PLoS ONE: Silencing af keratinocytvækstfaktor Receptor Gendanner 5-fluorouracil og Tamoxifen Effekt på Responsive Cancer Cells

abstrakt

Baggrund

Keratinocytvækstfaktor receptor (KGFR) er en splejsningsvariant af FGFR2 genet udtrykkes i epitelceller. Aktivering af KGFR er en nøglefaktor i reguleringen af ​​fysiologiske processer i epitelceller såsom proliferation, differentiering og sårheling. Ændringer af KGFR signalering har været knyttet til patogenesen af ​​forskellige epiteliale tumorer. Det er også blevet en hypotese, at dets specifik ligand, KGF, kan bidrage til udvikling af resistens over for 5-fluorouracil (5-FU) i epitelial kræft og tamoxifen i østrogen-positive brystkræft.

Metode /vigtigste resultater

Lille interfererende RNA blev transficeret ind i en human keratinocytcellelinje (HaCaT), en brystcancer afledt cellelinie (MCF-7) og en keratinocyt primær kultur (KCS) for at inducere selektiv nedregulering af KGFR ekspression. En stærk og meget specifik reduktion af KGFR udtryk blev observeret ved både RNA (reduktion = 75,7%,

P

= 0,009) og protein niveau. KGFR tavshed celler viste en reduceret modtagelighed over for KGF behandling som vurderet ved måling proliferationshastighed (14,2% versus 39,0% af kontrolcellerne,

P

0,001) og cellevandring (24,6% versus 96,4% af kontrollen celler,

P

= 0,009). I mocktransfekterede MCF-7-celler, KGF modvirker kapacitet på 5-FU til at inhibere celleproliferation, hvorimod i KGFR tavshed celler KGF svagt interfererer med 5-FU antiproliferativ virkning (11,2% versus 28,4% af kontrolcellerne,

P

= 0,002). Kapaciteten af ​​5-FU at inducere celledød ophæves ved co-behandling med KGF, hvorimod i KGFR tavshed celler 5-FU effektivt inducerer celledød endog kombineres for at KGF, som bestemt ved evaluering af cellelevedygtighed. Tilsvarende til kapaciteten af ​​tamoxifen hæmme MCF-7 og KCS spredning er stærkt reduceret med KGF behandling og er fuldstændig restaureret i KGFR tavshed celler (12,3% mod 45,5% af kontrol celler,

P

0,001) .

konklusioner /betydning

Disse resultater tyder på, at selektiv hæmning af KGF /KGFR vej kan være et nyttigt redskab til at forbedre effektiviteten af ​​de terapeutiske strategier for visse epiteliale tumorer.

Henvisning: Rotolo S, Ceccarelli S, Romano F, Frati L, Marchese C, Angeloni A (2008) Silencing af keratinocytvækstfaktor Receptor Gendanner 5-fluorouracil og Tamoxifen Effekt på Responsive kræftceller. PLoS ONE 3 (6): e2528. doi: 10,1371 /journal.pone.0002528

Redaktør: Stefan Maas, Lehigh University, USA

Modtaget: May 14, 2008; Accepteret: 27. maj 2008; Udgivet: 25 Jun 2008

Copyright: © 2008 Rotolo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra MIUR, Cofin 2005 og fra regionen Lazio tilskud udstedt for Progetto di Ricerca Finalizzata 2005. Funders var ikke direkte eller indirekte involveret i design eller undersøgelsen gennemføres i nogen del.

Konkurrerende interesser : forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Keratinocytvækstfaktor receptor (KGFR /FGFR2-IIIb) er en tyrosinkinaseprotein der hører til familien af ​​fibroblast vækstfaktor. receptorer (FGFR’er). KGFR betegner en splejsning transkript variant af FGFR2 genet og udtrykkes på epitelceller i forskellige organer. Den alternativt splejset isoform, kendt som FGFR2-IIIc, findes i celler af mesenkymal slægter [1], [2]. KGFR spiller en central rolle i reguleringen af ​​epitelial vækst og differentiering, udfører sine biologiske virkninger i en parakrin måde [3] gennem højaffinitetsbinding til sine specifikke ligander, nemlig keratinocytvækstfaktor (KGF /FGF7), FGF10 og FGF22 [4 ]. Blandt dem, KGF virker ikke kun som et potent mitogen for primære humane keratinocytter, men også at fremme deres differentiering program [5] og beskytte dem mod apoptose induktion [6], [7]. Endvidere er KGF involveret i både eksperimentelle [8], [9] og

in vivo

[10] sårheling modeller, stimulere migration af keratinocytter [11], [12] og inducere reorganisering af aktincytoskelettet derfor stigende epitelcelle motilitet [13].

