PLoS ONE: Resveratrol inducerer Vækst Anholdelse og apoptose gennem Aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Resveratrol, et naturligt forekommende phytopolyphenol sammensatte, har tiltrukket omfattende interesse i de senere år på grund af dets forskellige farmakologiske egenskaber. Selvom resveratrol har kemoforebyggende egenskaber mod flere kræftformer, har de molekylære mekanismer, som det hæmmer cellevækst og inducerer apoptose ikke klart forstået. Den foreliggende undersøgelse blev udført for at undersøge, om PI3K /AKT /FOXO pathway medierer de biologiske virkninger af resveratrol.

Metodologi /vigtigste resultater

Resveratrol hæmmede fosforylering af PI3K, AKT og mTOR. Resveratrol, PI3K-inhibitorer (LY294002 og Wortmannin) og AKT-inhibitor alene svagt induceret apoptose i LNCaP-celler. Disse inhibitorer Derudover forbedrede apoptoseinducerende potentiale resveratrol. Overekspression af vildtype PTEN lidt induceret apoptose. Vildtype PTEN og PTEN-G129E forbedret resveratrol-induceret apoptose, hvorimod PTEN-G129R havde ingen virkning på proapoptotiske effekter af resveratrol. Endvidere blev apoptose-inducerende potentiale resveratrol forstærket af dominant negativ AKT, og hæmmes af vildtype AKT og konstitutivt aktiv AKT. Resveratrol har ingen effekt på ekspressionen af ​​FKHR, FKHRL1 og AFX gener. Inhiberingen af ​​FOXO phosphorylering med resveratrol resulterede i dets nukleare translokation, DNA-binding og transkriptionsaktivitet. Inhiberingen af ​​PI3K /AKT pathway induceret FOXO transkriptionel aktivitet resulterer i induktion af Bim, TRAIL, p27

/KIP1, DR4 og DR5, og inhibering af cyclin D1. Tilsvarende blev resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet yderligere forbedret, når aktivering af PI3K /AKT-vejen blev blokeret. Over-ekspressionen af ​​phosphoryleringssteder mutanter af FOXO proteiner (FOXO1-TM, FOXO3A-TM og FOXO4-TM) inducerede FOXO transkriptionel aktivitet, som blev yderligere forstærket af resveratrol. Hæmning af FOXO transkriptionsfaktorer af shRNA blokeret resveratrol-induceret opregulering af Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/KIP1 og apoptose, og hæmning af cyklin D1 ved resveratrol.

Konklusion /Betydning

Disse data antyder, at FOXO transkriptionsfaktorer medierer antiproliferative og pro-apoptotiske virkninger af resveratrol, delvis skyldes aktivering af ydre apoptose pathway

Henvisning:. Chen Q, Ganapathy S, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol inducerer vækst og apoptose gennem Aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer i prostatacancerceller. PLoS ONE 5 (12): e15288. doi: 10,1371 /journal.pone.0015288

Redaktør: Irina Lebedeva, Enzo Life Biosciences, USA

Modtaget: September 1, 2010; Accepteret: November 4, 2010; Udgivet: December 14, 2010

Copyright: © 2010 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Projektet blev støttet af en bevilling (NIH R01CA114469 til RKS) fra National Institutes of Health (www.nih.gov). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft, en af ​​de mere almindelige neoplasmer i den vestlige verden, opstår gennem den gradvise udvikling af en eller flere præ neoplastiske læsioner i adenocarcinom, og efterfølgende til metastatisk sygdom [1]. Nylige fremskridt har identificeret vigtige genetiske ændringer, der kan initiere prostata carcinogenese, og øge sandsynligheden for kræft progression. Prostatacancerceller er kun beskedent responsiv eller endda ikke reagerer over for de cytotoksiske virkninger af kemoterapeutiske midler eller strålebehandling. Forhøjede koncentrationer af cytotoksiske lægemidler og højere doser af bestråling ikke forbedrer respons på behandling og den fører til resistens over for apoptose i prostatacancerceller. Således er det absolut nødvendigt at identificere anticancermidler, der er ikke-toksisk og yderst effektivt inducerer apoptose fortrinsvis i tumorceller.

