PLoS ONE: Funktionel Folat receptor Alpha er forhøjet i blodet af kræft i æggestokkene patienter

Abstrakt

Baggrund

På trods af lav forekomst, kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald, og det har den højeste dødelighed af alle gynækologiske maligniteter blandt amerikanske kvinder. Dødeligheden ville blive reduceret med en tidlig påvisning markør. Den folat receptor alpha (FRα) er en logisk valg for en biomarkør på grund af sin fremherskende overekspression i kræft i æggestokkene og dens eksklusive udtryk i kun et par normale væv. I tidligere arbejde blev det observeret, at patienter med ovariecancer havde forhøjede serumniveauer af et protein, der er bundet til en FRα-specifikt monoklonalt antistof i forhold til raske individer. Det blev dog ikke vist, at proteinet opdaget var intakte funktionelle FRα. I den aktuelle undersøgelse, var målet at bestemme, om patienter med ovariecancer (n = 30) havde forhøjede serumniveauer af en fuldt funktionel intakte FRα sammenlignet med matchede raske kontrolpersoner (n = 30).

Metode /vigtigste resultater

FRα-niveauer i serum blev analyseret ved to metoder, immunoblotting analyse og en radiomærket folinsyre-baserede mikrofiltrering bindingsassay. Brug af immunoassay, observerede vi, at niveauer af FRα var højere i serum fra patienter med ovariecancer sammenlignet med kontroller. Lignende resultater blev også observeret ved anvendelse af mikrofiltrering bindingsassay, som viste, at det cirkulerende FRα er funktionel. Vigtigt er det, vi fandt også, at niveauerne af FRα var sammenlignelige mellem patienter tidlige og fremskredne stadie.

Konklusioner

Vores resultater viser, at kræft i æggestokkene patienter har forhøjede niveauer af funktionelle intakte FRα. Disse resultater understøtter den potentielle anvendelse af cirkulerende FRα som biomarkør for tidlig ovariecancer

Henvisning:. Basal E, Eghbali-Fatourechi GZ, Kalli KR, Hartmann LC, Goodman KM, Goode EL, et al. (2009) Funktionel Folat receptor Alpha er forhøjet i blodet af æggestokkene kræftpatienter. PLoS ONE 4 (7): e6292. doi: 10,1371 /journal.pone.0006292

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: April 23, 2009; Accepteret: 11 Juni 2009; Udgivet: 20 Jul 2009

Copyright: © 2009 Basal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette tilskud blev støttet af National Cancer Institute tilskud, K01-CA100764 og R03-CA121386. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræft død og har den højeste dødelighed af alle gynækologiske maligniteter blandt amerikanske kvinder med en anslået 21,650 nye tilfælde og en forventet 15.500 dødsfald i 2008 [1]. Størstedelen af ​​patienter med ovariecancer stede med fremskreden sygdom (trin III-IV) og har en overlevelse på typisk 80% af patienter med fremskreden epitelial ovariekræft, denne markør har en positiv prædiktiv værdi på 10% i tidligt stadium sygdom [3]. Endvidere CA-125 også forbundet med forskellige ikke-maligne tilstande, såsom graviditet, endometriose, adenomyose, uterine fibromer, underlivsbetændelse, menstruation, og godartede ovariecyster. CA-125 er også forbundet med andre maligne tilstande, såsom pancreas, bryst, lunge, mave, og colon-cancere [4]. Selvom CA-125 er nyttigt i opfølgningen af ​​patientens kemoterapi og at opdage tidligt tilbagefald hos patienter med allerede kendte ovariecancer, er det ikke nyttigt til at identificere tidlige stadie sygdom [5].

folat receptor α (FRα), en 38-40 kDa-molekyle, er et velkarakteriseret medlem af folat receptor (FR) familie med høj affinitet for folater. FRα er forankret til cellemembraner gennem en glycosylphosphatidylinositol del og transporterer folater via en endocytisk proces [6]. FRα udviser begrænset normale vævsfordeling, med målelig ekspression begrænset til de apikale overflader af et par epitel, overvejende lunge, nyre og choroid plexus, men overudtrykkes i et spektrum af faste tumorer, herunder ovariecancer, ikke-småcellet lungecancer , brystcancer, nyrecancer og i høj kvalitet osteosarkom [7] – [10]. Dette overekspression af høj affinitet FRα i nogle kræftformer kan være opstået for at imødekomme cellulære krav til DNA-syntese og vækst [11].