for nylig har der været en stigende interesse omkring potentielle rolle ændringer af KGF /KGFR signalering i epitelial tumorigenese. Forøget KGFR mRNA-ekspression er blevet detekteret i en lang række tumorer af epiteloprindelse, såsom lunge-, colon-, mave-, bugspytkirtel og prostatacancer. I nogle tilfælde, såsom forøget ekspression synes at være forbundet med celletransformation og måske malign progression [14]. Desuden har KGF administration vist sig at øge cellemotilitet i østrogenreceptor (ER) -positive brysttumorceller [15], [16], for potentielt involverede i brystkræft progression og metastase [17] og for at forbedre den invasive potentiale gastriske carcinoma afledt cellelinier overudtrykker KGFR [18].

Andre undersøgelser førte til hypotesen, at KGF kan udøve antiapoptotisk aktivitet på visse cancerceller samt inhibering af apoptose induceret af kemoterapeutisk lægemiddel 5-fluoruracil (5-FU ) [19] – [22]. Udviklingen af ​​cancerceller af resistens mod traditionelle kemoterapeutiske midler, såsom 5-FU, observeres jævnligt og er stadig en væsentlig hindring for en vellykket behandling af cancer og en fremtrædende årsag til tumor tilbagefald efter kemoterapi [23].

Desuden er det blevet foreslået, at ændringer af veje, der involverer FGF’er og beslægtede receptorer kan udgøre et af de resistensmekanismer til tamoxifen, der endelig udvikler i mange eR-positive brystkræft [24] – [27]. Imidlertid er denne hypotese ikke helt fastslået og den specifikke rolle, som den store familie af FGF’er spillede langt fra er forstået.

tilgang baseret på selektiv nedregulering af proteiner involveret i cellulære processer korreleret til tumorprogression betegner en lovende grænse for kræftbehandling. Transfektion af specifikke små interfererende RNA (siRNA’er) er et kraftfuldt værktøj til at opnå et gen-specifik knockdown og repræsenterer en potent terapeutisk strategi til behandling af flere sygdomme, såsom virusinfektioner, neurologiske lidelser og kræft [28].

Den eksklusive mål specificitet siRNA mod sygdomsfremkaldende relevant mRNA er en væsentlig forudsætning for udnyttelse af denne teknologi. I denne undersøgelse har vi selektivt nedreguleret KGFR mRNA og proteinekspression i tre epiteliale cellelinjer, HaCaT keratinocyter, MCF-7 brystcancer celle og primære dyrkede keratinocytter (KCS), med en ny tilgang siRNA design, baseret på udnyttelsen af ​​DICER endonuklease substrat 27-mer dsRNA’er at udløse RNA-interferens (RNAi). Denne teknik giver øget effektivitet og længere varighed af RNAi sammenlignet med traditionelle 21-mer siRNA’er, hvilket tillader brug af lavere koncentrationer af RNAi i målceller, hvilket i høj grad reducerer bivirkningerne. Desuden tillader målretning af websteder, der er refraktære over for undertrykkelse med 21-mer siRNA’er [29].

Vi analyserede virkningerne af KGFR siRNA om karakteristika bio-parametre som cellelevedygtighed, proliferation, apoptose og migration af de testede cellelinier. Endelig har vi vurderet om nedregulering af KGFR ekspression er i stand til at inhibere 5-FU og tamoxifen resistens induceret af KGF i cellekulturer.