Epidemiologiske data understøtter konceptet, at naturligt forekommende forbindelser i den menneskelige kost kan være uden toksicitet og har lang varige gavnlige virkninger på menneskers sundhed. Resveratrol har vist sig at udvise flere potentielle kemoprotektive aktiviteter i celle- og dyremodeller [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], herunder hæmning af PI3K /AKT-vejen [2], [6], [8], [10]. Vi har for nylig vist, at resveratrol forøger terapeutisk potentiale TRAIL ved opregulering dødsreceptorer (TRAIL /DR4 og TRAIL-R2 /DR5) og også i indgreb mitokondrie pathway af apoptose [2], [3]. Sletning eller mutation af PTEN har været den vigtigste årsag til konstitutivt aktiv AKT fører til prostata carcinogenese hos mennesker [11], [12]. Således kan resveratrol være potentiel kandidat til målceller med PTEN deletion eller inaktivering og forbedret AKT-aktivitet i præcancer prostatavæv.

PI3K signalering spiller en central rolle i intracellulære signaltransduktionsveje der er involveret i cellulær transformation, cellevækst, og tumorigenese. Inaktivering af Akt resulterer i dephosphorylering og aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer, rapporteret at mediere cellecyklusstandsning, DNA-reparation, og apoptose [13], [14]. Disse transkriptionsfaktorer, hører til ‘O’ undergruppe af vingede-helix /forkhead transskription-faktor familie, består hovedsagelig af fire medlemmer FOXO1, FOXO3a, FOXO4, og FOXO6 [15]. FOXO proteiner er evolutionært bevarede transkriptionsfaktorer impliceret i flere grundlæggende cellulære processer, der fungerer som slutpunkt for transkriptionelle programmer involveret i apoptose, stress respons og lang levetid [16], [17], [18], [19], [20]. Ophævelse af FOXO funktion er ofte observeret i human cancer [17], [21], derfor mekanismerne for regulering af FOXO proteiner får stadig større opmærksomhed i kræftforskning. De FOXO proteiner integrere regulerende input fra en række opstrøms signalveje, vigtigst i afhængighed vækstfaktor og stress signalering [17], [21]. For nylig har FOXO faktorer blevet etableret som tumorsuppressorer, fremme transskription af pro-apoptotiske molekyler som FasL og Bim når PI3K /AKT-vejen nedreguleres på grund af næringsstoffer eller serum sult og cellulært stress [22], [23], [24 ]. Triple knockout-musemodeller bevist tumorsuppressoren egenskaber Foxos, såsom mus samtidigt mangler de vigtigste medlemmer af den mammale FOXO underfamilien, FOXO1, FOXO3a og FOXO4, er tilbøjelige til at udvikle hemangiomas og lymfoproliferative sygdomme [25]. Omvendt den enkelte eller parret inaktivering af FOXO1, FOXO3a eller FOXO4 resulterede i en mindre alvorlig fænotype, støtter tanken om funktionel redundans af disse FOXO faktorer [25]. Endvidere tvunget ekspression af FOXO er blevet vist, at inhibere tumorgenese i xenograftmodeller i nøgne mus [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Derfor er reaktivering af FOXO baseret på dens tumorundertrykkende egenskaber betragtes som en meget attraktiv anti-cancer-strategi. Da FOXO proteiner blev rapporteret til at være kritiske formidlere af apoptose induceret af lægemidler mod cancer, vi postuleret, at FOXO udtryk eller transkriptionsaktivitet kunne være vigtig begivenhed i mediere effekten af ​​resveratrol.

Formålet med vores undersøgelse var at undersøge virkninger PI3K /AKT-vejen om regulering af FOXO transkriptionsfaktorer og deres mål genprodukter, og vurdere, om PI3K /AKT /FOXO vej regulerer anti-proliferative effekter af resveratrol i prostata kræftceller. Vores data viste, at hæmning af PI3K /AKT-vejen forbedret FOXO DNA-bindende og transkriptionel aktivitet, hvilket resulterer i reguleringen af ​​sine genprodukter (TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27

/KIP1 og cyklin D1). Hæmning af PI3K /AKT-vejen eller overekspression af FKHR, FKHRL1 og AFX forbedret resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet. I modsætning hertil inhibering af FKHR, FKHRL1 eller AFX blokeret resveratrol-induceret ekspression af TRAIL, DR4, DR5, Bim og p27, og inhiberede ekspression af cyclin D1. Disse data tyder på, at resveratrol inducerer apoptose og vækststandsning ved aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer, og inhibering af PI3K /AKT pathway aktiverer FOXO transkriptionsfaktorer og yderligere forbedrer antiproliferative og proapoptotiske effekter af resveratrol.