Ud over sin celleoverfladelokalisering, FRα kan også kaste i blodet. Kaste blev indledningsvis identificeret under udviklingen af ​​folat radioligandbindingsassayene der anvendte renset cellefri FR som et bindende protein. I disse undersøgelser blev det bemærket, at der var ofte en stor forskel i vurderingen af ​​total serum folat når analyseres efter varme ekstraktion sammenlignet med indfødte serum [12]. Når en stald, vil FRα binde cirkulerende folat, idet affiniteten er i nM-området. Nu er det velkendt, at frigørelsen komplicerer fortolkningen af ​​serum folat assays og eventuelt masker tilstedeværelsen af ​​funktionelle receptor, medmindre en syrebehandling anvendes til at frigøre endogene folat og tillade FRα mætning med den radiomærkede folinsyre. Denne uoverensstemmelse i folinsyre niveauer mellem indfødte og varme udvundet serum førte til identifikation af cirkulerende FRα i nogle prøver af navlestrengsblod og i nogle af moderens serum [13]. Vigtigere, FRα frigivet fra normale epitelceller bør ikke bidrage til FRα niveauer i serum, eftersom receptoren uvægerligt er lokaliseret til den apikale overflade af en polariseret epitel, hvor dens frigørelse vil levere den frie receptor i et lumen, der naturligt dræner fra kroppen gennem sin egen blænde.

Nylige undersøgelser tyder på, at FRα også kan kaste ind i blod fra tumorer, der giver mulighed for at få adgang til og måle det som en tumor markør for tidlig fase kræft. Den fremherskende udtryk for FRα i kræft i æggestokkene, blandt alle faser, har stimuleret interessen for at anvende det som et terapeutisk mål og biomarkør [14]. Målet med den aktuelle undersøgelse var at bestemme, om intakt funktionel FRα er udgydt i kredsløbet og at vurdere dens potentiale som en cirkulerende biomarkør. Dette mål understøttes af tidligere arbejde som viste, at æggestokkene kræftpatienter har forhøjede niveauer af et serum protein, der reagerer med anti-FRα antistoffer [15]. Hvad der var tilbage, der skal besvares, var, om antistofferne påvises hele FRα og hvorvidt den detekterede protein var et funktionelt folat receptor (FR). I den foreliggende undersøgelse niveauerne af cirkulerende FRα i blodet hos patienter med ovariecancer, blev undersøgt under anvendelse af en

3H-FA-baserede mikrofiltrering assay, som blev udviklet for at detektere funktionel FRα. Desuden blev et immunoblot assay anvendes til at bekræfte tilstedeværelsen af ​​det specifikke hele FRα protein. Som det vil fremgå, æggestokkene kræftpatienter demonstrere forhøjede niveauer af FRα i kredsløbet understøtter dets potentielle anvendelse som en sygdom biomarkør.

Materialer og metoder

Etik Statement

Mayo Clinic IRB godkendt undersøgelsen og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag.

emner

Hver ovariecancer sag blev først matchede til en kvindelig kontrol på blod uafgjort inden for 6 måneder (alle 30 tilfælde matchet med succes), og derefter alder inden for 5 år. Tyve-ni sager lykkedes matchet. Den 30. Sagen blev matchet på blod uafgjort inden 6 måneder og alder inden for 9 år til et støtteberettiget kontrol. Kvalificerede tilfælde var patienterne, over alderen 20, med histologisk bekræftet primær epitelial kræft i æggestokkene. En 40-ml (præoperativ) prøve blod blev opsamlet, behandlet, alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C som serum. Gennemsnitsalderen (± SEM) af aldersmatchede raske kvindelige donorer og patienter var 61 ± 3 og 60.63 ± 3 år henholdsvis. Andre patient og tumor egenskaber er vist i tabel 1.

