PLoS ONE: Den anoikis Effector BIT1 Viser Tumor Smittespredningshæmmende Funktion i Lung Cancer Cells

abstrakt

mitochondrial BIT1 (Bcl-2-inhibitor af transskription 1) protein er en del af en apoptotisk vej, som er unikt reguleret af integrin-medieret binding. Som en anoikis effektor er BIT1 frigivet i cytoplasmaet efter tabet af celle vedhæftning og inducerer en caspase-uafhængig form for apoptose. I betragtning af at anoikis modstand er en kritisk faktor for forandring, vi hypotese, at kræftceller kan omgå BIT1 apoptosecyklus at opnå forankring-uafhængighed og tumorigent potentiale. Her giver vi de første beviser af tumor undertrykkende effekt af BIT1 gennem en mekanisme, der involverer anoikis induktion i humane lunge adenocarcinom afledte A549 celler. Tilbagelevering af BIT1 i anoikis resistente A549 celler er tilstrækkelig til at fremkalde detachement induceret apoptose trods defekt i caspase aktivering og svækker deres forankringsuafhængig vækst. En stabil nedregulering af BIT1 i disse celler øger betydeligt deres anoikis modstand og forankringsuafhængig vækst. De BIT1 Knockdown celler udviser væsentligt forbedret tumorigenecity

in vivo

. Det er tidligere blevet vist, at den nukleare TLE1 co-repressorkomplekset er en formodet onkogen i lungekræft, og vi viser her, at TLE1 blokerer BIT1 medierede anoikis delvist af sekvestrere pro-apoptotiske partner BIT1, den aminoterminale Enhancer Split (AES) protein, i kernen. Tilsammen tyder disse resultater på en tumor undertrykkende rolle caspase-uafhængig anoikis effektor BIT1 i lungekræft. I overensstemmelse med sin rolle som en tumor suppressor, har vi fundet, at BIT1 nedreguleres i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) væv

Henvisning:. Yao X, Jennings S, Irland SK, Pham T, Temple B, Davis M, et al. (2014) Den anoikis Effector BIT1 Viser Tumor Smittespredningshæmmende Funktion i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (7): e101564. doi: 10,1371 /journal.pone.0101564

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: Marts 20, 2014 Accepteret: 8 jun 2014; Udgivet: 8 jul 2014

Copyright: © 2014 Yao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) Start Grant (HB), NIH RCMI G12RR026250-03 Grant (til Xavier University of Losuiana), og NIH 1R15CA158677-01A1 Grant (HB). Disse finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en kritisk faktor for en ondartet epitelial fænotype er forankring uafhængighed. Tabet af forankring afhængighed til den ekstracellulære matrix ved maligne celler sætter dem i stand til at vokse i fravær af celleadhæsion, at udbrede sig i en tredimensionel matrix, til at invadere tilstødende væv, og metastasere til fjerne organer [1], [2]. De molekylære mekanismer og cellulære veje underliggende forankring-uafhængighed af cancerceller er blevet grundigt undersøgt [3], og de fleste af disse molekylære ændringer giver maligne celler evnen til at omgå anoikis program, som er på plads i normale celler. I betragtning af at fordelingen af ​​anoikis kontrol bidrager til vækst og malignitet af mange solide tumorer, genoprette anoikis følsomhed er en vigtig terapeutisk strategi i indskrænke tumor aggressivitet og metastase. Derfor identifikation af hidtil ukendte molekylære mål for anoikis-medieret celledød pathway har væsentlige terapeutiske implikationer.

