PLoS ONE: A Novel Small-Molecule Inhibitor Målretning CREB-CBP Complex Besidder Anti-Cancer effekter sammen med Cell Cycle forordning, Autophagy Suppression og endoplasmatisk reticulum Stress

Abstrakt

lungeadenocarcinom, den mest almindelige undertype af lungekræft, er den førende årsag til kræft død verden over. Trods forsøg til behandling af lungekræft, der er blevet akkumulering, er der stadig behov lovende nye behandlingsformer. Her, vi fandt, at cyklisk-AMP-responselement-bindende protein (CREB) -CREB bindende protein (CBP) transkriptionsfaktorer kompleks inhibitor, Naphthol AS-TR phosphat (NASTRp), er et potentielt terapeutisk middel til lungecancer. Vi viser, at NASTRp hæmmede oncogene celleegenskaber gennem cellecyklusstop med samtidig undertrykkelse af tumor-fremmende autophagy med ned-forskrifter Atg5-12 og Atg7 samt ophobning af P62 i human lunge cancer cellelinjer. Desuden NASTRp induceret ekspression af endoplasmatisk reticulum stress markører, såsom DDIT3 /CHOP, og førte til apoptose sammen med Bim induktion. Disse resultater antyder, at transkriptionsfaktoren /co-aktivator-kompleks, CREB-CBP, kan være en potentiel terapeutisk mål og dets inhibering kunne være et hidtil ukendt terapeutisk strategi til lungekræft

Henvisning:. Lee JW, Park HS, Park SA, Ryu SH, Meng W, Jürgensmeier JM et al. (2015) A Novel Small-Molecule Inhibitor Målretning CREB-CBP Complex Besidder Anti-Cancer effekter sammen med Cell Cycle forordning, Autophagy Suppression og endoplasmatisk reticulum Stress. PLoS ONE 10 (4): e0122628. doi: 10,1371 /journal.pone.0122628

Academic Redaktør: Hyun-Sung Lee, Baylor College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juli 17, 2014 Accepteret: 23 februar 2015; Udgivet: 21 April, 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute tilskud R01-CA126801 (JSK), en pilot Grant fra Yale Comprehensive Cancer center (JSK), og National Cancer Institut cancer center Support Grant CA-16359 (til Yale Comprehensive cancer center)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende årsager til dødelighed af kræft i hele verden, og det anslås, at 159.480 lungekræft patienter vil dø i USA i 2013 [1]. Ca. 25% af lunge adenokarcinomer, en dominerende form for lungekræft havnen onkogene

KRAS

mutationer, og dette udgør en betydelig terapeutisk udfordring, som

KRAS

mutationer er generelt forbundet med dårlig prognose og modstandsdygtighed over for kemoterapi [2, 3]. Direkte farmakologisk målretning af aktiverede KRAS mutant protein har tabt sagen hidtil, således, alternative tilgange til at blokere KRAS aktivering signalvej er under overvejelse. Især mutant KRAS drev aktivering af cyklisk-AMP-responselement-binding (CREB) gennem RAF /MEK /ERK signalvej at tvinge kræft cellevækst og overlevelse. Således kan en af ​​mulighederne for at inhibere væksten af ​​KRAS muterede tumorer være at målrette transkriptionsfaktorer (fx CREB), som ofte er den endelige regulator af flere signaleringsprocesser, og kan potentielt målrettes uanset ændringer af opstrøms signalsystemer komponenter involveret i udvikling af cancer, progression og invasion /metastase.

CREB er en kritisk transskription faktor involveret i normal homøostase [4-6], metabolisme [7], hukommelse /læring [8], flere kræftformer [9-12] og immunsygdomme [13]. Vores tidligere undersøgelser viste, at CREB er stærkt opreguleret og hyperphosphoryleret i de fleste af de ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tumorprøver og at denne opregulering er signifikant forbundet med dårlige overlevelsesrater [10-12]. CREB phosphoryleres ved serin /threoninrester afhængigt af stimuli fra ekstracellulære komponenter og flere opstrømskinaser. Aktiveret /phosphoryleret CREB rekrutterer dens transkription co-aktivator, CREB-bindende protein (CBP) til en cAMP-responselementet (CRE) region af målgener [14]. Denne rekruttering af CBP er et afgørende skridt for den transkriptionelle aktivering af CREB [15]. Derfor blokerer interaktionen mellem CREB-CBP kan være en tilgang til at inhibere CREB transkriptionel aktivitet. Faktisk, identifikation af småmolekyleinhibitorer forstyrrer dannelsen af ​​CREB-CBP-komplekset gennem målrette KID og KIX domæner CREB og CBP henholdsvis er blevet rapporteret ved brug af en NMR-screening tilgang [16]. Desuden har vi tidligere vist, at en af ​​disse inhibitorer, 2-Naphthol-AS-E phosphat (KG-501), som direkte er rettet mod KIX domæne af CBP, resulterede i et afbrudt CREB-CBP-komplekset, inhiberede CREB-målgen induktion og inhiberede IL-1β-medierede angiogen aktivitet i NSCLC [10].