Resultater

inhibering af PI3K /AKT pathway forbedrer resveratrol-induceret apoptose i prostatacancerceller

Vi først undersøgt virkningerne af farmakologisk inhibering af AKT af LY294002, Wortmannin eller AKT-inhibitor på resveratrol-induceret apoptose i LNCaP-celler (fig. 1A). Resveratrol-induceret apoptose i LNCaP-celler. Tilsvarende LY294002, Wortmannin eller AKT inhibitoren lidt, men signifikant induceret apoptose. Forbehandling af LNCaP-celler med LY294002, Wortmannin eller AKT-inhibitor væsentligt forbedret resveratrol-induceret apoptose efter 48 timer. Disse data antyder, at inhibering af PI3K /AKT-aktivitet ved farmakologisk tilgang forbedret resveratrol-induceret apoptose.

(A), blev LNCaP-celler forbehandlet med LY294002 (1 uM), Wortmannin (1 uM) eller AKT-inhibitor (100 nM) i 2 timer, efterfulgt af behandling med resveratrol (20 uM) i 48 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev cellerne høstet og apoptose blev målt ved TUNEL-assay. Data repræsenterer gennemsnit ± SE. *, # Og ** = signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05). (B), blev LNCaP-celler transient transficeret med tom vektor, PTEN-WT, PTEN-G129E eller PTEN-G129R. Dyrkningsmediet blev ændret, og celler blev behandlet med eller uden resveratrol (20 uM) i 48 timer, og apoptose blev målt ved TUNEL-assay. Data repræsenterer gennemsnit ± SE. *, **,% Og $ = signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05). (C), blev LNCaP-celler transient transficeret med tom vektor, WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT. Dyrkningsmediet blev ændret, og celler blev behandlet med eller uden resveratrol (20 uM) i 48 timer, og apoptose blev målt ved TUNEL-assay. Data repræsenterer gennemsnit ± SE. *, **, # Og% = signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05). (D), Virkninger af resveratrol på ekspressionen af ​​PI3K, AKT og mTOR pathway. LNCaP-celler blev behandlet med resveratrol (20 uM) til forskellige tidspunkter. Western blots blev udført med anti-phospho-PI3K, phospho-AKT, anti-AKT og phospho-mTOR antistoffer. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. Dataene er repræsentative for tre eksperimenter.

tumorsuppressorgen PTEN er ganske ofte inaktiveret i humane prostatakræft. Inaktivering af PTEN kan forårsage konstitutiv phosphorylering og aktivering af AKT, hvilket fører til øget cellevækst og tumorprogression. Da LNCaP celler udtrykker konstitutivt aktiv AKT, vi søgte at undersøge, hvilken rolle PI3K /AKT-vejen på resveratrol-induceret apoptose. LNCaP-celler blev transficeret med tom vektor eller plasmid, der udtrykker vildtype PTEN, PTEN-G129E, eller PTEN-G129R og inkuberet i nærvær eller fravær af resveratrol (fig. 1B). Resveratrol-induceret apoptose i LNCaP-celler transficeret med tom vektor. Transfektion af LNCaP-celler med vildtype PTEN signifikant forøget resveratrol-induceret apoptose. Overekspression af PTEN-G129E eller PTEN-G129R i LNCaP-celler inhiberede signifikant resveratrol-induceret apoptose end dem transficeret med vildtype PTEN. Disse data antyder, at inhibering af AKT-aktivitet ved overekspression af PTEN forbedrer apoptoseinducerende potentiale resveratrol.