Resultater

Inhibering af KGFR mRNA-ekspression af siRNA’er

Der er ingen klare regler for siRNA target site udvælgelse til specifikke mRNA sekvenser. Men inden for en enkelt mRNA sekvens forskellige siRNA molekyler viser en dramatisk variabilitet med hensyn til effektivitet og specificitet gendæmpning. Her brugte vi laboratorie- og web-baserede programmer, i henhold til de tidligere beskrevne kriterier (https://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html), til at vælge tre siRNA’er sekvenser rettet mod FGFR2 genet. Det er kendt, at de samme gen koder for to alternative transskripter, betegnet KGFR /FGFR2-IIIb og FGFR2-IIIc, der afviger for en divergerende strækning af 49 aminosyrer i deres ekstracellulære domæne og vise forskellige ligandbindende egenskaber. For således at realisere en specifik knockdown af KGFR transkriptet, valgte vi siRNA’er sekvenser målrettet inden for exon 8 af FGFR2 genet, som er splejset kun i KGFR isoformen (fig. 1A). Alle siRNA’er sekvenser blev indgået en BLAST-søgning for at sikre, at der ikke var nogen signifikant homologi med andre gener. Som om den relative ekspression af de to FGFR2 isoformer i vore eksperimentelle modeller, har HaCaT-celler er tidligere blevet vist at udtrykke FGFR2-IIIc variant af FGFR2 i to størrelsesordener mindre beløb end FGFR2-IIIb splejsningsvariant [30]; i MCF-7-celler, tidligere vist at udtrykke begge isoformer [31], demonstrerede vi, at FGFR2-IIIb-ekspression er betydeligt højere end for FGFR2-IIIc (11 gange stigning) (fig. 1B). Evnen af ​​hver designet siRNA og en pooled sæt af de tre duplexer til specifikt reducere niveauerne af KGFR mRNA, uden at påvirke ekspressionen af ​​FGFR2-IIIc isoform, blev analyseret i MCF-7 og HaCaT celler. Forbigående transfektioner blev anvendt til at levere hver siRNA og celler inkuberet med liposomale vektor alene (mock-transfektion) blev anvendt som kontrol. Den optimale koncentration for siRNA transfektion var eksperimentelt bestemt til at være 5 nM (data ikke vist), i overensstemmelse med de seneste observationer, der er angivet giftige mekanismer, off-target effekter og stimulering af immunrespons fremkaldt af høje doser af syntetisk RNAi

in vitro

in vivo

[32]. Evnen af ​​de forskellige siRNA’er at reducere mængden af ​​KGFR mRNA blev estimeret ved Q-RT-PCR. I MCF-7 celler vi evaluerede også specificiteten af ​​de designede siRNA’er. KGFR og FGFR2-IIIc mRNA niveauer blev normaliseret til p-actin mRNA-niveauer. 48 timer efter transfektion, MCF-7-celler transficeret med den poolede sæt siRNA-1, -2 og -3 udtrykte en statistisk signifikant reduceret mængde KGFR mRNA sammenlignet med mock-transficerede celler (0,243 fold, reduktion = 75,7%,

P

= 0,009) (fig. 2A). En mindre indlysende effekt blev opnået ved transfektion med de enkelte rækkehuse: siRNA-1 (0,613 fold, reduktion = 38,7%,

P

= 0,168), siRNA-2 (0,405 fold, reduktion = 59,5%,

P

= 0,068) og siRNA-3 (0,406 fold, reduktion = 59,4%,

P

= 0,061) (fig. 2A). Omvendt hverken individuelle siRNAs eller siRNA-pulje viste nogen hæmmende effekt på FGFR2-IIIc mRNA-niveauer (siRNA-1: 0,902 fold, reduktion = 9,8%,

P

= 0,71; siRNA-3: 0,914 fold, reduktion = 8,6%,

P

= 0,36; si-RNA-3: 0,943 fold, reduktion = 5,7%,

P

= 0,52; siRNA-pool: 1,028 fold, forskel = 2,8% ,

P

= 0,85) (fig. 2B).

(A) Skematisk tegning repræsenterer den alternative splejsning af FGFR2-IIIc og KGFR /FGFR2-IIIb. Det indsatte (*) rapporterer cDNA-sekvensen (nucleotider fra 1590 til 1698), der svarer til hele exon 8, med sekvenserne omfattet af de tre siRNA’er (grå kasser). (B) Niveauerne af KGFR og FGFR2-IIIc mRNA-ekspression blev bestemt ved Q-RT-PCR, og normaliseret til p-actin mRNA-niveauer. KGFR mRNA i MCF-7-celler blev bestemt som fold med hensyn til FGFR2-IIIc mRNA. Grafen viser interkvartile område af tre uafhængige eksperimenter (kasser), deres gennemsnitlige (horisontale stiplede søjler) og 95% konfidensinterval (CI) (whiskers). Tosidet Students

t

test blev anvendt til at sammenligne KGFR versus FGFR2-IIIc udtryk: *

P

0,001. De ledsagende tabel rapporter betyder udtrykket niveau, Standard Error (SE), og 95% CI for hver analyseret prøve.