To apoptotiske veje, mitokondrier (intrinsisk) og celledød receptor (extrinsic), er blevet vist at regulere anoikis behandle. Efter frigørelse-induceret tab af integrin-medieret overlevelse signalering, er den indre apoptotiske vej udløst ved aktivering af de pro-apoptotiske medlemmer af BCL-familien af ​​proteiner (herunder Bax, Bad, Bid og Bim). Disse proteiner udløse permeabilisering af den ydre mitokondriemembran fører til cytosolisk frigivelse af cytochrom c og nedstrøms aktivering af caspaseenzymer [5], [6]. Denne mitochondrial-afhængig caspaseaktivering loop, som yderligere kan forstærkes via nedregulering af ekspression af de anti-apoptotiske Bcl familiemedlemmer (såsom Bcl-2 og Bcl-XL), som fungerer på bevogtning mitokondriske integritet [7], kan i sidste ende føre til DNA-fragmentering og celledød. Død receptoren (extrinsic) pathway afhænger bindingen af ​​dødsfald ligander (Fas eller TRAIL) til døden receptor og udnytter dannelsen af ​​en død-fremkaldende signaler kompleks (DISC) i aktivering af nedstrøms caspase-8. Denne død receptormedieret caspase 8 aktivering kan bevirke destabilisering af den mitokondriske membran, der fører til apoptose [8], [9]. Selvom konvergens og krydstale mellem ydre og indre apoptotiske veje findes på forskellige niveauer, både veje afhængige caspaseaktivering loop til at foretage celledød. Imidlertid har beviser dukket indikerer eksistensen af ​​caspase-uafhængige mekanismer i anoikis [10],. Især inhibering af caspaseaktivering enten gennem overekspression af Bcl-2 eller behandling med globale caspaseinhibitorer at spærre basale anoikis i tumorceller som vurderet ved DNA-stige-analyse [10]. Den alternative caspase-uafhængig måde til anoikis er et vigtigt terapeutisk mål i tumorer, der udviser en deaktiveret caspase-afhængig apoptose pathway.

Ruoslahti og kolleger har for nylig identificeret en hidtil ukendt integrin-afhængig apoptotiske vej, der er medieret af mitokondriel BIT1 (Bcl2, inhibitor af transskription 1) protein [11]. Efter tab af integrin-medieret binding celle, BIT1 frigives til cytoplasmaet, danner et kompleks med den transkriptionelle coregulator AES, og efterfølgende inducerer en caspase-uafhængig tilstand af apoptose. Mens flere kendte anti-apoptotiske faktorer, såsom Bcl-2, Bcl-xl, Akt er ineffektive til blokering BIT1 apoptose, integrin-medieret binding er den eneste anti-apoptotisk behandling, der kan undertrykke BIT1 apoptose funktion [11]. I betragtning af at integrin-medieret celleadhæsion, især α5β1 integrin, er den eneste opstrøms behandling, der kan blokere BIT1 apoptose pathway, kan BIT1 spille en vigtig rolle i anoikis som vogter af forankring afhængighed [11] – [15]. Baseret på den manglende evne af caspaseinhibitorer til at inhibere BIT1 apoptose og fraværet af caspaseaktivering i BIT1 transficerede celler, kan BIT1 pathway repræsenterer en af ​​caspase-uafhængig anoikis mekanismer i maligne celler [11]. Derfor viser den BIT1 apoptotiske vej at være en attraktiv terapeutisk mål i omgå anoikis resistens især i tumorceller der udviser mangelfuld caspaseaktivitet. Udnyttelse af BIT1 som et terapeutisk mål kræver en detaljeret undersøgelse af mekanismen i sin apoptose funktion, som vi har fundet at være afhængig dels på at slukke en overlevelse-fremmende gentranskription program styres af Groucho transkriptionelle co-repressorkomplekset TLE1 [15].

rolle BIT1 i anoikis er blevet påvist i flere transformerede cellelinier. Gennem genmanipulation tilgange, har vi vist, at exogen ekspression af mitochondrielle BIT1 blokerer anoikis modstand af flere tumorcellelinier mens nedregulering af endogen BIT1 ekspression yderligere forvirrer deres anoikis ufølsomhed [11] – [15]. Siden overtagelsen af ​​anoikis modstand er en vigtig faktor for neoplastisk transformation og metastatisk potentiale [1], [2], undertrykkelse af BIT1 anoikis pathway i maligne celler kan bidrage til kræft progression, specielt i erhvervelsen af ​​avancerede tumorigen og metastatisk adfærd. Faktisk vores tidligere undersøgelser viste, at BIT1 kan fungere som en undertrykker af metastase

in vivo

[14]. Selvom den nøjagtige mekanisme bag dens metastaser hæmmende effekt mangler at blive defineret, BIT1 anoikis fremkalde funktion kan spille en hastighedsbegrænsende trin i metastaser processen. Interessant, har rollen som BIT1 i tumorigenese ikke blevet påvist til dato.