med det formål at forbedre terapeutiske forsøg for lungekræft huser KRAS mutant, fandt vi en multi-funktionel transskriptionsfaktor inhibitor navngivet Naphthol AS-TR phosphat (NASTRp), rettet mod CREB-CBP-komplekset, som en kraftig anti-cancer agent for lungekræft. Kollektivt viste NASTRp klar effekt i flere biologiske assays og kunne og vil være en potentiel terapeutisk tilgang for humane kræftformer, især for lungekræft.

Materialer og metoder

Cell kultur

human lunge cancercellelinjer, A549, NCI-H1734, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H23, NCI-H1975 og NCI-H520-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) . Normale humane tracheobronkiale epitel (NHTBE) -celler blev opnået fra Lonza (Walkersville, MD, USA). Cellelinjer blev passeret i mindre end 6 måneder efter genoplivning og blev ikke godkendt. Alle cancercellelinier blev holdt under 5% CO

2 ved 37 ° C i RPMI-1640-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 1% Antibotic-antimykotisk (anti-anti, Life Technologies). NHTBE celler blev dyrket i BEBM suppleret med vækstfaktorer og hormoner, som Fabrik (Lonza), og tre-demensional organotypisk luft-væske-grænsefladen (ALI) cellekultur metode blev anvendt til NHTBE cellekultur, som tidligere beskrevet [5, 17-19 ]. HEK293T celler blev holdt i DMEM-medium suppleret med 10% FBS og 1% anti-anti.

proliferation, kolonidannelse og blød agar-assays Salg

Celler blev podet i plader med 96 brønde ved 2 x 10

3 celler /brønd med RPMI-1640-medium suppleret med 5% varmeinaktiveret FBS og uden anti-anti. Cellerne blev behandlet med Naphthol AS-TR fosfat dinatriumsalte (NASTRp, Sigma-Aldrich, N6125) som 0-80 mmol /l i 96 timer. Celleproliferation blev målt med MTT eller CellTiter Glo levedygtighed luminescerende celleassay (Promega, Madison, WI, USA). Cellelevedygtighed af vehikelbehandlede celler blev sat til 100% af proliferation. For kolonidannelse assayet blev celler podet i plader med 6 brønde ved 1 x 10

3 celler /brønd. Celler blev behandlet med NASTRp som 0, 5, 10, og 20 pmol /L og blev ændret med friske medier indeholdende NASTRp hver anden dag i 10-17 dage, på hvilket tidspunkt 0,1% (vægt /volumen) krystalviolet (Thermo Scientific, NJ , USA) blev anvendt til at visualisere kolonier. Blød agar-assay blev udført som tidligere [12] beskrevne. Kort fortalt blev kolonierne farvet med p-iodonitrotetrazolium violet (Sigma-Aldrich) til at vælge alive kolonier og derefter, blev farvet kolonier talt under anvendelse Billede J software (NIH, USA). En koloni blev defineret som noget, der indeholder mere end 10 celler, som angivet 50 pixels i billede J.