(A, B) MCF-7 celler blev mock transficeret eller transficeret med 5 nM siRNA -1, -2, -3, eller med en poolet sæt af dem, og totalt RNA blev ekstraheret 48 timer efter transfektion. Niveauerne af KGFR (A) og FGFR2-IIIc (B) mRNA-ekspression blev bestemt ved Q-RT-PCR, og normaliseret til p-actin mRNA-niveauer. KGFR (A) eller FGFR2-IIIc (B) mRNA i siRNA-transficerede celler blev bestemt som fold i forhold til det, som udtrykkes i mock-transficerede celler. For hver behandling, graferne viser interkvartile område af tre uafhængige eksperimenter (kasser), deres gennemsnitlige (horisontale stiplede søjler) og 95% konfidensinterval (CI) (whiskers). Tosidet Students

t

test blev anvendt til at sammenligne siKGFR-transficeret versus mocktransfekterede celler: *

P

= 0,009. De ledsagende tabeller rapporterer betyder udtrykket niveau, Standard Error (SE), og 95% CI for hver analyseret prøve.

Derfor blev alle efterfølgende forsøg udført ved transfektion siRNA-pulje, der matcher de almindeligt vedtagne kriterier for siRNA effektivitet ( 70% reduktion i mål mRNA). Da puljen viser en høj specificitet for KGFR isoform, vil det blive henvist som siKGFR i resten af ​​manuskriptet.

Tidsforløb for siRNA-medieret KGFR tavshed

At evaluere varigheden og effekten af ​​KGFR lyddæmpning udførte vi tidsforløbet eksperimenter på HaCaT celler transficeret med siKGFR, bestemmelse af mængden af ​​KGFR mRNA ved Q-RT-PCR ved 6, 24, 48, 72 og 96 timer efter transfektion (fig. 3A). En reduktion af KGFR mRNA-ekspression blev observeret 24 timer efter transfektion, sammenlignet med mock-transficerede celler (1.127 versus 2.730 fold, forskel = 58,7%,

P

0,001), mens fuld effekt blev opnået ved 48 og 72 timer (1,127 versus 4,779 fold, forskel = 76,4%,

P

0,001 og 1,079 versus 4,463 fold, forskel = 75,8%,

P

0,001 henholdsvis) fra transfektion . 96 timer efter transfektion blev et kraftigt fald i KGFR udtryk også observeret i kontrollen. Men i transfekterede celler, nedregulering af KGFR udtryk var stadig signifikant (1,215 versus 1,963 fold, forskel = 38,1%,

P

= 0,017). På grundlaget for tidsforløbet resultater og i henhold til de tidligere rapporter, der viser, at toppen af ​​KGFR proteinekspression nås ved 72 timer efter sult [30] besluttede vi at udføre alle de efterfølgende eksperimenter på 72 timer efter siKGFR transfektion.

(A) HaCaT-celler blev mock transficeret eller transficeret med 5 nM siKGFR, og totalt RNA blev ekstraheret fra de transficerede celler 6, 24, 48, 72 og 96 timer senere. Niveauerne af KGFR mRNA-ekspression blev bestemt ved Q-RT-PCR, og normaliseret til p-actin mRNA-niveauer. Mængden af ​​KGFR mRNA ved hvert tidspunkt blev udtrykt som fold af KGFR mRNA-niveau i forhold til den 6 timer tidspunkt. For hvert tidspunkt, grafen viser interkvartile område af tre uafhængige eksperimenter (kasser), deres gennemsnitlige (horisontale stiplede søjler) og 95% CI (whiskers). De ledsagende tabel rapporter betyder udtrykket niveau, Standard Error (S.E.), og 95% CI for hver analyseret prøve. Tosidet Students

t

test blev anvendt til at sammenligne siKGFR-transficeret versus mocktransfekterede celler: *

P

0,001 (24 h); **

P

0,001 (48 h); †

P

0,001 (72 h); ‡

P

= 0,017 (96 h). (B) HaCaT-celler blev mock transficeret eller transficeret med 5 nM siKGFR. 24 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 20 ng /ml KGF i 48 timer. Niveauerne af KGFR mRNA-ekspression blev bestemt ved Q-RT-PCR, og normaliseret til p-actin mRNA-niveauer. Mængden af ​​KGFR mRNA blev udtrykt som fold af KGFR mRNA niveauer i forhold til ubehandlede mock-transficerede celler. Graf og tabel rapport de samme datasæt som i (A) for hver analyseret prøve.