Da overekspression af PTEN forbedrer resveratrol-induceret apoptose, vi reguleret AKT ekspression ved vildtype AKT (WT-AKT), konstitutivt aktiv AKT (CA-AKT) og dominant negativ AKT (DN-AKT). LNCaP-celler blev transient transficeret med tom vektor, WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT og behandlet med eller uden resveratrol (20 uM). Transfektion af LNCaP-celler med tom vektor, WT-AKT eller CA-AKT havde ingen virkning på apoptose (fig. 1C). Resveratrol-induceret apoptose i tom vektor transficerede celler. Overekspression af WT-AKT eller CA-AKT i LNCaP-celler hæmmede resveratrol-induceret apoptose. Overekspression af DN-AKT alene signifikant induceret apoptose. Interessant overekspression af DN-AKT forbedret resveratrol-induceret apoptose. Samlet tyder disse data, at inhibering af PI3K /AKT pathway af genetiske og farmakologiske midler tilstræbe resveratrol-induceret apoptose i prostatacancerceller.

Resveratrol inhiberer phosphorylering af PI3K og AKT

Siden PI3K /AKT pathway hæmmer resveratrol-induceret apoptose, vi søgte at undersøge effekten af ​​resveratrol på phosphorylering af PI3K og AKT (fig. 1D). LNCaP celler blev behandlet med resveratrol og fosforylering af PI3K og AKT blev undersøgt af Western blot-analyse. Resveratrol inhiberede phosphorylering af PI3K og AKT på en tidsafhængig måde. Phosphoryleringen af ​​disse kinaser er afskaffet ved 48 timer. Resveratrol havde ingen effekt på ekspressionen af ​​samlede AKT.

Da mTOR er en ned-strøm af AKT, vi næste forsøgt at undersøge, om resveratrol også regulerer fosforylering af mTOR. Som vist i fig. 1D, resveratrol inhiberede phosphorylering af mTOR. Disse data tyder på, at resveratrol kan inhibere phosphorylering af begge PI3K /AKT og mTOR proteiner, og således spille en vigtig rolle i mediering af anti-apoptotiske virkninger af resveratrol.

Resveratrol har ingen effekt på ekspressionen af ​​FKHR, FKHRL1 og AFX, men inhiberer phosphorylering af FOXO proteiner

PI3K /AKT pathway er blevet vist at regulere phosphorylering af FOXO proteiner [33]. Vi målte derfor ekspressionen af ​​FOXO gener ved RT-PCR, og phosphorylering af FOXO proteiner ved Western blot analyse. Resveratrol havde ingen effekt på ekspressionen af ​​FKHR, FKHRL1 og AFX som målt ved RT-PCR (fig. 2A). Vi næste forsøgt at undersøge, om resveratrol regulerer fosforylering af FOXO proteiner. Som vist i fig. 2B, resveratrol inhiberede phosphorylering af FKHR, FKHRL1 og AFX. Disse data tyder på, at resveratrol kan inhibere phosphorylering af FOXO proteiner, som er nedstrøms for AKT, og dephosphorylering af FOXO af resveratrol kan resultere i sin aktivering via nuklear translokation.