Forbrugsvarer og reagenser

Folinsyre blev opnået fra Alexis Biochemicals. Centrifuger filtre (10.000 dalton afskæring) blev indkøbt fra Millipore (Burlington, MA). Tritieret folinsyre [3,5,7,9-

3H] natriumsalt, (

3H-FA, 1 mCi /ml) blev indkøbt fra American Radioaktivt mærket Chemicals (St. Louis, Missouri), og Brugsklare Sikker væskescintillationscocktail var fra Beckman Coulter. Anti-FRα antistoffer MOv18 /ZEL og F5753 var fra Alexis Biochemicals (San Diego, CA) og US Biologisk (Swampscott, MA), hhv.

Udarbejdelse af tumor cellelysater og cellekultursupernatanter som kilder til FRα

KB-celler er humane nasopharyngeale epidermoide carcinomaceller der udtrykker høje niveauer af FRα [16] – [18]. KB-celler blev dyrket i medier bestående af folat-fri RPMI 1640 suppleret med 55 pM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES-buffer, 100 IE /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum. Supernatanter blev fremstillet ved centrifugering af konditionerede medier ved 4 ° C til fjernelse ikke-forankrede celler. Alikvoter af 4 dages supernatanter blev opbevaret ved -80 ° C til anvendelse som en kilde til ikke-celleassocieret FRα. Cellelysater blev fremstillet ud fra konfluente KB monolag ved gentagne fryse-tø-cykler efterfulgt af centrifugering for at fjerne debris. For begge supernatanter og cellelysater blev proteinkoncentrationer bestemt ved optisk tæthed. MCF-7 humane brystcancerceller blev anvendt som en FRα-negativ kontrol og fremstillet på lignende måde KB-celler. Lysater (5-10 ug af lysater) og supernatanter (10-20 pi) blev anvendt til assay udvikling og som kontroller.

3H-folsyre bindingsassay

Måling af folat receptorer og kontrolpersoner var en variation af en tidligere beskrevet metode [19]. Prøver (10 pi) blev fyldt i det øvre kammer af et par filtrerings- rør og fortyndet til 50 pi total med et solubiliserende opløsning (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 25 mM

n

octyl -β-D-glucopyranosid, 5 mM EDTA og 0,02% natriumazid). Filtreringsvæskerne Rørene blev centrifugeret, og filtrene blev behandlet med 30 mM acetat-opløsning (pH 3,0) til fjernelse af endogen FA efterfulgt af centrifugering og to gange vask med solubiliserende opløsning. Derefter par af filtreringssystemer rør blev inkuberet enten med en 1000X kold FA i en bindende opløsning (10 mM Na

2P

4, 1,8 mM KH

2PO

4, 500 mM NaCl, 2,7 mM KCI, pH 7,4, og 25 mM

n-

octyl-β-D-glucopyranosid) eller med den bindende opløsning alene, og prøver blev inkuberet 2 timer ved stuetemperatur og derefter centrifugeret. Bindende der indeholder

3H-FA blev derefter tilsat til alle prøver, efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C under forsigtig omrøring. Filtrene blev centrifugeret og vasket med PBS indeholdende 50 mM

n

octyl-β-D-glucopyranosid at fjerne den ubundne

3H-FA. Bundet

3H-FA tilbageholdt på filtrene blev fjernet med 100 pi PBS indeholdende 4% Triton X-100 og overføres til et hætteglas med væskescintillationscocktail, og aktiviteten blev målt i en Beckman LS6000IC scintillationstæller. Specifik binding blev bestemt ved at trække aktiviteten i tilstedeværelsen af ​​overskydende kulde FA fra aktiviteten af ​​den samme prøve uden FA konkurrence.