P

værdier blev bestemt ved hjælp af to-sidet Student s

t

test: *

P

= 0,003 versus ubehandlede mocktransfekterede celler; **

P

= 0,018 versus KGF-behandlede mocktransfekterede celler. (C) HaCaT-celler blev transficeret og behandlet som i (B), og niveauerne af KGFR proteinekspression blev bestemt ved Western blot-analyse under anvendelse af et polyklonalt anti-bek antistof. Den samme blot blev probet for tubulin som kontrol for lige belastning. Mængden af ​​KGFR protein blev evalueret ved densitometrisk analyse; værdierne fra et repræsentativt forsøg blev standardiseret til tubulin niveauer, udtrykt som fold af KGFR protein i forhold til ubehandlede mocktransfekterede celler og rapporteres som en graf.

nedregulering af KGFR mRNA og protein-ekspression ved siRNA i KGF-behandlede HaCaT celler

det er kendt, at behandling af epitelceller med KGF inducerer flere arrangementer såsom celleproliferation og differentiering gennem binding til KGFR og internalisering af receptoren koblet til reduktion af niveauet af KGFR mRNA-ekspression . Således har vi undersøgt virkningen af ​​siKGFR transfektion i cellekulturer i nærvær af 20 ng /ml KGF. mRNA og protein ekspressionsniveauer blev testet ved Q-RT-PCR og Western blot-analyse. En skarp nedgang i KGFR mRNA blev observeret i celler transficeret med siKGFR sammenlignet med mock-transficerede celler (0,232 fold, reduktion = 76,8%,

P

= 0,003) (fig. 3B). I nærværelse af KGF, observerede vi en nedmodulering i ekspressionen af ​​KGFR også i mock-transficerede celler. Imidlertid KGFR mRNA inhibering med siRNA var stadig tydelig (0,265 versus 0,598 fold, reduktion = 55,7%,

P

= 0,018) (fig. 3B). I det samme sæt af eksperimenter blev niveauerne af KGFR proteinekspression også analyseret ved Western blot. Som vist i fig. 3C, KGFR ekspression blev signifikant reduceret i siKGFR-transficerede celler sammenlignet med mock-transficerede celler. Densitometrisk analyse bekræftede, at siKGFR reduceret proteinekspression i både ubehandlede og KGF-behandlede celler, med mere end 50% med hensyn til mock-transficerede celler (0,47 fold versus 1 fold, reduktion = 53% og 0,20 versus 0,73 fold, reduktion = 72,6 %, henholdsvis) (graf fig. 3C).

siRNA-medieret nedregulering af KGFR hæmmer celledeling og celle migration induceret af KGF

for at evaluere de biologiske virkninger af KGFR lyddæmpning, vi undersøgte siKGFR kapacitet til at påvirke KGF-induceret proliferation ved at udføre en proliferationsassay på HaCaT-cellelinje. Udpladede celler blev transficeret med siKGFR og dyrket i 48 timer i standard medium suppleret eller ikke med 20 ng /ml KGF. Celleproliferation blev bestemt ved at tælle celler positive for Ki67-antigen, som identificerer cykling celler, og rapporteres i grafen som procentdelen af ​​positive celler (fig. 4A). Som forventet i mock-transficerede celler observerede vi en stigning i HaCaT celler proliferation efter KGF behandling, sammenlignet med ubehandlede celler (39% versus 13,6%, 2,9 gange stigning,

P

0,001). Den nedregulering af KGFR udtryk gennem specifikke siRNA næsten helt afskaffet KGF effekt på HaCaT celler spredning, med en spredning sats på baggrundsniveau (14,2% versus 39%, 2,7 fold forskel,

P

0,001) (Graf Fig . 4A).

(A) spredning assay. HaCaT-celler, dyrket på dækglas, blev mock transficeret eller transficeret med 5 nM siKGFR. 24 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 20 ng /ml KGF i 48 timer. Derefter blev cellerne fikseret og udsat for immunfluorescensanalyse med et polyklonalt antistof rettet mod Ki67 (rød). Billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Scale bar, 10 um. Kerner blev visualiseret under anvendelse af 4 ‘, 6-diamido-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI). Procentdelen af ​​Ki67-positive celler blev bestemt ved at tælle antallet af Ki67-positive kerner i forhold til samlet antal kerner i ti forskellige områder tilfældigt udtaget fra tre forskellige eksperimenter, udtrykt som middelværdi ± 95% CI og rapporteres som en graf.