Kvantitativ revers transkription-PCR

QRT-PCR-analyse blev udført som beskrevet tidligere [11 ]. Kort fortalt blev Totalt RNA oprenset fra celler under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Revers transkription af totalt RNA blev udført under anvendelse af MMLV revers transkriptase (Promega). Kvantitativ PCR blev udført ved anvendelse af SYBR Green PCR Core Reagents (Applied Biosystem, Life Technologies). Alle primere blev indkøbt fra Keck (New Haven, CT, USA). Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer og ribosomale protein L32 cDNA niveauer blev anvendt som en endogen kontrol. Primersekvenserne anvendt i QRT-PCR var som følger: cyclin A2; forward; 5′-CCAAGAGGACCAGGAGAATA-3 ‘, omvendt; 5’-CGGTGACATGCTCATCATT-3 ‘, cyklin B1; forward; 5’-AGTCACCAGGAACTC GAAAA-3 ‘, omvendt; 5’-GTTACCAATGTCCCCAAGAG-3 ‘, cyklin D1; forward; 5’-CTTC AAATGTGTGCAGAAGG-3 ‘, omvendt; 5’-AGCGGTCCAGGTAGTTCAT-3 ‘; Cyclin E2; forward; 5’-AGAGAGGAGGTCACCAAGAAA-3 ‘, omvendt; 5’-CAGGCAAAGGTGAAGGAT TA-3 ‘, GRP78; forward; 5’-CACAGTGGTGCCTACCAAGA-3 ‘, omvendt; 5’TGTCTTTTGTC AGGGGTCTTT-3 ‘, CHOP; forward; 5’-AGCCAAAATCAGAGCTGGAA-3 ‘, omvendt; 5’-TGG ATCAGTCTGGAAAAGCA-3 ‘, IRE1; forward; 5’-CTCTGTCCGTACCGCCC-3 ‘, omvendt; 5’GAAGCGTCACTGTGCTGGT-3 ‘, kvikke; forward; 5’-TCATCCAGCCTTAGCAAACC-3 ‘, omvendt; 5’-ATGCTTTCACGGTCTTGGTC-3 ‘, ATF6; forward; 5’-GCAGAAGGGGAGACAC attt-3 ‘, omvendt; 5’-TTGACATTTTTGGTCTTGTGG-3 ‘, XBP1; forward; 5’-CGAATGAG TGAGCTGGAACA-3 ‘, omvendt; 5’-GGCCATGAGTTTTCTCTCGT-3 ‘, L32; forward; 5’-CAC CAGTCAGACCGATATGT-3 ‘, omvendt; 5’-ACGTTGTGGACC AGGAACT-3 ‘. Real-time PCR dataanalyse blev udført ved anvendelse af sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode iCycler termiske cykler analysator program (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Database forberedelse, søgning og molekylær docking modellering

Alle modellering beregninger blev udført på en fire-processor MIPS R16000 Silicon Graphics Tezro kører Sybyl 7.1 modellering suite. De strukturelle databaser, der indeholder over 600.000 strukturer, der består af tilgængelige forbindelser fra næsten 50 kommercielle leverandører af kemiske databaser [20]. Sammensatte biblioteker blev modtaget i SDF filformatet [21] og en todimensionel lighed søgning blev kørt på hver database udnytte DB søgning kommando. De fremkomne hitlister blev kombineret sammen til en fælles hit liste med tredimensionelle (3D) SLNs. Den DBslnfilter blev brugt til at filtrere strukturer, der indeholder følgende egenskaber: blandinger, metaller, isotoper, ingen 3D koordinater, MW 100, eller MW 500. Hitlisten Manager blev anvendt til at fjerne alle forbindelser undtagen dem, der indeholder carboxylater, fosfater og sulfonamider. KIX domæne koordinater blev opnået ved midling af NMR-strukturer af KIX domæne (PDB ID: IKDX). KIX og NASTRp koordinere blev genereret ved hjælp phenix.elbow [22]. Docking beregninger blev udført ved anvendelse af HEX 6.3 [23]. Korrelationen type, der anvendes i docking er “Shape + Electrostatistics”. Forbindelsen lighed screening blev udført ved anvendelse pubchem Forbindelser.

Flowcytometrisk analyse og apoptose-assay

Flowcytometri og TUNEL assays blev udført som tidligere [12] beskrevne. NCI-H441 humane lungeadenocarcinoma celler blev behandlet med NASTRp efterfulgt farvning med PI /RNase-farvning buffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Cellecyklusfordeling blev analyseret ved BD LSRII flowcytometer (BD Biosciences) og FlowJo software (Treestar, Ashland, OR, USA). For TUNEL-assayet blev A549 humane lunge-adenocarcinom-celler behandlet med NASTRp i 48 timer og fulgte farvning med ApopTag Fluorescein Direkte in situ Apoptosis Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Immunobloting, co-immunopræcipitation og immunofluorescensassays