Immunopræcipitation og immunoblotanalyse af FRα

FRα i serum var direkte målt under anvendelse immunoblotanalyse af immunpræcipitater. Serumprøver (100 pi), lysater (25 ug KB eller MCF-7) eller KB supernatanter blev præ-blokerede to gange med protein G sepharose og 5 ug hver af monoklonale antistoffer, MOv18 /ZEL og F5753, blev tilsat til hver prøve, og inkuberet i 1 time ved 4 ° C. Protein G plus Sepharose-perler blev derefter tilsat, og blandingen fik lov til at rotere natten over ved 4 ° C. Perlerne blev derefter opsamlet med centrifugering og vasket med 600 pi lysisbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, og proteasehæmmere). Perlerne blev dekanteret og kogt i Laemmli-puffer. Proteinerne blev resolveret ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser efterfulgt af blotting. Blottene blev probet med MOv18 /ZEL antistof (5 ug /ml i 2% fedtfri tørmælk, 0,1% Tween 20 i TBS) efterfulgt af sekundært anti-muse-IgG peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret antistof (1:5000 i 2% ikke fedt tørmælk i 0,1% Tween 20), og fremkaldt ved forøget kemiluminescens med Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate i 5 minutter (Pierce, Rockford, IL, USA). Blottene blev derefter udsat for X-ray film og band positioner og band tætheder blev beregnet ved hjælp af et edb-billede analysesystem (UVP Biochem Imaging systemer, Upland, CA).

Statistisk analyse

gennemsnitlige niveauer af cirkulerende FRα, registreres med enten ligand-binding assay eller immunblotting analyse mellem cases og kontrolpersoner blev sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon matchede par test. I nogle tilfælde blev anvendt lineær regressionsanalyse for at undersøge for statistisk signifikante korrelationer. Andele blev testet under anvendelse af Fishers eksakte test. I alle tilfælde blev en to-halet test, der anvendes og ap-værdi på mindre end eller lig med 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Påvisning af FRα hjælp mikrofiltrering bindingsassays og immunoblotting

i indledende indsats for at måle niveauet af cirkulerende FRα af

3H-FA bindende studier blev forundersøgelser gjort for at bestemme egenskaberne for mikrocentrifuge filtrering analysen. KB-celle supernatant prøverne blev inkuberet med stigende mængder af

3H-FA i fravær og nærvær af overskydende kold FA og derefter målte inddrivelse af bundet

3H-FA. Som vist i figur 1A, mellem 10 og 120 nmol /l

3H-FA, den totale binding steg lineært. Når overskydende kold FA blev tilsat, blev bundne mængde reduceret til baggrundsniveauer. De beregnede FA koncentrationer gennem denne række (10-120 nmol /l) var konsistente og ingen af ​​værdierne var signifikant forskellige (ikke vist). Resultaterne viser, at assayet er i stand til at måle FRα over et bredt område af FA koncentrationer

Panel A:. Ti pi alikvoter af KB kultur supernatant blev fortyndet til 50 pi med bindingsbuffer, som indeholdt stigende koncentrationer af

3H-FA pulserende, uden (Total bundet) eller med 1000x kold FA. Efter inkubering blev ubundet FA fjernet ved mikrofiltrering. Vist er CPM tilbageholdes af mikrofilteret. Også vist er Baggrund som er bindende i fravær af KB supernatanter og uden overskydende kold FA. * P 0,05. Hvert datapunkt er middelværdien (± SE) af 3 replikater. Det indsatte stiplede linje er den lineære regressionslinje af den totale bundne præsenteret med de tilsvarende p og r værdier. Panel B viser, at mængden af ​​specifik binding er afhængig inputniveauerne. I dette tilfælde stigende mængder serum indeholdende en KB-protein spike blev undersøgt. Dette eksperiment er repræsentativt for 2 forskellige eksperimenter. Panel C viser FA koncentration, der var bundet i enten KB supernatanter eller en repræsentativ serumprøve fra en sag og kontrol, der sammenligner 30 KD og 10 cutoff mikrofiltre. Eksperiment repræsenterer to eksperimenter. Panel D viser et repræsentativt eksempel på immunoblotanalyse af FRα. Arrow = M

r 38000-protein; KD = kilodalton; IP = immunopræcipitation. Bane 1, IP w ingen serum; bane 2, IP i KB lysat; bane 3, IP af klaret serum med KB lysat spike; bane 4. IP af serum alene, bane 5, KB lysat ingen IP; bane 6, IP af KB lysat ingen serum.

For at bestemme den minimale mængde af serum kræves blev en normal kontrol serumprøve (100 ul) tilsat KB cellelysat (5 ug) og forskellige volumener (0-40 pi) blev testet for binding

3H-FA. Som vist i et repræsentativt eksempel eksperiment i figur 1B, kan mikrofilteret assayet detektere FA binding i et volumen så lidt som 10 pi. Men over 20 pi serum blev det konstateret, at mikrofiltrene ikke altid let afløb. Således blev en standard volumen på 10-20 ul bruges til cases og kontroller.