P

værdier blev bestemt ved hjælp af Students

t

test: *

P

0,001 versus ubehandlede mocktransfekterede celler; **

P

0,001 versus KGF-behandlede mocktransfekterede celler. (B, C) sårheling assay. HaCaT (B) og MCF-7 (C) celler blev transficeret som i (A). 48 timer efter transfektion blev en cellefri område (sår) indført i sammenflydende kulturer, som beskrevet i Materialer og Metoder. Celler blev behandlet med eller uden 50 ng /ml KGF og fik lov til at migrere i 24 timer før fotografering under fasekontrastmikroskopi. Billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Målestokke 10 um. Cellemigrering evalueret ved repopulation af det oprindelige sår med celler: procentdelen af ​​genvundet område blev målt ved billedanalyse og værdier i graferne er gennemsnittet af tre plader for hver betingelse ± 95% CI.

P

værdier blev bestemt ved hjælp af Students

t

test: (B) *

P

0,001 versus ubehandlede mocktransfekterede celler; **

P

0,001 versus KGF-behandlede mocktransfekterede celler. (C) *

P

= 0,035 versus ubehandlede mocktransfekterede celler; **

P

= 0,009 versus KGF-behandlede mocktransfekterede celler.

Vi analyserede derefter virkningen af ​​KGFR tavshed på celle migration, en anden kompleks og strengt reguleret cellulær proces stærkt induceret af KGF-behandling. Til dette formål har vi udført en sårhelende assay. 48 timer efter transfektion med siKGFR en cellefri område blev indført i monolag af HaCaT celler, som tidligere beskrevet [33]. Celler behandlet eller ikke med 50 ng /ml KGF, koncentrationen rapporteret at være mere effektive i dette assay [34], fik lov til at migrere fra kanten af ​​såret i 24 timer. Som vist i fig. 4B, såret lukning blev næsten afsluttet 24 timer efter indledende sårdannelse i KGF-behandlede mock-transficerede celler, medens ubehandlede mock-transficerede celler viste en begrænset vandring i forhold til T0 (96,4% versus 23,1%, 4,2 gange stigning,

P

= 0,035) (graf fig. 4B). Transfektionen med siKGFR signifikant inhiberede cellemigrering induceret af KGF (fig. 4B) og efterfølgende reduceres det udvundne område fra 96,4% af kontrolcellerne til 24,6%, 3,9 ganges forskel,

P

= 0,009) (Graf Fig . 4B).

Den samme sårhelende assay blev også udført på MCF-7 brystcancerceller, kendt for at reagere med KGF i form af motilitet [15], med lignende resultater (fig. 4C). KGF behandling fremmet en stærk genoprettelse af bestanden, sammenlignet med den for ubehandlede mocktransfekterede celler (83% versus 29,6%, 2,8 gange stigning,

P

0,001). I KGFR tavshed celler blev KGF-induceret migration næsten afskaffet, i sammenligning med kontrol celler (25,4% mod 83%, 3,3 fold forskel,

P

0,001). (. Graph figur 4C)

Disse resultater antydede, at KGFR nedregulering er effektiv til inhibering KGF biologiske virkninger, såsom stimulering af celleproliferation og migration, enten i HaCaT keratinocyter eller brystcancer epitelceller.

KGFR silencing inhiberer genoprettelse af cellen proliferation induceret af KGF på 5-FU-stimulering

Ofte, cancerceller udvikle resistens over for almindelige kemoterapeutiske lægemidler, såsom 5-FU, således udfordrende kemoterapi virkning [23]. For at undersøge den rolle, KGFR i etableringen af ​​resistens over for 5-FU, vi forbigående slået ned KGFR ekspression ved siRNA i MCF-7 brystcancer cellelinje.

transfektion med siKGFR blev udført i tilstedeværelse eller ikke af 20 ng /ml KGF, 25 ug /ml 5-FU eller en kombination af dem. Først, vi evaluerede effektiviteten af ​​KGFR silencing ved at analysere både mRNA og protein-ekspressionsniveauer.