(A), Virkninger af resveratrol på udtryk for FKHR, FKHRL1 og AFX. LNCaP-celler blev behandlet med resveratrol (10 eller 20 uM) til 6, 12 eller 24 timer. Total RNA blev isoleret og RT-PCR-analyse blev udført for at måle ekspressionen af ​​FKHR, FKHRL1 og AFX. (B), Virkninger af resveratrol på phosphoryleringen af ​​FOXO proteiner. LNCaP-celler blev behandlet med resveratrol (20 uM) i 0-48 timer, og Western blot analyser blev udført for at måle ekspressionen af ​​phospho-FKHR, phospho-FKHRL1 og fosfor-AFX. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C), Resveratrol inducerer translokation af FKHR til kernen. LNCaP-celler blev podet i kamre objektglas og transficeret med GFP-FKHR eller GFP-FKHR-TM (phosphorylering deficient tredobbelt mutant). Dyrkningsmediet blev ændret, og celler blev behandlet med eller uden resveratrol (20 uM) i 24 timer. Cellerne blev fikseret, permeabiliseret og farvet med DAPI og visualiseret under et fluorescensmikroskop. grøn farve = FKHR, rød farve = kerne (for klarhed farven på kernen blev ændret fra blå til rød), gul = colokalisering af FKHR til kernen. (D), venstre panel, blev LNCaP-celler behandlet med resveratrol (20 uM) for forskellige tidspunkter (0-24 h). Nukleare ekstrakter blev fremstillet og gelshift Forsøget blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. Bane 1 = sonde kun, banerne 2-9 = resveratrol behandlede prøver, bane 10 = kold sonde (50 ×) og bane 11 = kold SP1 probe. Dataene er repræsentative for tre eksperimenter. Højre panel, LNCaP-celler var ubehandlede eller behandlet med resveratrol (20 uM) i nærvær eller fravær af LY (1 uM) eller AKT-inhibitor (100 nM) i 24 timer. Nukleare ekstrakter blev fremstillet og gelshift Forsøget blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. Bane 1 = sonde kun, bane 2 = kold sonde (50 ×), bane 3 = kold SP1, bane 4 = kontrol, bane 5 = resveratrol, bane 6 = LY, bane 7 = AKT-inhibitor, bane 8 = resveratrol plus LY, bane 9 = resveratrol + AKT-inhibitor. Dataene er repræsentative for tre eksperimenter.

Resveratrol forbedrer translokation af vildtype og mutant FKHR til kernen og forbedrer FOXO-DNA interaktion

Vi næste undersøgte nukleare translokation af FKHR af resveratrol anvendelse af vildtype og mutant GFP-FKHR konstruktioner. LNCaP-celler blev transficeret med enten GFP-FKHR eller GFP-FKHR-TM (tredobbelt mutant) og behandlet med resveratrol i 24 timer (fig. 2C). Translokation af vildtype og phosphorylering deficient mutant FKHR blev observeret ved fluorescensmikroskopi. Resveratrol inducerede den nukleare translokation af både vildtype og mutant FKHR. Den nukleare translokation af FKHR-TM var imidlertid meget højere end vildtype FKHR.

Vi næste undersøgte FOXO-DNA interaktion ved elektroforetisk mobilitet (EMSA). En elektroforetisk mobilitet (EMSA) er en almindelig affinitet elektroforese teknik, der anvendes til at studere protein-DNA-interaktion. Behandling af LNCaP-celler med resveratrol resulterede i forøget FOXO-DNA interaktion (fig. 2D, venstre panel). Inkubationen af ​​kold probe med det nukleare ekstrakt resulterede i reduceret FOXO-DNA bindingsaktivitet. Til sammenligning, inkubationen af ​​ikke-specifik kold SP1 probe havde ingen virkning på FOXO-DNA-binding. Kombinationen af ​​LY294002 eller AKT-inhibitor med resveratrol lidt forbedret FOXO-DNA-bindingsaktivitet, end enkelt middel alene (fig. 2D, højre panel). Samlet set antyder disse data at resveratrol kan forbedre FOXO nuklear translokation og DNA-bindingsaktivitet.

inhibering af PI3K /AKT pathway og phosphorylering deficiente mutanter af FOXO proteiner forbedre resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet

Vi næste undersøgt, om inhibering af PI3K /AKT pathway forbedrer resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet i et luciferasereportergen assay, som måler FOXO funktion (fig. 3A-C). Vi har først taget en farmakologisk tilgang til at inhibere PI3K /AKT-aktivitet ved hjælp Wortmannin, LY-294002, og AKT-inhibitor IV. Wortmannin, LY-294002, AKT-inhibitor IV og resveratrol alene inducerede FOXO transkriptionsaktivitet. Endvidere kombinationsbehandlingen af ​​Wortmannin, LY-294002, eller AKT inhibitor IV med resveratrol yderligere forbedret FOXO aktivitet. Disse data antyder, at inhibering af PI3K /AKT pathway virker synergistisk med resveratrol at inducere FOXO transkriptionel aktivitet.

