PLoS ONE: ER-α36, en Variant af ER-α, Fremmer tamoxifen Agonist Action i endometriecancer Cells via MAPK /ERK og PI3K /Akt Pathways

Abstrakt

Baggrund

For nylig en hidtil ukendt variant af eR-α, blev eR-α36 identificeret og klonet. ER-α36 mangler iboende transkription aktivitet og hovedsagelig medierer ikke-genomisk østrogen signalering. Her studerede vi den rolle, ikke-genomisk østrogen signalveje medieret af ER-α36 i tamoxifen modstand og agonist handling.

Metode

Den cellulære lokalisering af ER-α36 blev undersøgt ved immunfluorescens i MCF- 7-celler og Hec1A celler. MCF-7 brystcancerceller, MCF-7-celler der udtrykker rekombinant ER-α36 (MCF-7 /ER36), Hec1A endometrisk cancerceller og Hec1A celler med siRNA knockdown af ER-α36 (Hec1A /RNAiER36) blev behandlet med 17β-estradial ( E2) og tamoxifen (TAM) i fravær og tilstedeværelse af kinase inhibitor U0126 og LY294002. Vi undersøgte phosphorylering af signalmolekyler og ekspressionen af ​​c-myc ved immunoblotting, og tumorcellevækst ved MTT-assayet.

Konklusioner Salg

ER variant ER-α36 forøger TAM agonistaktivitet ved aktivering af membran-initieret signalveje i endometriecancer, og at eR-α36 er involveret i

de novo

og erhvervet TAM resistens i brystkræft

Henvisning:. Lin SL, Yan LY, Zhang XT, yuan, J., Li M, Qiao, J., et al. (2010) ER-α36, en Variant af ER-α, Fremmer tamoxifen Agonist Action i endometriecancer Cells via MAPK /ERK og PI3K /Akt Pathways. PLoS ONE 5 (2): e9013. doi: 10,1371 /journal.pone.0009013

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: 11. december 2009; Accepteret: 13 januar 2010; Publiceret: 2 feb 2010

Copyright: © 2010 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttes af nationale Basic Research Program Kina (2006CB504004, 2006CB944005). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tamoxifen er en selektiv østrogenreceptormodulator (SERM) med blandet agonist /antagonist-aktiviteter, der i vid udstrækning er blevet anvendt som en effektiv behandling af alle stadier af østrogenreceptoren (eR) -positiv brystcancer [1]. Tamoxifen undertrykker tilbagefald af brystkræft og reducerer forekomsten af ​​kontralateral brystkræft med 49% [2]. Tamoxifen er også blevet anvendt som et kemoforebyggende middel i kvinder, der har høj risiko for brystkræft [3]. Det menes, at tamoxifen virker som en antagonist ved at konkurrere med østrogener for ligandbindingsdomænet af ER og derved hæmmer ER-medieret mitogen østrogen signalering [4]. Men den største hindring for tamoxifen brug er tamoxifen modstand, som opstår

de novo

eller kan erhverves efter brug [5]. Desuden tamoxifen brug øger forekomsten af ​​endometriecancer hos postmenopausale kvinder med langtidsbehandling [6]. De molekylære mekanismer bag både

de novo

og erhvervet tamoxifen modstand og dens agonist handling i endometriosevævet er dårligt forstået.

ER tilhører steroid hormon familien til den nukleare receptor superfamilien. Det overvejende opfattelse, at ER fungerer som en transkriptionsfaktor, der primært lokaliseret i cellekernen [7]. Imidlertid har akkumulerende beviser vist, at ER også eksisterer på plasmamembranen og deltager i hurtig østrogen signalering. Det er blevet rapporteret, at ER er modificeret ved posttranslationel palmitoylering i det ligandbindende domæne, der kan bidrage til dens lokalisering membran [8]. Sammenslutningen af ​​ER og caveolin-1 også blev vist at lette ER lokalisering på plasmamembranen [9]. Caveolin-1 er et strukturelt protein af caveolae og tjener som et stillads protein for at rekruttere signalmolekyler såsom vækstfaktorreceptorer, G-proteiner, Src familie tyrosinkinaser og PI3K [10]. Det blev postuleret, at østrogen hurtigt kan aktivere forskellige signalveje, herunder MAPK /ERK, phospholipase C, PI3K /Akt og G-protein-koblet receptor-aktiverede veje i caveolae [11].