Som vist i fig. 5A, behandling med KGF af mock-transficerede celler reducerede ekspressionen af ​​KGFR mRNA sammenlignet med ubehandlede celler uafhængigt af tilstedeværelsen af ​​5-FU i cellekulturerne (0,555 fold, reduktion = 44,5%,

P

= 0.170, og 0,545 gange, reduktion = 45,5%,

P

= 0,183, henholdsvis). Desuden 5-FU alene dårligt påvirket KGFR mRNA-ekspression (0,911 fold, reduktion = 8,9%,

P

= 0,711). I siKGFR-transficerede kulturer, observerede vi en stærk virkning på mRNA-ekspression (0,133 fold, reduktion = 86,7%,

P

= 0,039), med beskedne variationer i respons på tilstedeværelsen eller fraværet af KGF og /eller 5 -FU. Disse data bekræftede, at MCF-7-celler reagerer på samme måde til HaCaT-celler som respons på KGFR lyddæmpning. Endvidere blev resultaterne opnået på RNA-niveau bekræftet ved at analysere proteinekspression, som vist i fig. 5B. Den specifikke siRNA faldt betydeligt KGFR protein i ubehandlede celler, såvel i KGF og /eller 5-FU-behandlede celler, med 60% -70% i forhold til samme behandling i mock-transficerede celler (Graph fig. 5B).

(A) MCF-7 celler blev mock transficeret eller transficeret med 5 nM siKGFR. 48 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 20 ng /ml KGF, 25 ug /ml 5-FU eller KGF plus 5-FU i 24 timer. Niveauerne af KGFR mRNA-ekspression blev bestemt ved Q-RT-PCR, og normaliseret til p-actin mRNA-niveauer. Mængden af ​​KGFR mRNA i siKGFR-transficerede celler blev udtrykt som fold af niveauet for KGFR mRNA i forhold til ubehandlede mock-transficerede celler. For hver behandling, grafen viser interkvartile område af tre uafhængige eksperimenter (kasser), deres gennemsnitlige (horisontale stiplede søjler), og 95% CI (whiskers). De ledsagende tabel rapporter betyder udtrykket niveau, Standard Error (S.E.), og 95% CI for hver analyseret prøve.

P

værdier blev bestemt ved hjælp af Students

t

test: *

P

= 0,039 versus ubehandlede mocktransfekterede celler. (B) MCF-7-celler blev transficeret og behandlet som i (A), og mængden af ​​KGFR protein blev vurderet ved Western blot-analyse med et anti-bek polyklonalt antistof. Tubulin tjente som en belastning kontrol. Mængden af ​​KGFR protein blev evalueret ved densitometrisk analyse: værdierne fra et repræsentativt eksperiment blev standardiseret til tubulin niveauer, udtrykt som fold af KGFR niveau i forhold til ubehandlede mocktransfekterede celler og rapporteres som en graf

Vi næste udført en proliferationsassay på MCF-7-celler, transficeret med siKGFR eller mock-transficeret og dyrket i 48 timer i standard medium suppleret eller ej med KGF, 5-FU eller en kombination af dem, som ovenfor. Celleproliferation blev vurderet ved at tælle celler positive for Ki67-antigen, og rapporteres i grafen som procentdelen af ​​positive celler (fig. 6A). Også i MCF-7 fandt vi en stigning i celleproliferation efter KGF behandling, sammenlignet med ubehandlede celler (34,8% versus 19,5%, 1,8 gange stigning,

P

= 0,004). Som forventet, behandling med 5-FU viste en antiproliferativ virkning (6,0% versus 19,5%, 3,3 ganges forskel,

P

0,001), hvilket var næsten helt ophævet ved co-behandling med KGF (28,4% versus 6,0%, 4,7 fold forskel,

P

0,001). KGFR nedregulering af siRNA næsten afskaffet KGF proliferativ effekt, både alene og i kombination med 5-FU (15,7% versus 34,8%, 2,2 fold forskel,

P

0,001 og 11,2% mod 28,4%, 2,5 gange forskel ,

P

= 0,002, henholdsvis) (fig. 6A).

(A) MCF-7-celler, dyrket på dækglas, blev mock transficeret eller transficeret med 5 nM siKGFR og 48 timer senere de blev behandlet eller ikke med 20 ng /ml KGF, 25 ug /ml 5-FU eller KGF plus 5-FU. Efter 24 timer blev cellerne fikseret og udsat for immunfluorescensanalyse med et anti-Ki67 polyklonalt antistof. Kerner blev visualiseret under anvendelse af 4 ‘, 6-diamido-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI). Celleproliferation blev evalueret som procentdel af Ki67-positive kerner i forhold til samlet antal kerner i ti forskellige områder tilfældigt udtaget fra tre forskellige eksperimenter, udtrykt som middelværdi ± 95% CI og rapporteres som en graf.