For yderligere at tage fat rolle BIT1 i formation kræft, har vi udført indledende online database søgning at undersøge, om BIT1 udtryk ændres i forskellige typer af humane tumorer i forhold til deres normale modstykker. Interessant nok har vi fundet, at BIT1 ekspression selektivt og væsentligt undertrykkes i lungekræft. Denne foreløbige konklusion, sammenholdt med den seneste beviser dokumenterer, at TLE1 kan fungere som en lunge specifik onkogen [16], har fået os til at undersøge betydningen af ​​BIT1 apoptosecyklus i anoikis ufølsomhed og tumorigent potentiale af ikke-småcellet lungecancer ( NSCLC), som er den mest aggressive form for lungekræft og er yderst kemoresistent dels på grund af en mangelfuld caspase-afhængig apoptose pathway [17], [18]. Her viser vi, at exogent BIT1 omgår anoikis modstand af human lunge adenocarcinom A549-celler ved aktivering af caspase-uafhængig apoptose og hæmmer deres forankringsuafhængig vækst. Konsekvent, knockdown af endogen BIT1 i disse celler yderligere forbedrer deres anoikis ufølsomhed og forankring-uafhængig potentiale

in vitro

forstærker deres tumorigen vækst

in vivo

. I overensstemmelse med sin tumor undertrykkende funktion, blev BIT1 udtryk sig at være nedreguleret i NSCLC tumorer.

Materialer og metoder

Cell kultur og transfektionsassayene

NSCLC A549 og H460 celle linierne opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med glutamin indeholdende 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin. Den stabile A549 afledt kontrol og BIT1 shRNA pulje af celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med glutamin indeholdende 10% føtalt bovint serum, penicillin, streptomycin og 1 ug /ml puromycin (Invitrogen). Med transient transfektion blev udført med lipofectamin 2000 (Invitrogen) for A549-celler og Lipofectamine LTX reagens (Invitrogen) for H460 celler i OPTI-MEM (Invitrogen) ifølge producentens protokol med den samlede mængde anvendte plasmid pr transfektion normaliseret med den tilsvarende tom vektor konstrukt.

Kemiske reagenser, antistoffer og plasmider

Poly (2-hydroxyethylmethacrylat (polyHEMA) og det monoklonale muse-anti-FLAG, anti-AES, anti-GFP og anti -B-actin antistoffer blev anskaffet fra Sigma (St. Louis, MO). det polyklonale anti-TLE1 antistof blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA). caspaseinhibitoren zVAD-fmk og anti-myc-antistof blev indkøbt fra Calbiochem ( La Jolla, CA). anti-caspase-3, anti-spaltet caspase-3, Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bad og anti-PARP-antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Den mammal ekspressionsvektor, der koder for mitokondrie BIT1 blev dannet som tidligere [11] beskrevne. GFP-TLE1 plasmider blev opnået fra Origene (Rockville, MD). Konstruktionen koder for celledød domæne (CDD) af BIT1 blev opnået fra Dr. Erkki Ruoslahti (Sanford-Burnham Medical Research Institute) og er tidligere blevet karakteriseret [19].

SiRNA og shRNA transfektion

de TLE1 specifikke siRNAs og kontrol- ikke-målretning siRNA’er blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). For forbigående transfektionsforsøg, A549-celler (2 x 10

5) blev transficeret med 25 pM af hver siRNA hjælp af Lipofectamine RNAiMAX transfektionsreagens (Invitrogen). 48 timer efter transfektion blev cellerne høstet og underkastet immunoblotting eller anoikis assays som beskrevet nedenfor. For at generere en stabil A549 BIT1 Knockdown og kontrol pools blev A549 parentale celler transficeret med Prs vektor, der indeholder den korte hårnål RNA mod TLE1 (Origene) eller ikke-targeting scrambled shRNA (Origene). 48 timer efter transfektion, 1 pg /ml puromycin (Invitrogen) blev tilsat til mediet for at selektere for puromycin-resistente kloner. Individuelle puromycin-resistente kloner blev screenet for BIT1 nedregulering ved immunoblotting under anvendelse af et specifikt antistof til Bit11 [15]. To BIT1 shRNA knockdown-positive kloner og to kontrol shRNA kloner blev samlet til yderligere karakterisering.