For nylig har vi identificeret og klonet et hidtil ukendt variant af eR-α med en molekylvægt på 36 kDa, der blev betegnet som eR-α36 [12]. Den oprindelige 66 kDa ER-α blev opkaldt ER-α66 [13]. ER-α36 transkript initieres fra en promotor beliggende i den første intron af ER-α66-genet og er genereret fra to alternative splejsningsbegivenheder. ER-α36 protein mangler således ligand-afhængige og -uafhængige transaktiveringsdomænet (AF-1 og AF-2), men det bevarer DNA- bindingsdomæne og delvis dimeriseringsdomæne og ligandbindende domæner [12]. ER-α36 besidder en unik 27 aminosyre domæne ved C-terminalen, der erstatter de sidste 138 aminosyrer kodet af exonerne 7 og 8 i ER-α66-genet. Vores tidligere rapport viste, at 17β-estradiol og SERM’er, såsom tamoxifen kunne inducere aktivering af MAPK /ERK-vejen og stimulere celleproliferation gennem membranassocieret ER-α36 [14]. Vi således antaget, at ER-α36 kan være forbundet med agonisten aktivitet af tamoxifen. I nærværende rapport, vi studerede ER-α36 funktion i ER-positive MCF-7 brystkræftceller og Hec1A endometrie kræftceller, og undersøgte bidrag MAPK /ERK og PI3K /Akt veje medieret af ER-α36 til agonisten handling af tamoxifen i endometriecancer.

Resultater

eR-α36 udtrykkes på plasmamembranen i MCF-7 og Hec1A Cells

eR-α36 er en roman variant af ER-α66 genereret ved alternativ promotoranvendelse og alternativ splejsning [12]. Til undersøgelse ER-α36 ekspression i MCF-7-celler og Hec1A celler, blev Western blotting-analyse udført ved anvendelse af ER-A36 specifikt antistof mod de unikke 20 aminosyrer ved C-terminalen af ​​ER-α36. ER-α36 udtrykkes i begge cellelinier (fig. 1A, venstre). Imidlertid Western blot-analyse kunne ikke påvise ER-α66 ekspression i Hec1A celler (Fig. 1A, højre), på at Hec1A er en ER-negative cancercellelinie [15]. For at undersøge den cellulære lokalisering af ER-α36, blev immunfluorescens-assay udført. I begge cellelinier, immunfluorescensfarvning viste en intens plasmamembran fordeling mønster (fig. 1B). Caveolae er sammentrækningsorgan mikrostrukturer på plasmamembranen, hvor caveolin-1 fungerer som et stillads protein til dannelse af signalering kompleks. Som vist i fig. 1C, caveolin-1 blev primært udtrykkes på celleoverfladen (rød). Flettede billeder af ER-α36 og caveolin-1 viste betydelige co-lokalisering signaler (gul) på plasmamembranen.

A, udtryk for ER-α36 og ER-α66 protein i MCF-7 og Hec1A celler . Proteinekstrakter blev fremstillet ud fra MCF-7 og Hec1A celler og anvendt til Western blot-analyse. B, Lokaliseringen af ​​ER-α36 i MCF-7 og Hec1A celler. Celler dyrket på dækglas blev fikseret og immunofluorescently farvet med et specifikt anti-ER-α36-antistof (grøn). Cellerne blev modfarvet med Hoechst 33258 (blå). C, The co-lokalisering af ER-α36 og caveolin-1 på plasmamembranen af ​​Hec1A celler. Grøn: ER-α36; Rød: caveolin-1; blå: nuklear; gul, co-lokalisering signaler. Bar, 10 mikrometer. D, Time-kursus analyse af ER-α36 udtryk i Hec1A celler. Hec1A celler blev behandlet med 2 pM Tam for angivne tidspunkter. Niveauer af protein-ekspression blev normaliseret med β-actin-ekspression niveau, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler

Næste, vi analyserede ligand-induceret ER-α36 udtryk.. Hec1A cellelinier blev behandlet med tamoxifen til forskellige tidspunkter og ER-α36 ekspression blev vurderet ved Western blotting-analyse, hvilket viste, at ER-α36 ekspression blev forøget i tamoxifen behandlede celler (fig. 1D).

