladen består af en ramme med 8 × 12 brønds-skær og en perifer kanal fyldt med 2-3 ml sterilt vand til tilvejebringelse af en fugtighed barriere, der reducerer fordampning af medium fra dråberne. Denne ramme er placeret på en bottom-bakke, som er fyldt med 5 ml 0,2 x phosphatbufret saltvand (PBS) (PAA) med 0,1% Triton X-100 (Sigma), igen for at reducere fordampningen fra de små dråber. Brønden er opdelt i tre elementer, (i) indløbs- hvor pipettespidserne placeres direkte på overfladen af ​​brønden, (ii) dyrkningssektion og (iii) en mikrokanal forbinder indløbet og dyrkningssektion. Hver brønd er fjederbelastet for at kompensere for eventuelle mindre variationer i tip højder af 96-brønds pipette hoveder.

Efter cellerne var blevet dyrket subconfluently i cellekultur plader (Falcon) blev de podet i hængningen dråber. Derefter blev cellerne vasket en gang med PBS og fordøjet med 1 × Accutase (PAA) i ti minutter ved 37 ° C. Derefter blev fordøjelse stoppet og celler vasket en gang med 20 ml cellekulturmedium. Derefter blev celler talt og podet i 40 pi dråber i forskellige celletal (monokulturer: SV-80 og A549: 2500 celler /40 pi; Colo699: 1250 celler /40 pi; co-kulturer: carcinoma celle: fibroblast forholdet 01:02 /40 pi). Mediumudskiftning blev udført hver fjerde dag, og sfæroiderne blev høstet efter fem og ti dage ved at indlæse 100 pi PBS (PAA) onto mikrokapillærer at skylle sfæroiderne. De faldende dråber indeholdende sfæroiderne blev derefter opsamlet med en 96-brønds U-bundplade (Falcon), som er placeret under mikrokapillær plade.

CFSE farvning af fibroblaster.

I den fluorescerende mærkning af fibroblaster den CellTrace ™ CFSE Cell Proliferation Kit (Molecular Probes, Invitrogen) blev anvendt. Fibroblaster blev opløst og justeret til 1 x 106 i 1 ml PBS /0,1% bovint serumalbumin (BSA) .CFSE opløsning blev tilsat til opnåelse af en endelig bearbejdning koncentration på 10 uM. Celler blev derefter inkuberet i 10 minutter ved 37 ° C. Bagefter blev farvningen standset med fem volumener iskold celledyrkningsmedium og inkuberes i 5 minutter på is. Derefter blev cellerne vasket tre gange med cellekulturmedium. Mærkede fibroblaster blev nu podet som co-kulturer med carcinomaceller som beskrevet i cellekultur sektion 3D.

Flow-cytometri

Otte microtissues, høstet i plader med 96 brønde blev overført til 5 ml FACS-rør (Falcon) og vasket en gang med 2 ml PBS. Bagefter blev microtissues solubiliseret i enkelt cellesuspension ved tilsætning 300 pi Accumax (Miltenyi Biotech) pr microtissue inkubere dem i 20 minutter ved 37 ° C. Efter ti minutter microtissues blev blandet og pipetteret op og ned for at opnå en homogen opløsning. Denne procedure blev gentaget efter 20 minutters inkubation. Nu spaltningen blev standset med 2 ml komplet celledyrkningsmedium, hvorefter cellerne blev centrifugeret ved 300 g i ti minutter og vasket to gange med 0,5% BSA /PBS. Bagefter blev cellerne farvet med 4 pi propidiumiodid (PI) farvningsopløsning og 4 pi Annexin V APC. Farvning blev udført i 100 pi Annexin bindingspuffer taget fra Annexin V Apoptose Detektion Kit I (Becton Dickinson) i 15 minutter. Endelig blev cellerne analyseret på en BD FACS Calibur straks. Hver data måling blev foretaget op fra otte poolede microtissues, at gennemføre hele proceduren selvstændigt tre gange.

beregning Volumen af ​​microtissues

Seks microtissues af mono- og co-kulturer blev evalueret af en inverteret lys mikroskop (Motic ae31) fra dag ét til ti. Efter fem, syv og ti dage blev to diametre (d) på hver microtissue målt og volumenet blev beregnet ved formlen V = 4/3 * Π * r

3, hvor r = ½ * √ d1 * d2 [ ,,,0],25]. Volumenmåling blev gentaget tre gange. Derefter gennemsnit og standardafvigelse blev beregnet og statistisk signifikans testet med t-test i Microsoft Excel.

immunhistokemisk analyser

Prøveforberedelse.