Analyse af apoptose, anoikis, og cellernes levedygtighed

Apoptose blev bestemt ved at kvantificere niveauet for cytosoliske nukleosomale fragmenter med anvendelse af celledød Detection ELISA-kit (Roche Molecular Biochemicals) ifølge producentens anvisninger [14], [15]. For at vurdere om anoikis celledød, blev celler udpladet på polyHEMA coatede 96 brønds plader i komplet vækstmedium indeholdende 0,5% methylcellulose med en tæthed på 1,0 x 10

4 /brønd på forskellige tidspunkter som beskrevet tidligere [14], [15 ]. Løsnede celler blev derefter opsamlet og udsat for celledøden ELISA apoptose assay. Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved alarmar blåfarvning (Invitrogen) og efterfølgende fluorescens aflæsning (485 nm excitationsbølgelængde og 520 nm emissionsbølgelængde) under anvendelse mikropladelæseren (BioTek Instruments).

celleproliferation og blød agar-assays

Anchorage-afhængig vækst blev bestemt ved udpladning celler i et volumen på 150 pi med en tæthed på 2000 celler per brønd i 96-brønds plader. Ved hver angivne tid blev antallet af metabolisk aktive celler målt ved anvendelse af MTT-assay som tidligere [15] beskrevne. Kort beskrevet blev ti mikroliter MTT reagenset ved 5 mg /ml (Sigma) tilsat til hver brønd i en plade med 96 brønde. Pladen blev derefter inkuberet ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 timer. Derefter blev det resulterende bundfald MTT opløst i 100 ul af en 50% MeOH-50% DMSO-opløsning og udsættes for en 550 nm absorbans læsning via en mikropladelæser (BioTek Instruments). Den forankringsuafhængig vækst af celler blev assesed under anvendelse af 96-brønds pladeformat [15]. Som tidligere beskrevet, blev 5000 celler i 0,3% agar opløsning udpladet på præcoatede med 0,6% agar i dyrkningsmedium. Væksten af ​​de resulterende kolonier blev kvantificeret ved alarmar blåfarvning (Invitrogen) og fluorescens aflæsning ved 485 nm excitationsbølgelængde og 520 nm emissionsbølgelængde med en mikroplade pladelæser.

caspaseaktivering assay

Caspase -3 aktiviteten blev bestemt fluorometrisk bruge substrat Ac-DEVD-AFC substrat og blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger (Roche Applied Science).

Protein forberedelse og vestlige blotting analyser

forberedelse Protein og vestlige blotting blev udført som tidligere beskrevet [14], [15]. Kort beskrevet blev celler høstet 24-48 timer efter transfektion med forskellige konstruktioner eller siRNA’er ved tilsætning iskold NP-40 lysispuffer (1% NP-40; 20 mM Tris-HCI [pH 7,4]; 150 mM NaCl; 10% glycerol , 2 mM natriumvanadat; 1 mM henylmethylsulfonyl fluorid; 10 ug /ml leupeptin og 5 ug /ml aprotinin) og inkuberet ved 4 ° C i 20 min. For immunoblotanalyse blev lige store mængder af proteiner opløst på 4-20% gradient Tris-glycin-geler (Invitrogen) og elektroforetisk overført til nitrocellulose membran. Membranerne blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C efterfulgt af sekundære antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase. Membraner blev udviklet ved anvendelse af ECL detektionssystem.