ER-α36 medierer østrogen- og Tamoxifen- stimuleret ERK Activation

for at sondere den mekanisme ligger til grund for agonist effekt af tamoxifen i endometrie kræftceller, besluttede vi at undersøge funktionen af ​​ER-A36 i tamoxifen behandlede Hec1A celler. Vi undersøgte først phosphoryleringsniveauerne af MAPK /ERK, en serin-threonin-kinase involveret i celleproliferation [16]. Som vist i fig. 2A og fig. 2B, E2 eller tamoxifen behandlinger resulterer i hurtig phosphorylering af ERK1 /2. Fornyet probing af membranen med en total ERK1 /2-antistof viste, at det samlede ERK1 /2-indhold ikke blev ændret, hvilket tyder på, at den forøgede ERK1 /2 phosphorylering ikke skyldtes øget ERK1 /2-ekspression.

A og B, Hec1A celler blev behandlet med 10 nM E2 eller 2 pM Tam for de angivne tidspunkter. Niveauer af ERK1 /2 phosphorylering blev målt i proteinekstrakter med Western blot-analyse. Total ERK1 /2 blev anvendt som indlæsning kontrol. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler. C og D, ER-α36 udtryk i Hec1A /V og Hec1A /RNAi celler. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med Hec1A /V-celler. E, Hec1A /V og Hec1A /RNAi-celler behandlet med 10 nM E2 eller 2 pM Tam blev analyseret for niveauet af ERK1 /2 phosphorylering med Western blot. Total ERK1 /2 blev anvendt som ladningskontrol, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler (-) vs. behandlinger. F, lysater fra Hec1A celler behandlet med DMSO (bane 1, 2 og 3), 10 nM E2 (bane 2 og 5), 2 uM Tam (bane 3 og 6) eller forbehandlet med 10 pM U0126 (bane 4, 5 og 6 ) i 30 minutter blev analyseret med Western blot-analyse.

for at teste inddragelse af ER-α36 i aktiviteter i E2 og tamoxifen observeret i Hec1A celler, som mangler ER-α66 udtryk, besluttede vi at banke down ER-α36 ekspression med siRNA tilgang. Vi har etableret stabile cellelinier, som udtrykker shRNA ekspressionsvektor mod ER-α36 (Hec1A /RNAi-celler) og undersøgt ER-α36 ekspression (fig. 2C og 2D). Som vist i fig. 2E, E2 og tamoxifen undladt at stimulere phosphorylering af ERK1 /2 i Hec1A celler med ER-A36 slået ned, hvilket antyder, at ER-A36 er den receptor, der medierer aktiviteter af østrogen og tamoxifen.

Ekstracellulær reguleret kinase kinase (MEK) virker opstrøms for ERK1 /2 og kunne phosphorylere og aktivere ERK1 /2 [17]. MEK specifikke inhibitor U0126 hæmmede effektivt ERK1 /2-aktivering stimuleret af E2 og tamoxifen (fig. 2F).

Vi har også etableret stabile cellelinier fra ER-positive MCF-7 bryst kræftceller, der konstitutivt udtrykker rekombinant ER -α36 (MCF-7 /ER36 celler) (fig. 3A). I kontrolgruppen MCF-7-celler transficeret med tom vektor, E2 behandling induceret phosphorylering af ERK1 /2 (fig. 3B), som kunne afskaffes af tamoxifen (fig. 3C). Men tamoxifen inducerede phosphorylering af ERK1 /2 i MCF-7 /ER36 celler (fig. 3D). MEK specifik inhibitor U0126 inhiberede effektivt ERK1 /2-aktivering stimuleret af E2 og tamoxifen (fig. 3E). Derfor er disse resultater viste, at ER-α36 medierer Ras /MEK /ERK pathway induceret af både østrogen og tamoxifen og foreslog, at ER-A36 kan være involveret i tamoxifen modstand og endda fremme agonistvirkning af tamoxifen.