Microtissues blev skyllet i PBS og derefter straks fikseret ved nedsænkning i koldt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, i fire timer ved stuetemperatur. Microtissues blev derefter skyllet i PBS igen og indlejret i 2% agarose (Invitrogen). Overskydende agarose blev fjernet med en skalpel, og agarose blokke med de microtissues blev dehydreret i graduerede alkoholer og indlejret i paraffinvoks (Paraplast regelmæssig, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) A microM ERGO Stjerne rotationsmikrotom (uM, Walldorf, Tyskland) blev anvendt til at tage serielle sektioner af 4 um tykkelse. En tre til fire serier af paraffinized snit blev derefter monteret i en bugtet mønster på SuperFrost Plus objektglas (Menzel-Glaser, Braunschweig, Tyskland) og tørret natten over, derefter bagt ved 60 ° C i en time for at klæbe sektionerne fast til objektglassene. For cyto-arkitektonisk orientering, hver tiende dias var hæmatoxylin /eosin farves (HE) ved hjælp af en Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer (Histocom Wien, Østrig).

antisera.

værter, fortyndinger , inkubationstider og kilder til primære antistoffer samt varmeinduceret epitopgenfinding (HIER) er angivet i tabel 1.

Immuncytokemi

Immuncytokemi blev udført på 4 um sektioner af paraffinindstøbte microtissues i en Ventana Roche Discovery Immunostainer (Mannheim, Tyskland) i henhold til opdagelse forskning standardprocedure DAB-MAP. Hvis det er nødvendigt, blev antigen-genvinding udløses af varme-induceret demaskering af epitoperne mens objektglassene blev nedsænket i overensstemmelse med producentens instruktioner (korte eller standard for forskellige inkubationstider) i EDTA-buffer (Cell Conditioning Solution CC1, Ventana). Efter inkubering af sektionerne med de primære antistoffer (listet i tabel 1.) ved 37 ° C, et biotinyleret immunglobulin cocktail af gede-anti-muse-IgG, ged anti-mus IgM, ged anti-kanin IgG og protein blok (Discovery Universal Antibody , Ventana) blev påført i 30 minutter ved stuetemperatur. Påvisningen blev opnået under anvendelse af DAB-MAP Detection Kit (Ventana) i overensstemmelse med diaminobenzidin (DAB) udvikling metode. Snit blev endelig modfarvet med hematoxylin (Ventana) i fire minutter. Efterfølgende sektioner var manuelt dehydreret i nedgraderet alkohol serie, ryddet i xylen og dække gled permanent med Entellan (Merck, Darmstadt, Tyskland).

Digitale billeder af HE- og immunfarvet slides blev erhvervet i AxioVision mikroskop software knyttet til en AxioCam HRc farvekamera og en Axioplan 2-mikroskop (Zeiss, Jena, Tyskland).

Ki67 positivitet blev bestemt ved tælling Ki67 positive og negative cellekerner i tre forskellige sfæroider af A540 og Colo699 i mono- og co- kulturer repræsentativt. Derefter blev andelen af ​​positive cellekerner til helcelle nummer beregnes. Middelværdi og standardafvigelse og statistisk signifikans blev beregnet som beskrevet før.