Subcellulær fraktionering

Subcellulær fraktionering blev udført som tidligere beskrevet [15]. Kort beskrevet transficerede celler dyrket i fastgjort eller frigjort betingelser på de angivne tidspunkter blev høstet vasket en gang med PBS, resuspenderet i 1 ml isotonisk mitokondrie puffer (250 mM mannitol, 70 mM saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7,5]) og homogeniseret med 40 slag i en Dounce homogenisator. Lysaterne blev centrifugeret ved 500 x g i 5 minutter for at fjerne kerner og ubrudte celler. Supernatanten blev yderligere centrifugeret ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C for at isolere det mitokondriske berigede pellet. Den resulterende cytosoliske supernatant blev underkastet SDS-PAGE elektroforese og immunoblotting. For adskillelse af cytosol og den nukleare fraktion, NE-PER nuklear isolation kit (Pierce, No. 78.833) blev anvendt, og udføres som foreskrevet af fabrikanten [15]. Proteinkoncentrationen i de forskellige fraktioner blev kvantificeret ved anvendelse af Bio-Rad proteinassay-kit med BSA som standard.

Coimmunoprecitation assay

co-immunpræcipitationseksperimenter assay blev udført som tidligere [15] beskrevne. Kort fortalt blev transficerede celler høstet ved vaskning én gang med PBS og resuspenderet i iskold Nonidet P-40 lysis buffer (1% Nonidet P-40, 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCI, 10% glycerol, 2 mm natriumvanadat, 1 mm phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug /ml leupeptin og 5 ug /ml aprotinin) efterfulgt af en 20-minutters inkubering ved 4 ° C. Cellerester blev fjernet ved centrifugering. Myc-tagget BIT1 blev immunfældet med anti-myc-agarose-konjugat (Abcam) mens GFP-mærkede TLE1 blev immunfældet med anti-GFP-agarose (Medical og biologiske laboratorier). Immunpræcipitatet blev grundigt vasket med lyseringspuffer. Bundne proteiner blev løst ved SDS-PAGE og Western blotting blev udført ved hjælp af den tilsvarende antistof.

In vivo

tumorigenese assay

Alle procedurer blev udført i henhold til protokoller, der er godkendt af Institutional udvalg for brug og pleje af forsøgsdyr af Xavier University of Louisiana Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, godkendelsesnummer 060911-001BI). Otte uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (BALB /c) blev anvendt til tumorigenese assays. De A549 afledt kontrol shRNA og BIT1 shRNA celler (1,0 x 10

6) injiceret subkutant. Tumorstørrelserne blev målt med jævne mellemrum med kaliberen, og tumorvolumen blev bestemt med formlen (d1 × d2

2) /2, hvor d1 er den større diameter og D2 mindre diameter. Mus blev aflivet, når de primære tumorer nået 2 cm i diameter.

In Situ Apoptosis Detection

Påvisning af apoptotiske celler i kontrol shRNA og BIT1 shRNA tumorsnit blev udført under anvendelse af deadend Kolorimetrisk TUNEL System ( Promega) ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev snit deparaffineret, rehydreret, og inkuberet med proteinase K i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev snittene inkuberet med en arbejdskoncentration på rekombinant Terminal deoxynucleotidyltransferase (FDU) ved 37 ° C i 1 time. Snittene blev den vasket med PBS og nedsænket i 0,3% hydrogenperoxid for at blokere endogen peroxidaseaktivitet. Snittene blev derefter vasket med PBS og inkuberet med streptavidin-HRP-opløsning. Den resulterende mørkebrune signal blev visualiseret med Diaminobenzidin (DAB) som kromogen.