Natriumdodecylsulfat- polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og western blotting blev udført for at analysere ekspression af forskellige proteiner. Cellelysater blev lyseret ved RIPA-lysepuffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% SDS, 1% Sodium deoxycholat, 1% NP-40) suppleret med Complete EDTA -fri protease og phosphatase hæmmere cocktails (Roche, South San Francisco, CA, USA) og underkastet immunoblotting under anvendelse af forskellige antistoffer. Følgende antistoffer blev anvendt: anti-cyclin A2 (# 4656), anti-cyclin B1 (# 4138), anti-cyclin E2 (# 4132), anti-LC3B (# 3868), anti-ATG7 (# 8558), anti -ATG5 (# 12994), anti-GRP78 /Bip (# 3177), anti-Caspase 3 (# 9665), anti-spaltet Caspase 3 (# 9579), anti-Phospho-CREB (S133; # 9198) og anti Bim (# 2933) fra Cell Signaling Technology, anti-cyclin D1 fra Epitomics (# 2261-1, Burlingame, CA, USA), anti-P62 /SQSTM1 fra Amerika Research Products (03-GP62-C, Waltham, MA, USA ), anti-CHOP fra Novus Biologicals (NBP2-13172, Littleton, CO, USA), anti-β-actin og anti-FLAG fra Sigma-Aldrich (A2228). For co-immunoprecipiation assay, HEK293T celler cotransficeret med pcDNA3-HA-KIX (CBP, aminosyrer 586-666) og pcDNA3-Myc-KID (CREB, aminosyrer 87-146 fra udskrift variant A) ved hjælp af Lipofectamine 2000 ( Life Technologies). 48 timer efter transfektion blev celler forbehandlet med NASTRp i 3 timer efter 10 pM forskolin (Sigma-Aldrich) indgivelse i yderligere 1 time. Cellelysater blev fremstillet med IP puffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10% glycerol, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100) suppleret med Complete EDTA-fri protease og phosphataseinhibitorer cocktails. Forud renset lysater blev underkastet immunpræcipitation under anvendelse af anti-HA monoklonale museantistof (MMS-101P, Covance, Princeton, NJ, USA) med konjugeret protein A /G PLUS-agarose (sc-2003, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Brug af Flag-CREB1 stabilt udtrykker 293T-celler, blev disse stabile celler transficeret med pcDNA3-HA-KIX efterfulgt behandlinger af forskolin eller NASTRp som beskrevet ovenfor. Immunkomplekser af pull-down med anti-Phospho-CREB-antistof blev underkastet SDS-PAGE og western blot. For immunfluorescens assay blev A549 humane lunge adenocarcinom cellelinier behandlet med de angivne koncentrationer i 24 timer og fulgte fiksering med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Fikserede celler blev permeabiliseret med 50 mg /ml digitonin i PBS (D141, Sigma-Aldrich) for yderligere 10 min. Blokerede celler med 3% bovint serumalbumin (BSA, A9647, Sigma-Aldrich) blev probet med primære antistoffer og fulgte konjugation med Alexa Fluor 488 og 568 æsel-anti-kanin IgG-antistoffer (Life Technologies), for P62 /SQSTM1 og CHOP henholdsvis . Farvede celler blev monteret med Prolong Guld antifade Reagens med DAPI (Life Technologies) og fulgt observation under fluorescens mikroskop (Olympus America Co, Center Valley, PA, USA).

Kaplan-Meier Plotning analyse

for at analysere sammenhængen mellem patient overlevelse i lunge adenocarcinom og udtryk for autophagy protein, såsom ATG7 (Affymetrix ID: 218670_s_at), ATG5 (210639_s_at) eller P62 /SQSTM1 (201471_s_at), vi vedtog databaser resultater fra Kaplan-Meier Plotter (https://www.kmplot.com) [24] med kriterierne; (1) samlet overlevelse (OS), (2) split patienter med median, (3) at følge op tærskel som 9, (4) Histologi som adenocarcinom, (5) Cox regression som uni-variate og (6) matrix kvalitetskontrol udelukkede forudindtaget arrays.

statistiske Analyser

Hvert forsøg blev gentaget mindst tre uafhængige gange. For generering af grafer og statistiske analyser blev Graph Pad Prism software (V.6), der anvendes.

P

værdier mellem grupperne blev bestemt ved en to-haler uparret Student

t

tests.