Fluorescens mikroskop

Microtissues i mono- og co-kulturer blev høstet som beskrevet ovenfor og vasket en gang med PBS. Bagefter blev tumor microtissues fikseret med 4% PFA i to timer ved 4 ° C og vasket tre gange med PBS. Nu blev de blokeret ved inkubering med PBS indeholdende 2% BSA (Sigma) /0,3% Triton X-100 (Roche) i en time ved stuetemperatur. Microtissues blev derefter inkuberet 40 minutter med 50 pg /ml phalloidin Atto 633 (Sigma) ved stuetemperatur i mørke. Derefter blev de vasket igen fem gange med PBS og blev derefter inkuberet fem minutter med 1,5 ug /ml DAPI (Invitrogen) ved stuetemperatur i mørke. Efter vask en gang med PBS microtissues blev bragt på et objekt slide med fluorescerende monteringsmedium (Dako Glostrup, Danmark) og blev analyseret på en LSM 510 Meta konfokalmikroskop (Zeiss).

Scanning Electron Microscopy (SEM)

Tumor microtissues blev fikseret med 2,5% glutaraldehyd (BioChemika Fluka) i 0,1 M phosphatbuffer (pH 7,4). Efter en kort vask i PBS, efterfulgt af post-fiksering i en time med 1% vandig osmiumtetroxid (ReagentPlus; Sigma-Aldrich), prøver var gradvist dehydreret med ethanol. Efter tørring (CPD 030, Bal-Tec), microtissues blev monteret på aluminium stumper med dobbeltklæbende tape, sputter-belagt med 10-nm guld /palladium (Au /Pd) (Bal-Tec) og undersøgt med et felt emission scanning elektron mikroskop (Gemini 982, Zeiss, Göttingen, Tyskland).

Semi-tynde sektioner

Tumor microtissues blev behandlet i henhold til standard teknik til transmission elektronmikroskopi. Microtissues blev fikseret i Karnovsky fikseringsmiddel (2,5% glutaraldehyd og 2% paraformaldehyd i 0,1 M cacodylatbuffer) natten over og derefter vasket tre gange (10 minutter hver) i 0,1 M cacodylatbuffer, efterfulgt af fiksering med 1% osmiumtetraoxid i 0,05 M cacodylatbuffer ved 4 ° C i 1 time. Overdreven osmiumtetraoxid blev fjernet ved skylning af microtissues tre gange (10 minutter hver) i 0,1 M cacodylatbuffer. Microtissues blev derefter dehydreret med ethanol (2 x 70% ethanol hver 30 minutter, 2 × 96% ethanol hver 30 minutter, 2 x 100% ethanol hver 30 minutter) og acetone (2 x hver 30 minutter) forud for inkubering i en fortynding på flydende epoxyharpiks (Epon medium blanding: 20 ml embed-812, 16 ml DDSA, 8 ml NMA og 1,2 ml BDMA; Electron Microscopy Sciences, München, Tyskland) og acetone i et forhold på 30% til 70% i tre timer. De microtissues blev infiltreret med en blanding af Epon og acetone ligeligt ved 4 ° C natten over i lukkede hætteglas. Den næste dag blev væsken erstattes af en blanding af 70% epoxyharpiks og 30% acetone i tre timer. Efterfølgende blev microtissues inkuberet to gange i 100% Epon (3 timer og ved 4 ° C natten over). Derefter blev ren epoxyharpiks ændret, og microtissues var infiltreret med Epon i et vakuumkammer i 2 timer. Microtissues blev derefter overført til en indlejring støbeform, mærkes og anbringes i et vakuumkammer i yderligere 1 time. Microtissues blev overført til en inkubation kammer ved 60 ° C i 48 timer for at forøge polymerisation af epoxyharpiksen. One-mikrometer snit blev skåret på en Leica Ultracut mikrotom, farves med toluidinblåt ved 60 ° C, og derefter undersøgt under anvendelse af et lysmikroskop.