Menneskelig lunge tumorvæv array analyse

Menneskelig tumor væv array-dias, der indeholder planocellulært karcinom, adenokarcinom, større celle karcinom, og matchede normale lungevæv blev opnået fra US Biomax, Inc. (Rockville, MD). Proceduren for immunhistokemi blev udført af Biomax Inc. på to væv microarray dias. Som tidligere beskrevet [14], [15], vævsarray objektglas blev deparaffinised, hydreret og underkastet antigen-genvinding. Objektglassene blev derefter inkuberet i 2,5% normalt hesteserum i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation med det primære antistof (1:100 fortynding) i 1 time ved stuetemperatur. Det affinitetsoprensede kanin anti-BIT1 antistof (HPA012897), som tidligere blev testet for dets specificitet [14], [15] blev indkøbt fra Sigma. Kanin normalt serum blev anvendt som negativ kontrol-antistof erstatte den primære antistof på kontrol slide med 1 times inkubation. Tissue Array Objektglassene blev derefter vasket og inkuberet med ImmPRESS reagens (Vector Laboratories) efterfulgt af behandling med peroxidise substrat DAB-opløsning (DAKO Cytomation). Objektglassene blev bedømt for gennemsnitlig BIT1 farvningsintensitet ved to undersøgere uden kendskab til den patologiske status af prøverne. Den gennemsnitlige farvning blev gradueret som 0, ingen farvning; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; og 3, stærk farvning.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som middel (± S.E..). For western blots og anoikis assays, blev eksperimenter udført mindst tre gange med triplikater. Statistiske forskelle mellem grupper blev fastsat til en P værdi 0,05 under anvendelse af to-halede Students t-test. For lunge tumorvæv array analyse blev en envejs ANOVA med efterfølgende post hoc test ved hjælp af Tukey-Kramer multipel sammenligning test, der anvendes til at sammenligne den gennemsnitlige farvning intensiteten af ​​hver enkelt sag typen [14], [15]. Alle beregninger blev udført ved hjælp af NCSS statistisk software (NCSS, Kasville, UT)

Resultater

Den anoikis Resistance af A549 celler er forbundet med manglende Væsentlige Caspase Aktivitet

NSCLC celler er notorisk kendt for at være resistente over for forskellige former for apoptotiske stimuli herunder dødsfald receptorstimulering, cytotoksiske lægemidler, og stråling. Evne NSCLC at unddrage apoptose er blevet tilskrevet dels en ineffektiv caspase-uafhængig maskiner [17], [18]. Men mekanismerne i hvordan NSCLC blokke anoikis ikke blevet grundigt undersøgt. For at løse potentielle nytte af caspase-uafhængige mekanismer omgå anoikis modstand NSCLC celler, vi først undersøgte bidrag caspase vej hos anoikis. Overensstemmelse med tidligere rapporter [20], den NSCLC A549 udviste meget lavt niveau af apoptose ved dyrkning i suspension (figur 1A). Staurosporin (STS), en potent kinaseinhibitor signifikant apoptose i disse celler (figur 1A). For at løse rolle caspase afhængige vej i anoikis blokade i A549 celler, undersøgte vi cytosoliske frigivelse af mitokondrie cytochrom c protein (en afgørende faktor i aktivering downstream caspase effektorer) under udstationering. I modsætning til STS behandlede celler, som udviste betydelige mængder cytochrom c i cytoplasmaet, løsnede celler udviste kun spormængder af cytochrom c i den cytoplasmatiske fraktion (figur 1B). Dernæst monitorerede vi aktiveringen af ​​den nedstrøms eller bøddel caspase 3 via spaltning af det fluorescerende caspase-3 substrat (figur 1C) og behandlingen af ​​pro-caspase 3 til immunoblotting (figur 1D). I overensstemmelse med mangel på betydelig cytosoliske frigivelse af cytochrom c, viste løsnede A549-celler ingen væsentlig caspase 3-aktivering (figur 1C) og vises ingen forarbejdning af pro-caspase 3 (figur 1D). Enden mål for caspase maskiner er at spalte nukleare poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) protein [5], [6]. Som vist i fig. 1E, PARP forblevet relativt intakt i sin native 116 kDa form løsrevne A549 celler (Figur 1E). Tilsammen indikerer disse resultater, at anoikis modstand A549-celler er associeret med en ineffektiv cytochrom c /caspase-afhængig celledød pathway.