Selvom tidligere arbejde havde brugt 30 KD cutoff filtre til måling FRα i vævsprøver [19], var der en bekymring for, at nogle tab kan er opstået som følge af en variation i porestørrelse, resulterer i tilstedeværelsen af ​​nogle filterporer, som ville tillade passage af 38 KDa FRα. Derfor tests blev udført sammenligning 30 KD og 10 KD cutoff filtre. Generelt var der kun mindre forskelle. For eksempel som vist i figur 1C, var der ingen bemærkelsesværdig forskel i den bundne FA ved brug KB cellelysater af KB supernatanter. I modsætning hertil blev der små stigninger konsekvent overholdes i serumprøver ved brug af de 10 KD cutoff filtre. Således blev 10 KD cutoff anvendes til at måle FRα i sera af sager og kontroller.

I et forsøg på at underbygge de mikrofiltrering resultater, en immunpræcipitation og immunblotting metode blev oprettet. Som vist i figur 1D, kan FRα immunopræcipiteres fra sera (100 pi) og immunblottet resulterer i detektering af 38 KD FRα. Samlet viser disse resultater, at mikrofiltrering assay kan anvendes til at detektere FRα i små serumprøver. Endvidere immunoblotting analyse afslører tilstedeværelsen af ​​intakt fuld længde FRα.

Patienter med ubehandlet kræft i æggestokkene har forhøjede gennemsnitlige niveauer af cirkulerende FRα sammenlignet med matchede kontroller

Patient (dvs. tilfælde) egenskaber er detaljeret i tabel 1. Pollenfilter bindingsassays og immunoblotting viste, at sera afledt af de tilfælde indeholdt signifikant højere gennemsnitlig niveauer af FRα forhold til kontrollerne (Figur 2A-C). Lineær regressionsanalyse af alle målinger fra begge tilfælde og kontroller viste, at der var en signifikant korrelation mellem resultaterne af mikrofiltrering og immunoblot assays (figur 2D). For at vurdere hvilken assay potentielt kan være mere modtagelige for udvikling som en biomarkør test blev cutoffs etableret fra kontrolgruppen værdier for begge analyser ved hjælp af middelværdien og to standardafvigelser. Med denne strategi, mere end 95% af kontrolværdier faldt til under cutoff. Som vist i figur 3, ved hjælp af denne strategi, blev 13% og 27% af tilfældene for at have forhøjede niveauer af FRα i mikrofiltreringen og immunoblotting assays hhv. Statistisk analyse under anvendelse af Fishers eksakte test viste, at den del af tilfælde med forhøjede niveauer af FRα, som detekteret med immunoblotting assay var signifikant forskellig fra den del af kontroller som positiv. I modsætning hertil den del af afslørede tilfælde med mikrofiltrering assayet var ikke signifikant, hvilket antyder, at immunoblotting assay potentielt kan have en bedre positiv prædiktiv værdi.

Panel A viser antallet af cirkulerende folat receptor (FR’er) ekstrapoleret fra den mikrofiltrering assay under forudsætning af en 1:01 molforhold FA:FR i begge tilfælde og matchede kontroller Panel B viser det densitometrisk signal opnået ved hjælp af immunoblotting. P-værdier i panel A og B er beregnet ved hjælp af Wilcoxon matched pair test og hver søjle repræsenterer middelværdien ± standardfejl. Panel C: Bane 1, immunpræcipitation negativ kontrol; bane 2, negativ kontrol (MCF-7) lysat; bane 3, positiv kontrol (KB) lysat); bane 4, serumprøve kontrol; bane 5, matchet ovariecancer serumprøve; bane 6, serumprøve kontrol; bane 7 matchede ovariecancer serumprøve. Arrow = M

r 38000-protein; KD = kilodalton. Panel D viser den lineære regressionsanalyse korrelere mikrofiltrering bindingsassay data og immunoblotting data. Hvert datapunkt repræsenterer et unikt individ. Åbne symboler repræsenterer raske kontrolpersoner og lukkede symboler er patienter.