Resultater

Tumor microtissue dannelse

først undersøgte vi arrangementet af tumorceller og fibroblaster i sfæroider i dyrkningsperioden. Til dette formål SEM billeder (figur 1) af A549 og Colo699 mono- og co-kulturer blev taget efter ti dages dyrkning. Desuden blev A549 /Colo699 mono- og co-kulturer forberedt til semi-tynde sektioner, og farvet med toluidinblåt (figur 2)

SEM billeder blev taget efter ti dage:. Monokulturer af A549 og SV80 blev udsået i et forhold på 2500 celler /40 pi, hvorimod Colo699 monokulturer blev dyrket i form af 1250 celler /40 pi. Alle co-kulturer blev podet i en karcinom celle: fibroblast-forhold på 1:02 /40 pi (A549 co-kulturer: 2500 kræftceller +5000 fibroblaster /Colo699 co-kulturer: 1250 kræftceller +2500 fibroblaster). (A /B) A549 monokulturer, (C /D) A549 co-kulturer; (E /F) Colo699 monokulturer, (G /H) Colo699 co-kulturer; (I /J) SV80 monokulturer. Alle co-kulturer vises en mere homogen og rundere microtissue overflade i forhold til monokulturer.

Semi-tynde sektioner (1 um skiver) af A549 /Colo699 mono- og co-kulturer efter ti dages dyrkning farves med toluidin. Bar i alle billeder: 20 pm. A549 celler danner forrevne sfæroider ligner en mere flerlaget væv og udviser en ru overflade. Colo699 monokulturer afslører en sfærisk struktur med en løs overflade. Når fibroblaster tilføjes begge cellelinier opbygge en mere kompakt microtissue med en regelmæssig overflade.

Som vist i SEM billeder og semithin sektioner, A549 celler danner robuste sfæroider ligner en mere flerstrenget væv og udviser en ru overflade. Efter fem dage microtissues ikke havde fuldt dannet og fik let forstyrret under proceduren høst. I modsætning hertil, når der anvendes i co-kultur disse celler danner tætte sfæroider med glatte overflader. I semithin sektioner kan detekteres fibroblaster som celler, der har en flad morfologi hovedsagelig anbragt nær overfladen af ​​microtissues.

Under dyrkning Colo699 monokulturer afslører en sfærisk struktur med en løs overflade. Når der tilsættes fibroblaster disse sfæroider opbygge et mere kompakt sfæroid med en regelmæssig overflade. Som alle celler havde den samme morfologi imidlertid tumorceller og fibroblaster kunne ikke diskrimineres i semithin sektioner.

I modsætning til cancercellelinjer, SV80 fibroblaster danne små tætte søger sfæroider med en glat overflade, når de dyrkes alene .

Som alle co-kulturer viste en mere homogen overflade med en stram arkitektur, besluttede vi at undersøge, om dette afhænger af ECM produktion af cellerne. I figur 3 demonstrerer vi, at SV80 celler betydeligt producerer fibronektin når de dyrkes på egen hånd, mens både tumor celle monokulturer var helt negative for fibronectin. I Colo699 co-kulturer ECM var jævnt fordelt over hele microtissue. Men i A549 co-kulturer fibronectin blev hovedsagelig udskilles af celler, der blev opbygget ringen lignende struktur omkring den indre kerne i microtissue.

Fibronectin blev vist i microtissues efter ti dage. (Bar i A549 /SV80 monokulturer: 50 um, bar i alle andre microtissues: 100 pm); Sekretion af fibronektin kunne observeres i microtissues indeholder fibroblaster, mens der i alle tumor celle monokulturer kunne påvises nogen fibronektin sekretion.

Vækst kurve og stabilitet tumor microtissues

Tre microtissues af mono . – og co-kulturer blev evalueret af lysmikroskop og efter fem, syv og ti dage microtissue mængder blev beregnet (figur 4A)

A: microtissue mængder blev beregnet ved formlen V = 4/3 * Π * r3, hvor r = ½ * √ d1 * d2. Mean volumener vises i μm3 med deres tilsvarende standardafvigelser. B: middelværdi og standardafvigelse af Ki67 positivitet blev beregnet ved at tælle Ki67 positive og negative cellekerner på skiver af tre forskellige sfæroider repræsentativt. Derefter blev andelen af ​​positive cellekerner til helcelle omstændelige beregnes. Co-dyrkning af både tumorcellelinier med en fibroblast cellelinje ført til en betydelig opregulering (p 0,05). Af Ki67 udtryk i alle microtissues