Resultater

Identifikation af naphthol analoger som CREB-CBP transskription faktor /co-aktivator komplekse hæmmere

Vi har tidligere vist, at CREB er en kritisk transskription faktor i udviklingen af ​​lungekræft gennem sit engagement i celle overlevelse, cellecyklus progression, proliferation og apoptose regulering [5, 6, 10- 12]. Vi foreslog først at CREB kunne være et molekylært mål til forebyggelse og behandling af NSCLC [11]. Faktisk demonstrerede vi, at CREB regulerer IL-1-regulerede CXC chemokiner, kritiske for cellevandring og angiogenese i NSCLC hjælp KG-501 [10]. Således er disse undersøgelser fører til rationalet for identifikation af småmolekylære inhibitorer er målrettet CREB transkriptionel aktivitet beskrevet i denne undersøgelse. For at identificere bedre forbindelser, oprindeligt udvalgte vi i alt 4.547 forbindelser, som bestod af en todimensional lighed afskæring på 80% under anvendelse af KG-501 struktur som en forespørgsel. Da phosphat i KG-501 struktur blev anset for at være et vigtigt element, ved leasing en del, for dets opløselighed, markeringen blev derpå yderligere raffineres for at sikre forbindelserne indeholdt grupper, der anses for at være ækvivalent med phosphat og dette resulterede i en 67 kandidatforbindelser. Af disse identificerede vi 6 forbindelser med naphthol analoger, der har anti-cancer effekt, som vist fig 1A.

(A) Kemiske strukturer af s_elected naphthol analoger. (B) Inhiberende virkning af naphthol analoger på cellevækst i NCI-H1734 lungeadenocarcinom cellelinie. Cellernes levedygtighed efter 96 timer efter behandlingerne blev målt ved MTT-assay med absorbans ved 590 nm. Forsøgene blev triplikerede og gentaget mindst tre gange.

For at bestemme om kandidatforbindelser har anti-cancer virkning, den humane lunge adenocarcinom cellelinie NCI-H1734, blev udsat for forskellige koncentrationer af 6 udvalgte forbindelser. Alle forbindelser udviste inhiberende virkning på celleproliferation som vist ved IC50’er (Fig 1B). Af disse NASTRp var den mest potente stof i disse proliferationsassays som vist:. IC50 = 3,701 mmol /l

Vi næste gennemførte docking simulering og beregning med NASTRp og KIX domæne af CBP som ligand og receptor, henholdsvis . Resultatet viser, at NASTRp er tæt på Arg-600 i KIX domæne af CBP, en kritisk rest for CREB-CBP-interaktion, i overensstemmelse med KG-501 (S1A Fig;. Ref [17]). Vi yderligere observeret, at NASTRp helt afskaffet ikke kun samspillet mellem KIX og KID i co-transficerede HEK293T celler, men også samspillet mellem phosphoryleret fuld længde CREB og KIX i Flag-tagget CREB stabilt udtrykke 293T cellsby co-immunopræcipitationsanalyser (S1B og S1c fig). Derfor NASTRp blev udvalgt og undersøgt i yderligere biologiske assays er beskrevet i dette dokument.

Anti-cancer effekter af NASTRp i human lunge cancer cellelinjer

For at bestemme den anti-cancer effiect af NASTRp, flere lungekræft cellelinier blev udvalgt til celleproliferationsassay. Oprindeligt valgte vi celler huser

KRAS

mutationer; A549 (KRAS-G12S), NCI-H1792 (KRAS-G12C), NCI-H441 (KRAS-G12V), og NCI-H1734 (KRAS-G13C). For at bestemme den inhiberende virkning på celleproliferation blev hver cellelinie udsat for forskellige doser af NASTRp. I overensstemmelse med den anti-proliferative effekt af NASTRp i NCI-H1734-celler, som vist i fig 2A, NASTRp dramatisk undertrykt celleproliferation i alle lungekræft cellelinier med

KRAS

mutationer vi afprøvet (IC50 = A549, 3,574 pM; NCI-H1792, 11,769 uM; NCI-H441, 11,074 uM; NCI-H1734, 4,025 uM). I betragtning af den kraftige hæmmende virkning på celleproliferation af NASTRp, vi udvidede lungekræft celler til lungekræft cellelinier huser

EGFR

mutationer, NCI-H1975 (EGFR-L858R /T790M) og en planocellulært karcinom med yderst udtrykker FGFR og CREB, NCI-H520 (IC50 = NCI-H1975, 8,891 pM; NCI-H520, 4,363 pM;. ref [11]). Vi observerede også, at NASTRp signifikant inhiberede cellevækst i lavt serum indeholdt tilstand under behandlingen (S2 Fig). Vi fandt, at NASTRp viste signifikant anti-proliferativ virkning på afhandlinger lung cancercellelinier uanset dets genetiske mutation status.