Panel A og B viser procentdelen af ​​sager og kontroller, der blev betragtet som positive ved mikrofiltrering eller immunblotting assay henholdsvis med cutoffs etableret som den gennemsnitlige plus to standardafvigelser af kontrolværdierne. Den p-værdi blev beregnet ved hjælp af Fishers eksakte test.

Niveauer af cirkulerende FRα er sammenlignelige mellem tidlig og fremskreden sygdom

Vi testede, om der var nogen sammenhæng mellem niveauer af cirkulerende FRα og en række kliniske funktioner samt FRα udtryk inden tumoren. Vi fandt, at cirkulerende FRα niveauer (som vurderede immunblotting) var sammenlignelige mellem tidlige (Stages I /II, n = 15, 16 ± 2 au) og avancerede trin (trin III /IV, n = 15, 12 ± 2 au, p = 0.24) patienter som vist i figur 4A. Forskellene i cirkulerende FRα mellem patienterne tidligt og avancerede trin som vurderet ved at binde analyser også var ikke signifikant (1,4 ± 0,3 vs. 1,0 ± 0,2 p. 0,2, figur 4B). Vigtigt er det, niveauer af FRα hos patienter tidlige stadie var betydeligt højere end alle kontroller (n = 30, 7 ± 0,9 au, immunoblotting, s 0,0001 og 0,6 ± 0,1 nmol /l binding, p = 0,02).

Paneler A og B viser sammenligningen mellem tidlige og sene fase densitometriske og mikrofiltrering assay signaler hhv. Hvert datapunkt repræsenterer et unikt individ og den vandrette linje repræsenterer middelværdien. p-værdier vist blev beregnet ved hjælp af en Students t-test.

Ingen signifikante korrelationer mellem cirkulerende FRα og enten alder, klasse, tilbagefald status eller omfanget af debulking (optimal vs. suboptimal) blev observeret (p & gt 0,05). Tumorer fra 27 ud af 30 patienter havde høj FRα ekspression, i overensstemmelse med tidligere arbejde, og derfor vores prøve størrelse var ikke stor nok til at bestemme, om tumor FRα ekspression var forbundet med niveauer af FRα i blodet. Men af ​​de tre tumorer (1 serøs grænsetilfælde og 2 mucinøs borderline) med lav tumorassocieret FRα, kun 1 mucinous borderline påvist, lave cirkulerende FRα niveauer. Dette antyder, at cirkulerende FRα måske ikke korrelerer godt med tumor niveauer. Ja, i vores tidligere undersøgelser, vi observerede nogle uoverensstemmelser i FRα farvning forskellige tumor foci (tilbagevendende og metastatiske læsioner) [14].

Diskussion

Kræft i æggestokkene ofte unddrager sig afsløring på grund af manglen på endelige tidlige symptomer. Derfor æggestokkræft præsenterer på fremskredent stadium i -70% af patienterne. De biomarkører i brug i dag ikke er tilstrækkelige til påvisning af tidlig fase kræft. Det er derfor ikke overraskende, at ovariecancer er den største årsag til dødsfald blandt alle de gynækologiske maligniteter i de senere år. Aktuelt tilgængelige markører CA-125 og proteomiske profiler mangler følsomhed, specificitet og /eller reproducerbarhed. Der er klart behov for diagnostiske markører til påvisning ovariecancer på tidlige stadier. Et molekyle udtrykt næsten udelukkende i patogene væv ville gøre en ideel biomarkør og et sådant lovende kandidat er folat receptor (FR-α). FR-α er stærkt overudtrykt i langt de fleste ovariecancere men udviser begrænset ekspression i væv, der er ansvarlige for hele kroppen tilbageholdelse af folater (fx placenta, choroid plexus og nyre). I den aktuelle undersøgelse, testede vi, om det var muligt at påvise cirkulerende FRα i ovariecancerpatienter og hvorvidt det cirkulerende FRα var fuld længde og funktionelle.