Det var ikke muligt at beregne sfæroide mængder A549 microtissues fordi i monokulturer disse celler ikke danner runde eller ellipsoide formet sfæroider. Det samme problem udviklet med A549 co-kulturer, der kun begyndte at dannes rundt målbare sfæroider efter fem dage. Derfor blev beregningen første bind A549 samdyrkning gjort på dag syv, hvor et volumen på 63 um

3 blev målt. I løbet af tre dage omfanget af dette samarbejde kultur steg til 81 um

3.

Colo699 monokulturer viste en fortsat stigning i mængde fra 43 um

3 til f 83 um

3. I modsætning hertil viste Colo699 co-kulturer et volumen på 74 um

3 efter fem dage med et fald i volumen til 39 um

3.

I SV80 monokulturer en stabil volumen på 33 um

3 efter fem dage til 27 um

3 efter ti dage kunne observeres.

Endelig microtissue mængder blev sammenlignet med hinanden med t-test. Efter ti dage en betydelig forøgelse af volumen kunne måles i A549 co-kulturer og Colo699 monokulturer sammenlignet med enten SV80 monokulturer eller Colo699 co-kulturer. På den anden side, efter fem dage volumenet af Colo699 co-kulturer var blevet betydeligt højere sammenlignet med Colo699 og SV80 monokulturer (figur 4A).

For at undersøge cellelevedygtighed, en Annexin V APC og propidiumiodid (PI ) FACS assay blev etableret. SV80-celler blev inkuberet med CFSE før såning, således levedygtigheden af ​​cancerceller og fibroblaster kunne måles uafhængigt af diskrimination i FACS-analyser. Microtissues blev høstet, fordøjet med Accumax og inkuberet med PI og Annexin V APC. Analyser blev udført på en BD FACS Calibur-system. Hver søjle repræsenterer middelværdien cellelevedygtighed af 24 forskellige microtissues målt i tre uafhængige kørsler. Til statistisk vurdering af t-test blev anvendt (figur 5).

Fibroblaster blev inkuberet med CFSE før oprindeligt podning dem sammen med tumorceller i hængende dråber. Apoptose blev målt enten efter fem eller ti dage. Hver søjle repræsenterer den gennemsnitlige celle levedygtighed 24 sfæroider og deres tilsvarende standardafvigelse, der blev målt i to forskellige kørsler (Signifikante forskelle er markeret med *, p 0,05). Dot blots repræsenterer FACS analyser af en køre indeholdende A549-celler i co-kultur med SV80 fibroblaster efter ti dages dyrkning. A: Specifik levedygtighed af kræftceller i mono-og co-kulturer vises. B: levedygtighed ensomme fibroblaster i mono-og co-kulturer vises. C: Fordelingen mellem fibroblaster og tumorceller efter fem og ti dage vises. D: Hele microtissue levedygtighed vises efter fem og ti dage

A549 monokulturer viste 77% af levedygtige celler efter fem dage med en minimal stigning i levedygtigheden efter ti dage til 79%.. Co-kulturer med fibroblaster viste en betydelig stigning i levedygtighed fra 60% efter fem dage til 79% efter ti dage. Colo699 celler udviste 93% af levedygtige celler efter fem dage med noget fald i levedygtighed til 92% efter ti dage. I co-kulturer varede 82% af levedygtige celler efter fem dage og 76% efter ti dage. Når levedygtighed SV80 celler blev analyseret, blev en mindre stigning fra 65% efter fem dage til 67% efter ti dage vist. Imidlertid kunne et signifikant fald i levedygtighed fra Colo699 monokulturer til Colo699 co-kulturer observeres (figur 5D).