(A) Inhiberende virkning af NASTRp på celleproliferation i humane lunge cancercellelinier. A549, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H1734, NCI-H1975 og NCI-H520-cellelinjer blev behandlet med forskellige koncentrationer af NASTRp i RPMI medium suppleret med 5% FBS i 96 timer. Celleproliferation blev vurderet ved CellTiter Glo assay som beskrevet i FREMGANGSMÅDER. (B) Low density kolonidannelse assayet med NASTRp behandling. Celler blev udpladet som encellede kulturer og behandlet med forskellige koncentrationer af NASTRp lov til kultur indtil store kolonier var synlige. Kolonier blev farvet med krystalviolet og fotograferet at tælle. (C) Undertrykkelse af Anchorage uafhængig vækst ved NASTRp. Celler blev udpladet med lav densitet af agarose (0,4%) indeholdende forskellige koncentrationer af NASTRp. NCI-H1734 celler blev vist som repræsentative billeder af blød agar assay. Data er præsenteret som middelværdi ± SD af tredobbelte brønde. *

P

0,05 versus køretøj.

Dernæst vi karakteriseret om NASTRp påvirker kolonidannelse og forankring uafhængig cellevækst. I overensstemmelse med den inhiberende virkning af NASTRp på celleproliferation blev koloni-nummeret på alle lungecancerceller dramatisk faldt med NASTRp behandling i forankringsafhængige og uafhængig cellevækst (figur 2B og 2C, S3 Fig). For at afgøre, om anti-cancer effekt af NASTRp er specifik for lungekræft, vi gennemførte lignende celleproliferation og kolonidannelse analyser i bugspytkirtlen og bryst kræftceller. Vi observerede de inhiberende virkninger af NASTRp på celleproliferation og kolonidannelse i bugspytkirtelkræftceller (Panc-1, aspC-1 og SU.86.86.) Og brystcancerceller (MCF-7, MDA-MB-231 og SKBR3) samt (S4 fig). Således er disse resultater antyder, at NASTRp inhiberer celleproliferation, kolonidannelse, og forankringsuafhængig vækst i humane cancerceller, herunder mindst, lunge, pancreas og brystcancercellelinier.

Induktion af standsning af cellecyklus gennem nedregulering af cykliner af NASTRp

Det er påvist, at CREB regulerer cellecyklusprogression via opregulering af cyclin proteiner inklusive cyclin D1 og cyclin A2, som indeholder CRE elementer i deres promotorregioner [25, 26] . Vi bekræftede også, at cycliner indeholder CRE elementer i deres promotorer ved sekvens-baseret analyse ved hjælp af offentlige databaser (fx BioBase eller TESS). Som vist i fig 3A, cyclin A2, B1, D1, og E2 indeholder formodede CRE regioner i deres promotorer. For at afgøre om et CREB-hæmmer, NASTRp faktisk nedregulerer cyclines undersøgte vi ekspressionsniveauerne af cellecyklus-relaterede cycliner under NASTRp behandling ved QRT-PCR og Western blot-analyser. Som vist fig 3B og 3C, NASTRp dramatisk nedreguleres udtrykkene for cycliner herunder cyclin A2, B1, D1 og E2 på mRNA og protein niveauer. Desuden NASTRp reduceret population af celler i S-fase cellecyklus og førte til standsning af cellecyklus ved G1 og G2 faserne i NCI-H441 celler (fig 3D). Disse data indikerer, at NASTRp undertrykker NSCLC celleproliferation, i det mindste delvis gennem nedregulering af vigtige regulatorer af cellecyklus, cycliner.

(A) CRE i promotorerne af cyclin-gener. Sekvensanalyse af initiativtagerne til generne angivet de potentielle bindingssteder for CREB-CBP. (B og C) Effekt af NASTRp af ekspressionen af ​​cycliner i RNA (B, QRT-PCR) og protein (C, Western blot) i A549 (venstre), NCI-H1792 (midten) og NCI-H441 (højre). Vehikelkontrol er sat til 1 i QRT-PCR-assay. For QRT-PCR-data er repræsenteret som gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. *

P

0,05 versus vehikel. (D) NCI-H441-celler blev behandlet med 10 pM NASTRp i 24 timer og cellecyklusfordeling blev bestemt ved propidiumiodidfarvning efterfulgt af FACS-analyse.