A , Western blot-analyse af ER-α36 ekspression i MCF-7 /V og MCF-7 /ER36 celler. Ekspressionsniveauer blev normaliseret til niveauer på β-actin, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med MCF-7 /V-celler. B og C, MCF-7 /V-celler behandlet med 10 nM E2 alene eller med 2 pM Tam sammen i de angivne tidspunkter. Proteinekstrakter blev analyseret med Western blot-analyse. Total ERK1 /2 blev anvendt som indlæsning kontrol. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med kontrolceller. D, MCF-7 /ER36 celler behandlet med 2 pM Tam til forskellige tidspunkter blev analyseret for ERK1 /2 phosphorylering med Western blot. Ekspressionsniveauer blev normaliseret til niveauer på den samlede ERK1 /2, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3) *, P. 0,05 sammenlignet for ubehandlede celler. E, Lysater blev fremstillet ud fra MCF-7 /ER36 celler behandlet med DMSO (bane 1, 2 og 3), 10 nM E2 (bane 2 og 5), 2 uM Tam (bane 3 og 6) eller forbehandlet med 10 pM U0126 (bane 4, 5 og 6) i 30 minutter og immunblottet med antistoffer mod pErk1 /2 eller total ERK1 /2.

ER-α36 formidler østrogen- og Tamoxifen-stimuleret PI3K /Akt Aktivering

det er velkendt, at serin /threonin kinase Akt, eller protein kinase B, spiller en vigtig rolle i celleproliferation og overlevelse ved inhibering af apoptose [18]. Vi testede hvis E2 og tamoxifen behandling også inducerer aktivering af Akt-vejen i Hec1A celler. Behandling af E2 og tamoxifen førte til hurtig phosphorylering af Akt (fig. 4A og 4B), hvorimod både E2 og tamoxifen inducerede ikke den Akt phosphorylering i Hec1A /RNAi-celler (fig. 4C). Tamoxifen inducerede også Akt phosphorylering i MCF-7-celler, der stærkt udtrykke rekombinant ER-α36 (fig. 4E). Forbehandling med PI3K-inhibitoren LY294002 ophævede Akt phosphorylering stimuleret af E2 eller tamoxifen i begge cellelinier (fig. 4D og 4F), hvilket indikerer, at ER-α36 medierer tamoxifen inducerede Akt phosphorylering gennem PI3K pathway i disse celler. Foreslog vores data således, at ER-α36-medieret activaton af PI3K /Akt pathway kan også være involveret i resistens og agonist virkning af tamoxifen.

Hec1A celler blev behandlet med 10 nM E2 (A) eller 2 uM Tam (B) for de angivne tidspunkter og lysaterne blev immunoblottedes med et antistof mod phosphoryleret Akt. Niveauer af phosphorylering blev normaliseret med den samlede Akt protein, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler. C, Western blot-analyse af Akt phosphorylering i Hec1A /V og Hec1A /RNAi ER36 celler behandlet med 10 nM E2 eller 2 pM Tam i 10 minutter. Niveauer af phosphorylering blev normaliseret med den samlede Akt protein, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler. #, P 0,05 sammenlignet med E2- eller Tam-behandlede Hec1A /V-celler. D, Hec1A celler forbehandlet med 50 pM PI3K-inhibitor LY294002 (LY, Bane 4, 5 og 6) i 2 timer og derefter behandlet med 10 nM E2 (bane 2 og 5) eller 2 uM Tam (bane 3 og 6) i 10 minutter . E, Western blot-analyse af Akt-phosphorylering i MCF-7 /ER36 celler behandlet med 2 pM Tam for de angivne tidspunkter. Ekspression blev normaliseret til total Akt, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3) *, P. 0,05 sammenlignet for ubehandlede celler. F, Lysater blev fremstillet ud fra MCF-7 /ER36 celler behandlet med DMSO (bane 1 og 2), 2 uM Tam (bane 2 og 4) eller forbehandlet med 50 pM PI3K-inhibitor LY294002 (LY, bane 3 og 4) til 2 h, og immunoblottedes med antistoffer mod phosphoryleret Akt eller total Akt.