(A), Farmakologisk inhibering af PI3K /AKT pathway forbedret resveratrol-induceret FOXO aktivitet i LNCaP-celler. LNCaP-celler blev transient transficeret med 6X DBE-luciferase og pRL-TK plasmider i 24 timer, som vi beskrevet andetsteds. Efter transfektion blev celler forbehandlet med Wortmannin (10 uM), LY-294002 (10 uM) eller AKT inhibitor IV (1 uM) i 2 timer, efterfulgt af behandling med eller uden resveratrol (20 uM) i 24 timer. Celler blev høstet for ildflue /Renilla luciferaseassays hjælp af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Luciferase tællinger blev normaliseret ved hjælp af

Renilla

luciferase transfektion kontrol. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. *, #, ** = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), Overekspression af dominant negativ AKT forbedret resveratrol-induceret FOXO aktivitet. LNCaP-celler blev transient transficeret med 6X DBE-luciferase plus pRL-TK plasmider med WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT i 24 timer. Efter transfektion blev celler forbehandlet med resveratrol (20 uM) i 24 timer. Celler blev høstet for ildflue /Renilla luciferaseassays hjælp af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Luciferase tællinger blev normaliseret ved hjælp af

Renilla

luciferase transfektion kontrol. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. *, # Og ** = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), regulering af resveratrol-induceret FOXO aktivitet ved vildtype eller mutant PTEN. LNCaP-celler blev transient transficeret med 6X DBE-luciferase plus pRL-TK plasmider med PTEN-WT, PTEN-G129E eller PTEN-G129R i 24 timer. Efter transfektion blev celler forbehandlet med resveratrol (20 uM) i 24 timer. Celler blev høstet for ildflue /Renilla luciferaseassays hjælp af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Luciferase tællinger blev normaliseret ved hjælp af

Renilla

luciferase transfektion kontrol. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. *, , $ og ** = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (D), phosphorylering deficiente mutanter af FOXO forbedre resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet. LNCaP-celler blev transient transficeret med tom vektor eller konstrukter koder FOXO1-TM, FOXO3a-TM eller FOXO4-TM sammen med 6X DBE-luciferase og pRL-TK plasmider til 24 timer. Efter transfektion blev cellerne vasket, behandlet med resveratrol (20 uM) i 24 timer og høstes til ildflue /Renilla luciferase assays ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Luciferase tællinger blev normaliseret ved hjælp af

Renilla

luciferase transfektion kontrol. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. * Og ** = signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Vi næste undersøgt virkningerne af AKT på resveratrol-induceret FOXO aktivitet i LNCaP celler (Fig 3B.). Den AKT aktivitet blev reguleret af vildtype AKT (WT-AKT), konstitutivt aktiv AKT (CA-AKT) og dominant negativ AKT (DN-AKT). LNCaP-celler blev transient transficeret med tom vektor, WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT og behandlet med eller uden resveratrol (20 uM). Transfektion af LNCaP-celler med tom vektor, WT-AKT, eller CA-AKT havde ingen virkning på FOXO transkriptionsaktivitet. Til sammenligning, transfektion af celler med DN-AKT inducerede signifikant FOXO transkriptionsaktivitet. Resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet i celler transfekteret med tom vektor. Overekspression af WT-AKT eller CA-AKT i LNCaP-celler hæmmede resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet. Interessant overekspression af DN-AKT forbedret resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet. Samlet tyder disse data, at inhibering af AKT-aktivitet ved genetisk fremgangsmåde øger resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet i prostatacancerceller.

Siden LNCaP-celler udtrykker mutant PTEN resulterer i konstitutiv aktivering af AKT, forsøgte vi at undersøge, hvilken rolle af PTEN på resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet (fig. 3C). LNCaP-celler blev transficeret med tom vektor eller plasmid, der udtrykker vildtype PTEN, PTEN-G129E, eller PTEN-G129R og behandlet med eller uden resveratrol. PTEN-wt svagt induceret FOXO transkriptionsaktivitet. Resveratrol-induceret FOXO transkriptionsaktivitet i LNCaP-celler transficeret med tom vektor. Transfektion af LNCaP-celler med vildtype PTEN eller PTEN-G129E signifikant forøget resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet. Til sammenligning overekspression af PTEN-G129R i LNCaP-celler havde FOXO transkriptionel aktivitet svarende til den af ​​resveratrol behandlet LNCaP /tom vektor celler. Disse data antyder, at inhibering af AKT-aktivitet ved overekspression af PTEN forøger FOXO transkriptionsaktivitet.