Suppression af autofagi og induktion af ER stress og celle døden ved NASTRp

Interessant vi observeret flere vacuole-lignende strukturer i cytosolen i NASTRp-behandlede celler. Vores hypotese derefter at NASTRp kan undertrykke cytobeskyttende autofagi modvirke en tumorfremmende rolle at fungere som et anti-cancer lægemiddel. Autophagy er ofte betragtes som en alternativ kilde til ernæring for overlevelse kræftceller, når de er under begrænset udbud vækst. Således har vi undersøgt Autophagy markører, såsom LC3B modifikation og P62 /SQSTM1 nedbrydning under NASTRp behandling i humane NSCLC-celler. Notatet, P62 er et centralt molekyle styre autophagic clearance af polyubiquitinated proteiner gennem direkte binding til LC3 i autophagosomes [27]. Defekt i autophagy forårsager ophobning af P62, ubiquitin konjugerende proteinaggregater og beskadigede organeller især mitokondrier [28, 29].

Vi fandt, at i alle cellelinjer undersøgt, P62 dramatisk akkumuleret som følge af NASTRp behandling i en dosis -afhængig måde (figur 4A). Mens andre kritiske autofagi relaterede proteiner, herunder ATG7 og ATG5-12 konjugering niveauer blev signifikant reduceret efter NASTRp behandling, hvilket indikerer en undertrykkende effekt af NASTRp på autofagi (Fig 4A). Endvidere NASTRp blokeret den basale autofagi flux som vist ved ingen ændring af LC3B ændring eller P62 nedbrydning i nærvær af bafilomycin A1 (en V-ATPase-inhibitor), som blokerer de sene trin med autofagi (Fig 4B).

(A) Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af NASTRp i RPMI-1640 medium suppleret med 5% FBS i 24 timer. Cellelysater blev underkastet western blot-assay med de angivne antistoffer. (B) Inhibering af autophagy flux af NASTRp. NCI-H441-celler blev behandlet med 20 pM NASTRp i nærvær eller fravær af bafilomycin A1 (100 nM) i 24 timer. Cellelysater blev underkastet SDS-PAGE /Western blot-analyse under anvendelse af de angivne antistoffer. (C) Ophobning af P62 aggregater af NASTRp. A549-celler blev behandlet med 20 pM NASTRp i 24 timer. Behandlede celler var fulgt immunfluorescensfarvning med anti-P62-antistof. Målestokken: 10 um. (D) Potentiel kliniske fordel ved NASTRp i lungeadenocarcinom patienter. Kaplan-Meier overlevelseskurver for humane lunge adenocarcinom datasæt, som sammenligner den samlede overlevelse mellem tumorer med høje niveauer (rød) eller lave niveauer (sort) af ATG7 (venstre panel), ATG5 (midterste panel) og P62 /SQSTM1 (højre panel) genekspression fra Kaplan-Meier Plotter værktøj. Log-rank

P

værdier er vist.

ophobning af P62 blev yderligere bekræftet celler ved hjælp immunfluorescens i A549. I overensstemmelse med immunobloting resultat, P62 aggregater ( 2-4 um) steg betydeligt i cytosolen efter NASTRp behandling i forhold til køretøjet (fig 4C). Disse resultater er i overensstemmelse med den hypotese, at NASTRp kan undertrykke tumorfremmende /cytobeskyttende autofagi mindste delvis gennem ATG7 nedregulering og blokering autofagi flux som vist ved akkumulering af LC3B-II og P62.

Da sammenhængen mellem patient overlevelse i lunge adenocarcinom og udtryk for autofagi proteiner, såsom ATG7, ATG5 eller P62 er endnu ikke blevet rapporteret, vi næste gennemført en overlevelse analyse af lunge adenocarcinom patienter scorede for

ATG7

,

ATG5

eller

P62

mRNA udtryk ved hjælp af offentlige databaser. I

ATG7

-relaterede database (ID: 218673_s_at), er der 242 (49,8%) tilfælde til høje sager

ATG7

udtryk og 244 (50,2%) for lav

ATG7

ekspression. Kaplan-Meier overlevelse analyse viser, at patienter, der huser lav

ATG7

udtryk havde en signifikant forbedret overlevelse sammenlignet med dem med høj

ATG7

udtryk (figur 4D, top,

P

= 2.7e-06). De patienter med lav

ATG5

udtryk havde bedre overlevelse i overensstemmelse med den

ATG7

sager (Fig 4D, midten,

P

= 1.1E-08). I modsætning hertil patienter med forhøjet ekspression af

P62

havde signifikant bedre overlevelse resultat sammenlignet med de patienter med lav

P62

ekspression (Fig 4D, bund,

P

= 9,7 e-07).