ER-α36 er involveret i forordning af c-myc Protein Expression i Hec1A Celler

protoonkogene c-myc har dyb mitogene virkninger i cancerceller gennem sin evne til at fremme cellecyklusprogression [19]. Antisense-oligonukleotider til c-Myc kan inhibere brystcancerceller proliferation [20]. Tamoxifen inhiberer østrogen-induceret c-Myc-ekspression i ER-α66-positive brystcancerceller. Men c-myc spiller en vigtig rolle i tamoxifen agonist handling [21]. Vi målte ekspressionsniveauerne af c-Myc i Hec1A celler behandlet med E2 eller tamoxifen. Som vist i fig. 5A, behandling med E2 eller tamoxifen inducerede c-myc ekspression i Hec1A /V-celler, men ikke i Hec1A /RNAi ER-α36-celler, som effektivt kunne ophævet ved MEK-inhibitor U0126 (fig. 5B) og PI3K-inhibitor LY294002 (fig. 5C).

A, Western blot-analyse af c-myc-ekspression i Hec1A /V og Hec1A /RNAi-celler behandlet med 10 nM E2 eller 2 pM Tam i 12 timer. Ekspressionsniveauer blev normaliseret til niveauerne af β-actin, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler (-) vs. behandlinger. #, P 0,05 sammenlignet med Tam-behandlede Hec1A /V-celler. B og C, Hec1A-celler blev behandlet i 12 timer med 10 nM E2 eller 2 uM Tam eller sammen med 10 uM MEK inhibitor U0126 eller 50 uM PI3K-inhibitor LY294002. Niveauer af c-myc-ekspression blev normaliseret til niveauerne af β-actin, og hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler (-) vs. behandlinger. #, P. 0,05 sammenlignet med E2- og Tam-behandlet Hec1A /V celler

ER-α36 formidler Tamoxifen-Stimuleret Cell Proliferation i Hec1A Celler

For yderligere at undersøge, hvilken rolle af eR-α36 i tamoxifen agonistaktivitet i endometriecancer-celler, blev Hec1A /V og Hec1A /RNAi celler behandlet med tamoxifen og deres prolifaration blev målt med MTT-assayet. MTT-assay viste, at tamoxifen stimulerede væksten af ​​Hec1A /V-celler. Men tamoxifen var i stand til at inhibere væksten af ​​Hec1A /RNAi-celler på en dosis-afhængig måde (Fig. 6A). Celleproliferationen induceret af tamoxifen blev inhiberet af MEK-inhibitor U0126 og PI3K-inhibitor LY294002 (fig. 6B), hvilket tyder på, at både MAPK /ERK og PI3K /Akt veje var involveret i E2 og tamoxifen stimulerede cellevækst i endometriecancer-celler.

A, Hec1A celler transficeret med den tomme ekspressionsvektor (Hec1A /V) eller Hec1A cellelinier, hvori ERα36 var blevet stabilt slået af shRNA ekspression (Hec1A /RNAi) blev udpladet 96 brønde (3 x 10

3 celler /brønd). Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af Tam i medium indeholdende 2,5% dextran trækul-strippet FBS i 72 timer. MTT-assayet blev udført som beskrevet i

materialer og metoder

. Resultater af tre uafhængige forsøg blev beregnet og middelværdi ± SEM er vist. *, P 0,05 sammenlignet med Tam-behandlede Hec1A /V-celler hhv. B, blev Hec1A celler behandlet med 10 nM E2 eller 2 uM Tam sammen med 10 uM af MEK-inhibitor U0126 eller 50 uM PI3K-inhibitor LY294002 henholdsvis i 72 timer og analyseret ved MTT-assayet. Resultater af tre uafhængige forsøg blev beregnet og middelværdi ± SEM er vist. *, P 0,05 sammenlignet med kontrolceller. C, Tomme transficeret ekspressionsvektor MCF-7-celler (MCF-7 /V) eller MCF-7-celler transficeret med ERα36 ekspressionsvektor (MCF-7 /ER36 celler) blev udpladet i 96-brønds plader (5 × 10

3 celler /brønd). Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af tamoxifen i medium indeholdende 10% FBS i 72 timer. MTT assayet blev udført. Resultater af tre uafhængige forsøg blev beregnet og middelværdi ± SEM er vist. *, P 0,05 sammenlignet med Tam-behandlede MCF-7 /ER36 celler hhv. D, MCF-7 /V og MCF-7 /ER36 celler blev behandlet med 2 pM Tam sammen med 10 pM U0126 eller 50 uM PI3K-inhibitor LY294002 henholdsvis i 72 timer og analyseret ved MTT-assayet. Resultater af tre uafhængige forsøg blev beregnet og middelværdi ± SEM er vist. *, P 0,05 sammenlignet med kontrol MCF-7 /V-celler