A. Celler blev dyrket er fastgjort (A) eller frigøres fra ECM i 24 timer (D24) og 48 timer (D48) og blev høstet for apoptose-analyse under anvendelse celledøden Elisa ELISA. Parallelt blev celler også behandlet med 1 pM staurosporin (STS) i 24 timer og underkastet til celledød Elisa ELISA. B. Cytosoliske fraktioner blev opnået fra celler i A og analyseret for tilstedeværelsen af ​​cytochrom c ved western blot. C. Tilstedeværelsen af ​​caspase-3-lignende aktivitet i cellelysaterne fra celler behandlet i A blev bestemt ved spaltning af et fluorescerende substrat z-DEVD-AFC (DEVD). D. og E. celler i en blev underkastet western blotting til påvisning af behandling af pro-caspase 3 (D) og PARP (E). I A og C, blev tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer, * angiver p. 0,05 sammenlignet med tilknyttede betingelser (Students t test)

BIT1 svækker anoikis Resistance af lungekræft celler

i betragtning af manglen på betydelig frigørelse-induceret caspase aktivering i A549-celler, derefter udforsket vi rolle BIT1 celledød pathway i forankringsuafhængig overlevelse af disse celler. Vi øgede ekspression af mitokondrie BIT1 i A549 celler via transfektion med en BIT1 konstruktion, der udtrykker BIT1 protein udelukkende i mitokondrierne (BIT1 mito) [11], [15], og afprøvet cellernes evne til at overleve i fravær af vedhæftede fil fra ECM. Den BIT1 mito og kontrol transficerede celler havde den samme grad af spontan apoptose ved dyrkning fastgjort til en dyrkningsskål (figur 2A). I slående kontrast, de BIT1 Mito transficerede celler udviste signifikant forøget apoptose end kontrol- celler efter løsrivelse. Lignende resultater blev fundet, når BIT1 mito blev indført i human NSCLC H460 cellelinje (figur S1). For at løse specificitet anoikis induktion ved BIT1 mito, målrettet vi BIT1 ekspression i cytoplasmaet i A549-celler ved anvendelse af en BIT1 konstrukt, som indeholder et mærke på den N-terminale region af BIT1 protein (BIT1 cyto) [11] , [15]. Exogen ekspression af cytoplasmatisk lokaliseret BIT1 (BIT1 cyto) i A549 (figur 2B) og H460 (figur S2) -celler udløste apoptose. Den celledød domæne (CDD) af BIT1 blev for nylig kortlagt ved de N-terminale 62 aminosyrer og er vist at være effektiv til at inducere apoptose i brystcancerceller [19]. Indførelse af CDD peptidet resulterede også i apoptose i A549 (figur 2C) og H460 (fig S3) celler. Yderligere karakterisering af BIT1 anoikis pathway i A549-celler bekræftede, at BIT1 udløste celledød uafhængigt af caspaser. Først fandt vi ingen signifikant behandling af bøddelen caspase 3 i BIT1 transfekterede celler (Figur 2D). For det andet, den nedstrøms nukleare substrat af caspaser, PARP, forblev intakt (figur 2D). For det tredje, den pan-caspaseinhibitoren z-Vad-FMK var ineffektiv i at blokere BIT1-inducerede anoikis (Figur 2E). I overensstemmelse med den manglende BIT1 virkning på caspaseaktivering blev ekspressionen af ​​apoptose familien af ​​regulatorer, der styrer caspase-afhængige mitokondrie apoptosecyklus ikke ændret af BIT1 (figur 2D). Især steady state niveauer af anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-xl proteiner samt den pro-apoptotiske Bax og Bad proteiner forblev uændret ved ektopisk BIT1 i både knyttet og fritliggende betingelser. Disse resultater viser, at BIT1 kan omgå anoikis modstand lungekræft celler gennem induktion af en caspase-uafhængig apoptosecyklus.

A. Celler blev transficeret med C-terminalt myc-mærket mitokondrie lokaliseret BIT1 (BIT1 mito) eller tom vektor konstrukt. 24 h efter transfektion blev celler dyrket blive fastgjort eller frigjort fra ECM. Efter 48 timer i kultur blev celler høstet og analyseret for apoptose ved at måle mængden af ​​DNA histon-fragmenter (celledød ELISA). B og C. Celler blev transficeret med det N-terminalt myc tagget cytoplasmatisk lokaliseret BIT1 (BIT1 cyto) (B), BIT1 celledød domæne (CDD) (C), eller vektorkonstruktion og 48 timer senere blev celler udsat for celledød ELISA. D. vektor eller BIT1 mito transficerede celler blev dyrket er fastgjort (A) eller fritliggende (D) fra ECM i de angivne tidsrum. Celler blev derefter høstet og underkastet western blotting mod specifikke antistoffer mod caspase-3, PARP, Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bad, myc, og B-actin. E. BIT1 mito transficerede celler blev dyrket i fastgjort eller frigjort betingelser i nærvær af z-Vad-fmk (50 uM) eller DMSO i 48 timer. Celler blev derefter høstet og underkastet til celledød ELISA. I A, B, og C, blev tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer, * angiver p. 0,05 af Students t-test