Det er blevet rapporteret, at defekte autophagy gennem nedreguleret ATG7 resulterede i forhøjet eR stress i metabolisk leversygdom [30]. I betragtning af den undertrykkelse af ATG7 af NASTRp, vi undersøgte yderligere udtryk for ER stress markører, såsom GRP78, CHOP, IRE1, PERK, ATF6 og XBP1, at afgøre, om NASTRp inducerer ER stress i lunge kræftceller. Som vist i fig 5A, NASTRp inducerede ER stress og aktiveret udfoldet protein reaktion (UPR), fremgår af den opregulering af GRP78 [31] og CHOP. Desuden ekspressionsniveauerne af andre gener relateret til ER stress, såsom IRE1, ATF6, PERK og XBP1 steg også efter NASTRp behandling i humane cancerceller (fig 5A). Vi bekræftede, at NASTRp opreguleres niveauet af GRP78 og hak proteiner i en tid og dosisafhængige måder (fig 5A og 5B) og observeres en dramatisk forøgelse af CHOP-ekspression i kernen (Fig 5C). ER stress blev uovervindelige i nærvær af NASTRp og førte til celledød som vist ved øgede spaltede caspase-3, Bim ekspressions- og TUNEL-positive prikker (fig 5B og 5D).

(A) QRT-PCR analyse af biomarkører for ER stress /UPR beslægtede gener i NCI-H441 behandlet med 20 pM NASTRp i tidsforløbet måde. (B) NASTRp inducerede ER stress og aktiveret UPR førte til apoptose med Bim induktion i NSCLC-cellelinier. Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af NASTRp i 24 timer og cellelysater blev underkastet SDS-PAGE /Western blot-analyse under anvendelse af de angivne antistoffer. (C) opregulering af CHOP af NASTRp. NCI-H441-celler blev behandlet med 20 NASTRp for 0-24 timer. Ved de angivne tidspunkter blev cellerne fikseret og udsat for immunfluorescens-assay med anti-CHOP-antistof. Cell billeder blev microphotographed under anvendelse af fluorescensmikroskopi ved 60X forstørrelse. Scale barer: hvid; 10 um. (D) TUNEL-positive celler i NASTRp-behandlet (for 48 timer) A549-celler blev talt og analyseret som relativ% af TUNEL-positive celler. *

P

0,05 versus køretøj.

Vi derefter evaluerede on target-effekt af NASTRp hjælp normal menneskelig tracheobronchial epitelial (NHTBE) celler i to-dimensionelle (regelmæssig vævskultur tilstand) og tre-dimentsional organotypisk (luft- væskegrænsefladen dyrkningsbetingelser; ALI) kultursystemer [5, 17-19]. Selv om der var mindre dræbende virkning af NASTRp på NHTBE celler blev cellelevedygtighed ikke faldet mindre end 50%, endnu 20 uM NASTRp behandling (Fig 6A og 6B). Ud fra følgende betragtninger P62 blev akkumuleret i lungekræft celler, P62 i NHTBE celler var uforanderlig efter NASTRp behandling (Fig 6C). Disse data indikerer, at NASTRp specifikt kan målrette til kræft celle snarere end normale celler, især inden terapeutiske vindue intervaller. Taget sammen antyder disse resultater, at NASTRp undertrykker tumor-fremmende rolle autophagy gennem ATG7 nedregulering og P62 akkumulering, inducerer ER stress med aktivering af UPR, og i sidste ende fører til celledød i humane NSCLC-celler (Fig 6D).

(A) Cellelevedygtighed assay som reaktion på NASTRp af NHTBE celler. (B) NHTBE celler, der blev dyrket i 3D organotypisk luft-væske-grænsefladen (ALI) system under NASTRp behandling. NHTBE celler blev behandlet med 10 pM NASTRp i 96 timer. Repræsentative billeder blev opnået ved hjælp af fase-kontrast lysmikroskopi. (C) Uændret P62 niveau i NASTRp behandlet NHTBE celle. NHTBE celler blev behandlet med de angivne doser af NASTRp i 24 timer.