Vi observerede, at tamoxifen stærkt inhiberede celleproliferation i MCF-7 /V-celler, i overensstemmelse med tidligere rapporter, at tamoxifen fungerer som en. potent antagonist i ER-positiv brystkræft MCF-7-celler [22]. Imidlertid MCF-7 /ER36 celler, som konstitutivt udtrykker høje niveauer af rekombinant ER-α36 udviste ufølsomhed over for tamoxifen behandling (fig. 6C). MEK-inhibitor U0126 og PI3K-inhibitor LY294002 desuden hæmmet vækst af begge cellelinier (fig. 6D). Disse resultater igen viser, at høje niveau af ER-α36 ekspression kan give resistens til tamoxifen.

Diskussion

Tamoxifen er en SERM, der har været meget anvendt til behandling af fremskreden ER-positiv brystkræft og forebygge brystkræft i høj risiko præ- og postmenopausale kvinder som et kemoforebyggende middel [23], [24]. Men tamoxifen har også delvis østrogene aktivitet i livmoderen, der kan føre til endometrial hyperplasi [25]. Langsigtet tamoxifen brug er forbundet med en øget incidens af endometriecancer [26]. Her rapporterede vi, at en hidtil ukendt variant af ER-α, ER-α36, er, at stærkt udtrykt på plasmamembranen af ​​Hec1A endometrial cancerceller og i de endometriecancer prøver fra patienter, der var blevet behandlet med tamoxifen i mindst tre år. Både E2 og tamoxifen celleproliferation af Hec1A celler formentlig gennem ER-α36 medieret ikke-genomiske signalveje.

En række hypoteser er blevet postuleret at forklare tamoxifen s agonist handling i endometrie carcinogenese. Det er blevet foreslået, at reaktive metabolitter af tamoxifen danner DNA-addukter og generere mutagenicitet i endometriosevævet [27]. Det er også blevet påvist, at AF1 domæne af ER-α66 samt celle- og promotor-specifik coaktivator rekruttering er involveret i tamoxifen agonistvirkning [28], [29]. Rolle tamoxifen i endometrie carcinogenese kan benytte særskilte genomisk aktivitet [30]. For nylig foreslog akkumulere beviser for, at membran-initieret signalveje giver tamoxifen modstand og agonist handling gennem forskellige kinase kaskader og distinkte second messengers [15].

MAPK familien består af ERK, JNK og P38. ERK spiller en væsentlig rolle i cellevækst og proliferation. JNK og P38 er involveret i celledifferentiering og apoptose induceret af stress stimuli, såsom UV-lys [31], γ stråling [32], [33], DNA-ødelæggende og kemoforebyggende narkotika [34]. Mange onkogene signalmolekyler aktiverer MAPK /ERK-vejen [35]. ERK udtryk øges sædvanligvis, og dens aktivitet er opreguleret i brystkræft væv i forhold til tilstødende normale væv [36]. Endvidere er tamoxifen resistens

in vivo

overvejende medieret af ikke-genomiske mekanismer. Genomisk østrogen handling synes mindre aktiv [37], [38]. I denne undersøgelse fandt vi, at ER-α36 medierer både E2- og tamoxifen-induceret aktivering af MAPK /ERK-vejen og ER-α36 overekspression i tamoxifen følsomme MCF-7-celler nedsat følsomhed over for tamoxifen. Desuden ER-α36 medierer tamoxifen inducerede aktivering af MAPK /ERK-vejen og bidrager til agonistvirkning af tamoxifen i Hec1A endometrial cancerceller også. Endometriecancer væv, meget hurtig ER-α36 også viste høje niveauer af ERK phosphorylering.