P

værdier blev bestemt ved hjælp af Students

t

test: *

P

= 0,004 og **

P

0,001 versus ubehandlet mock-transficeret celler; ***

P

0,001 versus 5-FU-behandlede mocktransfekterede celler; †

P

0,001 versus KGF-behandlede mocktransfekterede celler; ‡

P

= 0,002 versus KGF plus 5-FU-behandlede mocktransfekterede celler. (B) MCF-7-celler blev transficeret og behandlet som i (A), og Western blot-analyse af phosphorylering status ERK blev udført under anvendelse af et phospho-specifikt ERK monoklonalt antistof (p-ERK). Niveauer af total ERK blev vurderet ved at duppe med en ERK2-specifikt antistof. Mængden af ​​aktiveret ERK blev evalueret ved densitometrisk analyse: værdierne fra et repræsentativt eksperiment blev standardiseret til total ERK-niveauer, udtrykt som fold af p-ERK udtryk i forhold til ubehandlede mocktransfekterede celler og rapporteres som en graf

Det er kendt, at ERK /MAPK-vejen spiller en vigtig rolle i celleproliferation og overlevelse. Derfor udførte vi en Western blot-analyse for at vurdere ERK-aktivering, ved anvendelse af antistoffer, enten specifikke for phosphorylerede form af molekylet eller mod total ERK. Som forventet i mock-transficerede celler ERK-aktivering blev signifikant induceret af KGF-behandling (7,5 gange). Omvendt 5-FU var i stand til at nedsætte mængderne af phosphoryleret ERK (2,5 gange), som blev næsten fuldstændig restaureret ved indgivelse af KGF sammen med 5-FU (6,5 gange). I siKGFR-transficerede celler ifølge de ovenstående resultater, den stimulerende virkning af KGF på ERK-phosphorylering blev stærkt inhiberet (2 gange) (fig. 6B).

Endvidere har vi vurderet cellelevedygtigheden med krystalviolet farvning, og den efterfølgende absorbans ved 570 nm, hvilket afspejler variationer i celleantal. 48 timer efter transfektion blev celler behandlet med KGF, 5-FU eller en kombination af dem i 24 timer, som beskrevet ovenfor. Derefter blev de resterende celler fikseret og farvet med 1% krystalviolet (fig. 7A). Vi sammenlignede effekten af ​​KGF og 5-FU på celleantal, ser på indflydelsen af ​​KGFR silencing i denne proces. I mocktransfekterede celler var KGF behandling stand til at øge celleantallet (1,55 gange), 5-FU inducerede et fald af levedygtige celler (0,45 gange), mens der i nærværelse af KGF, 5-FU ikke var effektiv (1,49 gange). På den anden side, i siKGFR-transficerede celler, 5-FU-induceret celledød som forventet (0,56 gange), hvorimod behandling med KGF ikke var i stand til at inducere en stigning af celleantal (0,91 gange). I dette tilfælde 5-FU holder sin evne til at bestemme celledød, selv i nærværelse af KGF (0,49 gange) (Graf fig. 7A).

(A) MCF-7-celler blev mock transficeret eller transficeret med 5 nM siKGFR og 48 timer senere blev de behandlet eller ikke med 20 ng /ml KGF, 25 ug /ml 5-FU eller KGF plus 5-FU. Efter 24 timer blev celler fikseret, farvet med 1% krystalviolet og analyseret ved en absorbans på 570 nm. Værdierne fra et repræsentativt eksperiment blev udtrykt som relativ optisk densitet og rapporteres som en graf. (B) MCF-7-celler, dyrket på dækglas, blev transficeret og behandlet som i (A). Efter 24 timer blev de faste og underkastet immunofluorescensanalyse med et antistof rettet mod den spaltede form af caspase-3. Kerner blev visualiseret under anvendelse af 4 ‘, 6-diamido-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI). Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev vurderet ved at tælle antallet af spaltede caspase-3 positive kerner i forhold til samlet antal kerner i ti forskellige områder tilfældigt udtaget fra tre forskellige eksperimenter, udtrykt som middelværdi ± 95% CI og rapporteres som en graf. Tubulin tjente som en belastning kontrol.