For yderligere at bekræfte rolle BIT1 som anoikis effektor i lungekræft, vi undersøgte, om knockdown af endogen BIT1 udtryk vil påvirke anoikis ufølsomhed af A549 celler. Vi ræsonnerede, at A549 celler vil undergå anoikis upon langvarig kultur i suspension, og hvis ablation af BIT1 apoptosecyklus kan yde anoikis beskyttelse. Faktisk efter en langvarig 72 timers kultur i suspension, de frigjorte A549-celler til sidst viste tegn på apoptose (figur 3A). Den observerede anoikis induktion var forbundet med nogen væsentlig forarbejdning af caspase 3 og PARP (figur 3B), hvilket indikerer, at alternativ celledød mekanisme (r) end den caspase-afhængige vej er involveret. Vi nedregulerede derefter BIT1 ekspression i A549-celler via korte interfererende RNA’er (siRNA’er) og underkastet de BIT1 og kontrol siRNA behandlede celler til anoikis assay. To BIT1 specifikke siRNA’er # 1 og # 2 viste en signifikant 70-80% nedregulering af BIT1 ekspression (figur 3C). Sammenlignet med A549 parentale eller kontrol siRNA behandlede celler, de BIT1 siRNA transficerede celler udviste nedsat apoptose efter en 72 h dyrkning i suspension (figur 3D). At supplere disse resultater, vi også genereres to stabile BIT1 knockdown A549 afledte kloner, nemlig BIT1 shRNA1 og BIT1 shRNA2, med hver klon udtrykker et særskilt BIT1 shRNA retter sig mod en anden sekvens i 3′-kodende region af BIT1 mRNA. Sideløbende hermed blev stabil kontrol shRNA klonerne 1 og 2 genereret fra nontargeting scrambled shRNAs. Som vist i figur 3E, den stabile BIT1 shRNA1 og shRNA2 viste en reduktion i BIT1 ekspression med 70% og 80% sammenlignet med kontroldyr shRNA kloner. Den stabile BIT1 shRNA1 og shRNA2 blev derefter kombineret for at generere BIT1 shRNA pool, mens kontrol- shRNA klonerne 1 og 2 omfattede kontrollen shRNA pool (figur 3E). Overensstemmelse med de data, der stammer fra siRNA undersøgelser var den BIT1 shRNA pool udviste en signifikant reduceret niveau af apoptose end kontrollen shRNA pool efter en 72 h dyrkning i suspension (figur 3F). Overensstemmelse med den manglende virkning af ektopisk BIT1 på den mitokondriske pathway (figur 2D), blev observeret forøget anoikis resistens i BIT1 Knockdown celler ikke forbundet med ændringer i ekspressionsniveauerne af Bcl-2-familien af ​​apoptose regulatorer (Figur S4). Disse resultater, sammenholdt med vores resultater tyder på, at eksogen mitokondrie BIT1 kan fremkalde anoikis, giver stærke beviser for, at BIT1 apoptosecyklus udgør en vigtig caspase-uafhængig anoikis mekanisme i lunge kræftceller.

A. og B. Celler blev dyrket i vedlagte (A) eller fritliggende (D) betingelser i de angivne tidsrum og derefter underkastet underkastet celledød ELISA (A) eller western blotting (B) med antistoffer mod caspase-3, PARP, og B actin. I A, blev udført tre uafhængige forsøg i triplikater; *, P 0,05 sammenlignet med vedhæftede celler (Students t test). C. og D. Celler blev transficeret med styre- eller BIT1 specifikke siRNA’er, og 48 timer senere blev celler underkastet immunoblotting (C) med antistoffer mod BIT1 og B-actin at bekræfte knockdown af BIT1 ekspression.