Vore data viser, at patienter med ovariecancer har forhøjede niveauer af FRα i forhold til raske kontroller. Disse resultater tyder på, at cirkulerende FRα potentielt kunne udvikles som biomarkør. De forhøjede niveauer af FRα i sygdommens tidlige stadium indikerer, at opregulering af FRα kan forekomme tidligt i æggestokkene carcinogenese hos nogle patienter. Faktisk Toffoli og kolleger fandt, at næsten 79% af patienter med tidlig fase (I og II) ovariekræft overudtrykt FRα, som var væsentlige identisk med andelen af ​​stadie patienter avancerede, der havde FRα udtryk [9]. Vi observerede i vores undersøgelser, at niveauet af cirkulerende FRα patienter tidligt stadie ikke var anderledes end stadie patienter avancerede. Toffoli og kolleger fandt imidlertid, at mens andelen var ens, niveauerne af FRα på tumoren var væsentligt højere i de avancerede stadie patienter. Manglen på korrelation kan indikere, at der er andre faktorer, der regulerer serumniveauer. F.eks Mantovani og kolleger fandt, at normale humane urinprøver var stærkt positiv for FRα immunreaktivitet, hvilket antyder, at der er en mekanisme for dets hurtige nyre-clearance [15]. Eftersom de proximale tubuli i nyren kraftigt udtrykke proteinet, kan man konkludere, at nyren har en veludviklet strategi for afskaffelse FRα at forhindre det i at akkumulere i blodet og forhindrer FA optagelse i væv [19]. Dette understøttes i kinetiske murine modellering undersøgelser, som har vist, at som tumoren skrider frem, stiger i urin niveauer af FRα forud sera niveauer betydeligt [15].

Intact FRα er en 38 kDa-protein og i vores immunoblotassay, anti-MOv18 /ZEL antistof detekteres et protein på samme molekylvægt. Desuden viste vi, at mikrofiltrering analysen opdaget funktionelt protein, der tilsammen viser, at FRα udgydt af kræft i æggestokkene er intakt og funktionel. Tilstedeværelsen af ​​FRα i kredsløbet af patienter har terapeutisk betydning som en række behandlinger er blevet udviklet, at target celleoverflade FRα i kræftpatienter [20]. Disse cirkulerende FR’er kan binde og forstyrre kliniske effekt. Dette kan forklare høje fejlrater observeret i nogle FRα-rettet immunterapier i patienter med kræft i æggestokkene. F.eks Kershaw og kolleger udviklet en strategi, hvor autologe T-celler fra patienter blev gen-modificeret med en kimerisk receptor, der indeholdt en FRα-specifik enkeltkædet antistof koblet til Fc-receptor gamma-kæde [21]. Mens cellerne secernerede IFN-γ som reaktion på FRα, de undlod at lokalisere til tumorstedet, et svigt, kan forklares ved at cirkulere FRα som mættede de kimære receptorer. Derfor analyse af cirkulerende FRα cancerpatienter kan hjælpe ved bestemmelse niveauer af anti-FRα målrettet kimeriske receptorer, der er nødvendige for en vellykket terapi. Derudover har vi også fundet, at forhøjet cirkulerende FRα var funktionelle, hvilket tyder potentiel interferens med en række af folinsyre-konjugeret lægemiddelterapier der er blevet udviklet, som kræver et funktionelt bindingssted [20], En af vanskelighederne, men i måling serum niveauer af FRα er manglen på en kvalitet assay. Mens vores bindingsassays var i stand til at påvise en forskel mellem cases og kontroller, de opnåede resultater tyder på, at immunblotting assay kan være potentielt mere nyttige i at opdage forhøjede niveauer. Men ligesom med enhver blotting assay nytten begrænset af dens tekniske kompleksitet (dvs. immunpræcipitation efterfulgt af immunoblotting), og resultaterne med dette assay er kun semikvantitativ.

Som konklusion vores resultater viser, at ovariecancer patienter, herunder dem med tidlig sygdom, har forhøjede niveauer af funktionelle intakte FRα sammenlignet med raske kontroller. Med yderligere udvikling, herunder større tidlige stadie ovariecancer stikprøvestørrelser og forbedret assay ydeevne, kan brugen af ​​FRα som biomarkør for kræft i æggestokkene være mulig.

Tak

Forfatterne vil gerne takke Dr. Linda E. Kelemen for hendes værdifulde drøftelser med manuskriptet.