Som det næste skridt, levedygtighed af de to forskellige fraktioner, tumorceller og fibroblaster blev analyseret ved at diskriminere dem ved flowcytometri. A549 cancerceller i co-kulturer forblev levedygtige hele inkubering med en levedygtighed på 74% efter fem dage og 71% efter ti dage. I Colo699 co-kulturer kunne observeres en stigning i levedygtighed fra 78% efter fem til 89% efter ti dage, udviste en væsentligt bedre levedygtighed sammenlignet med A549 co-dyrkede cancerceller efter ti dage (figur 5A).

En lignende observation blev gjort med hensyn til levedygtighed fibroblaster i microtissues. Når co-dyrket sammen med A549 cancerceller, SV80 celler udviste en signifikant opregulering i levedygtighed fra 46% efter fem dage til 71% efter ti dage. I Colo699 co-kulturer levedygtigheden også steget, men ikke signifikant varierer mellem 70% efter fem til 83% efter ti dage. Samtidig kan en betydelig bedre levedygtighed for fibroblaster ved samtidig dyrket sammen med Colo699 celler efter fem dage vises sammenlignet med A540 co-kulturer (figur 5B).

Desuden er forholdet mellem fibroblaster og tumorceller i co-kulturer blev analyseret efter fem og ti dage. Når co-kulturer blev dyrket i hængende dråbe blev cancerceller og fibroblaster altid podet i et forhold på 1:2 (2500 cancerceller /5000 fibroblaster). Efter fem dage i begge co-kulturer kunne observeres en næsten jævn fordeling mellem fibroblaster og cancerceller, varierende fra 43% fibroblaster til 57% tumorceller i A549 co-kulturer og 49% til 51% i de Colo699 co-kulturer. Imidlertid kunne efter ti dage betydeligt flere tumorceller end fibroblaster i begge co-kulturer vises. I A549 co-kulturer, 19%, og i Colo699 co-kulturer 14% af alle celler blev identificeret som fibroblaster (figur 5C).

Cell organisation og protein udtryk mønster

Efter inkubering A549 og Colo699 celler alene eller i co-kultur med fibroblaster i fem og ti dage blev immunohistokemiske analyser udført (figur 5-7 /tabel 2). Vimentin blev valgt som et protein indikerer et skift til en mesenchymal fænotype i epitelceller. α-SMA-ekspression indikerer et endnu mere mesenchymale fænotype af fibroblaster og afspejler en mesenchymal til mesenchymal overgang. E-Cadherin, en epitelcelle adhæsion protein blev valgt som markør for adhærente celler og Ki67 som celleproliferation og aktivering markør. Tre forskellige sfæroider blev analyseret for hvert protein farvning og fortløbende skiver af en klumpformet vises repræsentativt her (figur 7-9)

(A) Colo699 monokulturer efter ti dage.; (B) Colo699 co-kulturer efter ti dage; DAPI (blå) blev anvendt til farvning cellekerner, Phalloidin Atto 633 (rød) til visning af F-actin og CFSE (grøn) som et cytoplasmatisk farvning for fibroblaster (Bar i A /B: 50 um). kunne stadig påvises fibroblaster i microtissues efter fem dages co-dyrkning med Colo699

IHC skiver af A549 i mono- og co-kulturer efter fem og ti dage (Bar i AD:. 100 um, bar i Insert: 25 pm); vises en stigning i vimentin og en samtidig reduktion i E-cadherin i co-kulturer. Også en opregulering af Ki67 udtryk i co-kulturer blev fundet

IHC skiver af Colo699 i mono- og co-kulturer efter fem og ti dage (Bar i A /C:. 50 um, bar i B /D: 100 um, bar i Insert: 25 pm); Sammenlignet med monokulturer Colo699 co-kulturer dannet meget mindre sfæroider. Men positiv farvning reaktioner for E-Cadherin og vimentin er sammenlignelige med de monokulturer i ti dage. efter ti dage, fordi ingen forskel i farvningsmønster mellem fem og ti dage blev påvist. Microtissues var helt positive for vimentin og Ki67, hvorimod ikke blev observeret nogen E-Cadherin og α-SMA udtryk

IHC skiver af SV80 i monokulturer efter ti dage (Bar i A: 100 um).;