Vi undersøgte dernæst, om resveratrol inducerer transkriptionel aktivering af FOXO i nærvær eller fravær af FOXO1-TM, FOXO3a-TM eller FOXO4- TM (phosphorylering deficient tredobbelt mutant) (fig. 3D). LNCaP-celler blev transficeret med p6xDBE-luciferase-reporterkonstruktion i nærvær eller fravær af plasmider, der udtrykker FOXO1-TM, FOXO3a-TM eller FOXO4-TM. Efter transfektion blev celler behandlet med resveratrol i 24 timer, og luciferaseaktiviteten blev målt. Transfektion af celler med plasmider, der udtrykker FOXO1-TM, FOXO3a-TM eller FOXO4-TM induceret FOXO transkriptionel aktivitet sammenlignet med den tomme vektor (kontrol). Resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet blev yderligere styrket i tilstedeværelse af phosphorylering mutanter af FOXO1, FOXO3a, og FOXO4. Disse data indikerer, at aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer forbedrer yderligere resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet.

Inhibering af PI3K /AKT pathway regulerer Bim, p27

/Kip1, cyclin D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5

Vi næste undersøgte effekten af ​​at hæmme PI3K /AKT-vejen på ekspressionen af ​​Bim, p27

/Kip1, cyklin D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5. Disse gener er direkte mål for FOXO transskription faktor. LNCaP-celler blev forbehandlet med LY-294002 eller AKT-inhibitor IV efterfulgt af behandling med resveratrol i 24 timer, og ekspressionen af ​​Bim, p27, cyclin D1, TRAIL, DR4 og DR5 blev målt ved Western blotting (fig. 4). LY-294002 og AKT-inhibitor IV inducerede ekspression af Bim, p27

/Kip1, TRAIL, DR4 og DR5, og hæmmede udtryk for cyklin D1. Behandling af cellen med resveratrol yderligere styrket effekterne af LY-294002 eller AKT inhibitor IV på ekspressionen af ​​Bim, TRAIL, DR4 og DR5. Men kombinationen af ​​LY-294002 eller AKT-inhibitor IV med resveratrol ikke havde nogen yderligere effekt på ekspressionen af ​​P27

/KIP1 og cyclin D1. Disse data antyder, at inhibering af PI3K /AKT pathway kan regulere ekspressionen af ​​Bim, p27

/Kip1, cyclin D1, TRAIL, DR4 og DR5, som er transkriptionelle mål for FOXO. Resverarol også regulere ekspressionen af ​​disse FOXO transkriptionelle mål.

LNCaP-celler blev forbehandlet med LY294002 (10 uM) eller AKT-inhibitor (AKT-I, 1 pM) i 2 timer og behandlet med eller uden resveratrol (20 uM) i 48 timer. Celler blev høstet til måling af ekspression af Bim, p27

/KIP1, cyclin D1, TRAIL, DR4 og DR5 af theWestern blot analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Inhibering af FOXO ekspression ved shRNA hæmmer de antiproliferative virkninger af resveratrol og blokeret resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet og apoptose

Hvis resveratrol inducerer apoptose ved aktivering FOXO transskriptionsfaktor, bør inhibering af FOXO proteiner blokere anti-proliferative virkninger af resveratrol. LNCaP-celler blev transficeret med shRNA udtrykkende FKHR, FKHRL1 eller AFX og behandlet med resveratrol (fig. 5). Resveratrol-induceret apoptose i LNCaP /FKHR krypteret, LNCaP /FKHRL1 krypteret og LNCaP /AFX scrambled celler på en dosisafhængig måde (fig. 5A). Inhibering af FKHR, FKHRL1 eller AFX af shRNA blokeret anti-proliferative virkninger af resveratrol. Disse data tyder på, at resveratrol inhiberer cellelevedygtighed gennem regulering af FOXO transkriptionsfaktorer.