PI3K /Akt pathway spiller en vigtig rolle i cellevækst og overlevelse [39]. Akt aktiveres af mange signalveje, såsom overekspression af vækstfaktorreceptorer, [40]. Indførelse af en konstitutivt aktiv Akt i MCF-7-celler kunne inducere tamoxifen resistens ved at beskytte celler mod tamoxifen-induceret apoptose [41]. Desuden er det Akt aktivitet dramaticaly steg i tamoxifen- resistente MCF7-celler [18]. I phosphorylerede Akt-positive patienter, endokrin terapi har dårligere effekt end i fosforylerede Akt-negative patienter [42]. I denne undersøgelse fandt vi ER-α36 medieret tamoxifen-stimuleret aktivering af Akt i celler med høje niveauer af ER-α36 ekspression antyder, at aktivering af PI3K /Akt pathway medieret af ER-α36 bidrager til modstand og agonistvirkning af tamoxifen .

c-myc proteinet er et nukleart transkriptionsfaktor som spiller en væsentlig rolle i cellevækst [43]. Tidligere undersøgelser har vist, at MAPK /ERK og PI3K /Akt pathways regulere c-myc proteinekspression [44], [45], [46]. Vi fandt både E2 og tamoxifen induceret c-myc udtryk gennem ER-α36-medieret aktivering af ERK og Akt. Inkubation af Hec1A celler med MEK-inhibitor U0126 og PI3K-inhibitor LY294002 blokeret E2- og tamoxifen- induceret c-myc-ekspression. Derfor tamoxifen udøver agonistvirkning gennem ER-α36-medieret non-genomisk pathway.

Sammenfattende rapporterer vi her, at ER-α36 udtrykkes på plasmamembranen og i cytoplasmaet af endometriske carcinomceller. Vi yderligere demonstreret, at både E2 og tamoxifen fremmet proliferation af endometriske cancerceller gennem ER-α36-medieret aktivering af MAPK /ERK og PI3K /Akt veje og ER-α36 overekspression ført til tamoxifen resistens i MCF-7-celler. Vores resultater giver vigtige roman information til yderligere at forstå de molekylære mekanismer der ligger bag agonist virkning af tamoxifen.

Materialer og metoder

Materialer og reagenser

Alle kemikalier og reagenser blev købt fra Sigma medmindre andet er angivet. Polyklonalt anti-ERK1 /2-antistof, polyklonalt anti-phospho-ERK1 /2-antistof (Thr

202 /Tyr

204), polyklonalt anti-caveolin-1 -TRITC antistof, monoklonalt anti-c-myc antistof, polyklonalt anti-Akt antistof, monoklonalt anti-ER-α66 (D-12) antistof og monoklonalt anti-β-actin-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Polyklonalt anti-phospho-Akt (Ser

473) antistof blev opnået fra Signalway Antibody (Pearland, TX). ER-α36 specifikt antistof mod de 20 unikke aminosyrer ved C-terminalen af ​​ER-α36, ER-α36 ekspressionsplasmid, ER-α36 shRNA ekspressionsvektor og den tomme ekspressionsvektor blev beskrevet før [12], [14]. U0126 blev indkøbt fra Calbiochem (La Jolla, CA).

Cellekultur og cellelinier

MCF-7 humane brystcancerceller blev opnået fra ATCC (Manassas, VA), og human Hec1A endometrial kræftceller blev opnået fra Dr. Li-Hui Wei (Peking University Folkets Hospital, Beijing). Begge cellelinier blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2 i passende dyrkningsmedium. At etablere MCF-7-celler der udtrykker rekombinant ER-α36 blev celler udpladet ved en densitet på 1 x 10

5 celler pr 60 mm skål og transficeret 24 timer senere med en ekspressionsvektor drevet af cytomagalovirus (CMV) promotor i den mammale ekspressionsvektor pCB6 + som beskrevet andetsteds [14], under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ekspressionsvektoren indeholder fuld-længde ER-α36 cDNA. Den tomme ekspressionsvektor blev også transficeres i celler for at tjene som kontrol. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne genudpladet og selekteret med 500 ug /ml G418 i to uger. Mediet blev skiftet hver tredje dag, indtil kolonier fremkom. Kloner blev ekspanderet til yderligere analyse. Kloner med høj ER-α36-ekspression var en blanding af mere end tyve kloner og betegnet MCF-7 /ER-α36. En cellelinie med poolede kloner transficeret med tom ekspressionsvektor blev benævnt MCF-7 /V og anvendt som kontrol.

Vi har også etableret cellelinier fra Hec1A celler transficeret med en ER-α36 shRNA ekspressionsvektor (Hec1A /RNAi) og den tomme ekspressionsvektor (Hec1A /V). Kort fortalt blev ER-α36 shRNA ekspressionsvektor pRNAT-U6.1 /Neo plasmid indeholdende shRNA mod ER-A36 (genscript Corp. TX) og den tomme ekspressionsvektor transficeres i Hec1A celler med lipofectamin 2000 ifølge producentens anvisninger. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne genudpladet og selekteres med G418 (600 ug /ml) i to uger. Kloner blev ekspanderet til yderligere analyse.

Immunofluorescens og konfokal mikroskopi

Den cellulære lokalisering af protein blev bestemt ved indirekte immunofluorescens. Hec1A eller MCF-7-celler dyrket på sterile dækglas blev fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min. Efter at være blevet permeabiliseret med 0,4% Triton X-100 ved stuetemperatur i 10 minutter blev cellerne blokeret i 4% BSA-suppleret PBS i 1 time og inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-ER-α36-specifikt antistof. Efter tre vaske i PBS blev cellerne mærket med FITC-konjugeret sekundært antistof. DNA farvestof Hoechst 33258 blev anvendt til nuklear farvning.

I dobbelt farvning af ER-α36 og caveolin-1, efter ER-α36 farvning og vask i PBS blev cellerne blokeret i 4% BSA-PBS suppleret i 1 time ved stuetemperatur. Efter inkubation med anti-caveolin-1-TRITC antistof natten over blev cellerne yderligere vasket i PBS og farvet med Hoechst 33258. Mikroskopiske analyser blev udført ved anvendelse af et konfokalt laser-Scanning Microscope (Zeiss LSM 510 META, Tyskland).

semikvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret ved TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens anvisninger. Totalt RNA (1,6 ug) blev anvendt til fremstilling af den første streng cDNA ved revers transkriptase (Takara, Dalian, P.R.China). De følgende primersæt blev designet til amplifikation af human ER-α36 (BX640939, 1145-1434 bp): forward, 5′-CAAGTGGTTTCCTCGTGTCTAAAGC-3 ‘og revers, 5′-TGTTGAGTGTTGGTTGC CAGG-3′; Human GAPDH mRNA blev amplificeret ved den fremadrettede primer 5’-ACGGATTTGG TCGTATTGGG-3 ‘og den reverse primer 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’.

MTT assay

Celleproliferation blev analyseret under anvendelse af 3 – (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay [47]. Kort beskrevet blev celler podet i 96-brønds plader til en endelig koncentration på 5 × 10

3 /brønd for MCF-7 /V og MCF-7 /ER36 celler eller 3 × 10

3 /brønd for Hec1A /V og Hec1A /RNAi celler. MCF-7 /V og MCF-7 /ER36 celler blev inkuberet i DMEM medium indeholdende 10% FCS med de angivne behandlinger. Hec1A /V og Hec1A /RNAi-celler blev inkuberet i phenol-rødt frit medium indeholdende 2,5% dextran trækul-strippet FCS (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) med de angivne behandlinger. Cellerne blev derefter inkuberet med MTT (0,5 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° C. Efter fjernelse af medium indeholdende MTT reagenset blev 150 pi DMSO tilsat til hver brønd. Pladerne blev aflæst ved en bølgelængde på 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Bioteck Powerwave ™, USA). Salg

Western blotting-analyse Salg

Celler blev dyrket i phenol-rød-frit medium med 2,5% dextran charcoal- strippet FCS i 48-72 timer og derefter om-medium uden serum 12 timer før stimulering med midlerne angivet. Cellerne blev opsamlet i iskold PBS, og celleekstrakterne blev fremstillet i RIPA-puffer med proteinase inhibitor cocktail fra Sigma (St. Louis, MO). Cellelysater blev kogt med gel-ladningsbuffer i 5 minutter ved 100 ° C, opløst på 10% SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner, probet med egnede antistoffer og visualiseret med forøget kemiluminescens (ECL) detektionsreagenser (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af parrede-prøver

t

-test, eller ANOVA efterfulgt af Student-Newman-Keuls test for at bestemme forskelle i midler.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Tak

Vi vil takke Dr. Li-Hui Wei for venligt at levere de Hec1A cellerne.. Vi takker også Dr. Yong-Feng Shang ved Peking University og Dr. Heide Schatten ved University of Missouri for omhyggelig læsning af manuskriptet og tankevækkende forslag.