(A), Inhibering af FOXO transkriptionsfaktor ved shRNA blokerer anti-proliferative virkninger af resveratrol. LNCaP-celler blev transient transficeret med plasmider, der udtrykker FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA, AFX shRNA eller respektive krypterede kontrol og behandlet med resveratrol (20 uM) i 48 timer, og cellelevedygtighed blev målt. (B), Inhibition af FOXO transkriptionsfaktorer eller ROS (reaktive oxygenarter) efter NAC blokerer resveratrol-induceret apoptose. LNCaP-celler blev transficeret med en blanding af plasmider, der udtrykker FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA plus AFX shRNA eller krypteret kontrol. Efter transfektion blev dyrkningsmediet skiftet, og cellerne blev forbehandlet med NAC i 2 timer og behandlet med resveratrol (20 uM) i 48 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev apoptose målt ved TUNEL-assay. (C), Inhibering af FOXO transkriptionsfaktorer eller ROS af NAC blokke resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet. LNCaP-celler blev transficeret med en blanding af plasmider, der udtrykker FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA plus AFX shRNA eller krypteret kontrol. Efter transfektion blev dyrkningsmediet skiftet, og cellerne blev forbehandlet med NAC i 2 timer og behandlet med resveratrol (20 uM) i 48 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev caspase-3-aktivitet målt som ifølge producentens instruktioner.

Dernæst søgte at undersøge, om inhibering af FOXO ekspression effekt resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet og apoptose (fig . 5B og C). Resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet og apoptose i LNCaP /krypteret celler. Forbehandling af LNCaP /scrambled celler med NAC hæmmede resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet og apoptose. Inhibering af FOXO ekspression ved shRNA hæmmede resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet og apoptose. Interessant forbehandling af LNCaP /FOXO shRNA celler med NAC blokeret resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet og apoptose. Disse data tyder på, at resveratrol-induceret caspase-3-aktivitet og apoptose gennem generering af ROS, og inhibering af FOXO (FKHR, FKHRL1 og AFX) inhiberer caspase-3-aktivitet og apoptose.

Regulering af Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 og cyklin D1 ved FOXO gener (FKHR, FKHRL1 og AFX)

FOXO transkriptionsfaktorer har vist sig at regulere apoptose og cellecyklus-relaterede gener [14], [34]. Da resveratrol reguleret ekspression af Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 og cyklin D1, søgte vi at undersøge, om disse effekter af resveratrol medieres gennem FOXO transkriptionsfaktorer, som blev hæmmet af shRNA (fig. 6). Resveratrol inducerede ekspression af Bim (Bim

EL, Bim

L og Bim

S), TRAIL, DR4, DR5 og p27

/Kip1, og hæmmede udtryk for cyklin D1 i LNCaP /krypteret celler. Inhibering af FKHR, FKHRL1 eller AFX af shRNA svækkede resveratrol-induceret Bim, TRAIL, DR4, DR5 og p27

/Kip1 ekspression. Til sammenligning, inhibering af FKHR, FKHRL1 eller AFX af shRNA lidt svækkede de inhiberende virkninger af resveratrol på cyclin D1-ekspression. Disse data tyder på, at resveratrol kan regulere apoptose (Bim, TRAIL, DR4, DR5 og) og cellecyklus-relaterede gener (p27

/Kip1, og cyclin D1) gennem FOXO transkriptionsfaktorer. Interessant nok vil induktion af TRAIL og dets receptorer DR4 og DR5 efter resveratrol resultere i aktivering af ydre vej af apoptose.

(A), blev LNCaP-celler transficeret med plasmider, der udtrykker FKHR shRNA eller krypteret kontrol. Efter transfektion blev dyrkningsmediet skiftet, og cellerne blev behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev celler høstet til måling af ekspression af Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 og cyclin D1 ved Western blot analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B), blev LNCaP-celler transficeret med plasmider, der udtrykker FKHRL1 shRNA eller krypteret kontrol. Efter transfektion blev dyrkningsmediet skiftet, og cellerne blev behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev celler høstet til måling af ekspression af Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 og cyclin D1 ved Western blot analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C), blev LNCaP-celler transficeret med plasmider, der udtrykker AFX shRNA eller krypteret kontrol. Efter transfektion blev dyrkningsmediet skiftet, og cellerne blev behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer.