PLoS ONE: ETS1 medierer MEK1 /2-afhængig Overekspression af Kræft Inhibitor af protein phosphatase 2A (CIP2A) i humane cancerceller

Abstrakte

EGFR-MEK-ERK signalvej har en etableret rolle i at fremme ondartet vækst og sygdomsprogression i humane kræftformer. Derfor identifikation af transkriptionelle mål medierende de onkogene virkninger af EGFR-MEK-ERK vej ville være yderst relevante. Kræft inhibitor af protein fosfatase 2A (CIP2A) er et nyligt karakteriseret menneskelig oncoprotein. CIP2A fremmer malign cellevækst og er overudtrykt ved høj frekvens (40-80%) i de fleste humane cancertyper. Men de mekanismer der inducerer sit udtryk i kræft stadig stort set uudforsket. Her præsenterer vi systematisk analyse af bidrag af potentielle gen reguleringsmekanismer for høj CIP2A udtryk i kræft. Vores data viser, at evolutionære konserverede CpG øer på den proksimale CIP2A promoteren ikke denatureret både i normale og kræftceller. Desuden har sekventering af den aktive CIP2A promoter region fra i alt syv normale og maligne celletyper ikke afsløre eventuelle sekvensforandringer der vil øge CIP2A udtryk specifikt i kræftceller. behandling af cancerceller med forskellige signalering pathway hæmmere afslørede imidlertid, at CIP2A mRNA-ekspression var følsom over for inhibering af EGFR-aktivitet samt inhibering eller aktivering af MEK-ERK pathway. Desuden MEK1 /2-specifikke siRNA’er faldt CIP2A proteinekspression. Række CIP2A promotor-luciferase-konstruktioner blev skabt for at identificere proximale -27 til -107-promotorområdet ansvarlig for MEK-afhængig stimulering af CIP2A ekspression. Yderligere mutagenese og kromatin immunopræcipitationsforsøg afslørede ETS1 som transkriptionsfaktoren medierende stimulering af CIP2A udtryk gennem EGFR-MEK vej. Således er ETS1 sandsynligvis mediere høj CIP2A udtryk i humane kræftformer med øget EGFR-MEK1 /2-ERK pathway aktivitet. Disse resultater tyder også på, at der ud over sin faste rolle i invasionen og angiogenese kan ETS1 understøtte ondartet cellulær vækst via regulering af CIP2A ekspression og protein fosfatase 2A hæmning

Henvisning:. Khanna A, Okkeri J, Bilgen T, Tiirikka T, Vihinen M, Visakorpi T, et al. (2011) ETS1 medierer MEK1 /2-afhængig Overekspression af Kræft Inhibitor af protein phosphatase 2A (CIP2A) i humane cancerceller. PLoS ONE 6 (3): e17979. doi: 10,1371 /journal.pone.0017979

Redaktør: Robert Oshima, SanfordBurnham Medical Research Institute, USA

Modtaget: November 3, 2010; Accepteret: 17 Feb 2011; Udgivet: 22 Mar 2011

Copyright: © 2011 Khanna et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Academy of Finland (projekter: 217676 og 217675), Association for International Cancer Research (projekt 08-0614), Institut for finske Cancer Institute (JW), Emil Aaltonen Foundation, Sigrid Juselius Foundation, konkurrencedygtig forskning Finansiering af Pirkanmaa Hospital District (projekter: 9K152 og 9L115), Tampere Graduate Program i biomedicin og bioteknologi (AK), og de videnskabelige og teknologiske Forskningsråd Tyrkiets (TB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling eller analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Ophobning af forskellige genetiske ændringer er blevet betragtet som en forudsætning for udvikling af kræft. Disse genetiske ændringer resulterer ofte i overekspression eller aktiviteten af ​​proto-onkogener og inhibering af funktionen af ​​tumor suppressor [1], [2] .Derfor forståelse af de mekanismer, hvorved aktiviteten af ​​begge proto-onkogener og tumor suppressorer ændres i kræft er af afgørende betydning både fagligt og til udvikling af nye metoder til at målrette kræftceller til terapi.

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) -medieret MEK1 /2-ERK MAPK pathway aktivitet har vist sig at regulere stort set alle aspekter involveret i tumorudvikling. Følgelig øget aktivitet og overekspression af både EGFR og MEK1 /2 kinaser er blevet observeret i forskellige humane cancere [3], [4], [5], [6]. Desuden hæmmere til EGFR, Raf og MEK1 /2 kinaser er i kliniske forsøg mod forskellige typer af solide tumorer [3], [4], [7], [8]. Interessant, øget MEK1 /2 pathway aktivitet på grund af hyperaktivitet af Ras og Raf-proteiner har også vist sig at bidrage til klinisk resistens over for EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren [4], [9], [10]. Disse resultater og antyder, at der kan kræves inhibering af pathway aktivitet både på niveauet for receptoren, og dens nedstrømseffektorer for en effektiv anti-cancerterapi.

ETS-familien af ​​transkriptionsfaktorer, herunder Elk1, ETS1 og ETS2 er nogle af de kendte mål for EGFR-Ras-MEK1 /2 signalvej [11]. ETS1 og ETS2 begge phosphoryleret af Ras-signalering [11], [12]. ETS1 er et stiftende familie medlem af ETS-domæne transkriptionsfaktorer. Det er blevet forbundet med kræft siden dens identifikation som et onkogen fusion med produktet fra c-Myb proto-onkogen i E26 aviær leukæmivirus [13], [14]. ETS1 vides at målrette en lang række gener [11], [12], [15], som igen dikterer dets rolle i forskellige cellulære processer. Vedrørende kræft ETS1 er bedst kendt for sin rolle i at fremme tumorcelleinvasivitet, motilitet og metastase [13], [16]. Invasion fremme rolle ETS1 menes at være medieret af transkriptionelle opregulering af gener, der deltager på nedbrydning af ekstracellulær matrix og stimulering af angiogenese [16]. Interessant, selvom ETS1 og andre ETS-familie transkriptionsfaktorer er primært knyttet til tumor invasion, kort efter kloning af menneskelige ETS1, Seth og samarbejdspartnere viste, at ETS1 overekspression forvandlet NIH3T3 celler gør dem i stand til at forankringsuafhængig vækst og tumorvækst i nøgen mus [17]. For nylig blev det også vist, at ETS1 fremmes transformerede cellefænotype i humane celler såvel [18], [19]. Imidlertid er de målgener involveret i ETS1-medieret cellulær transformation dårligt forstået.

Kræft inhibitor af proteinphosphatase 2A (CIP2A) er et nyligt karakteriseret human onkoprotein [20]. CIP2A interagerer med og hæmmer proteinphosphatase 2A (PP2A) tumorsuppressor kompleks og derved inhiberer dephosphorylering og efterfølgende proteolytisk nedbrydning af MYC transkriptionsfaktor [20], [21]. CIP2A fremmer Ras-fremkaldte foci dannelse i muse embryo fibroblaster og understøtter transformation af immortaliserede humane celler [20]. I tab af funktion undersøgelser er CIP2A udtømning vist sig at reducere den samlede tumor xenograft størrelse i nøgne mus [20], [22], og at forringe clonogenicity og forankringsuafhængig vækst af tumorceller [20], [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. For nylig CIP2A blev også vist at inhibere Akt kinase-associeret PP2A-aktivitet og på denne måde at beskytte humane hepatocellulære carcinomceller fra bortezomib-induceret apoptose [26]. CIP2A udtrykkes i kun meget få normale væv, men det overudtrykkes med meget høj hyppighed (40-80%) i forskellige humane cancertyper, såsom hoved og hals pladecellecarcinomer (HNSCC), coloncarcinomer, gastriske carcinomer, brystcarcinomer og ikke -lille celle lungekræft [20], [22], [23], [24], [25]. Ud over sin overekspression i kræft, de seneste undersøgelser har vist, at CIP2A immunopositivitet korrelerer med aggressiv sygdom og /eller dårlig patient overlevelse i flere kræfttyper [22], [23], [24]. Med hensyn til mekanismer, der regulerer CIP2A ekspression, har vi hidtil identificeret MYC som en stimulator af CIP2A ekspression [24]. Men andre mekanismer, der bidrager til øget CIP2A udtryk i humane kræftformer stadig undvigende.

I den aktuelle undersøgelse, vi klonede funktionel CIP2A promotor-regionen og identificeret de promotorområder medierende høj CIP2A transkriptionel aktivitet. Desuden bruger kemiske inhibitorer til forskellige signalveje og målrette specifikke siRNA’er, dissekeret vi rollen som EGFR-MEK1 /2 vej i reguleringen CIP2A udtryk. Chromatin immunpræcipitation, promoter mutagenese og målrette specifikke siRNA’er blev derefter brugt til at identificere ETS1 som transskription faktor, der regulerer EGFR-MEK1 /2-afhængige CIP2A udtryk i humane kræftformer.

Resultater

Bioinformatik analyse og methylering status CIP2A Promoter

for at starte en systematisk analyse af de mekanismer, der regulerer CIP2A udtryk, blev 1,8 kb opstrøms for den forudsagte CIP2A gen transkriptionsstartsitet analyseret ved hjælp af Genomatix softwaren. Figur 1A viser den forudsagte transcriptionsfaktor bindingssites, der matrix lighed på 95% og kerne lighed på 100%, af denne genomiske region. Genomatix software blev også anvendt til at opnå det fylogenetiske træ i CIP2A promotoren i forskellige arter (fig. 1B). Interessant analyse af -1500 til +450 bp region med MethPrimer software identificeret et CpG ø mellem nukleotider -150 til +400 bp (blå skraverede område i figur 1C). Vigtigere, tilpasning af CIP2A initiativtagere i forskellige arter afslørede også bevarelse af CpG rige sekvenser på dette område (fig. S1A). Methylering af CpG sites i de regulatoriske regioner af generne foreslås at korrelere med transkriptionel inaktivering. Derfor blev det en hypotese, at CIP2A udtryk i normale væv og cellelinjer [20], [22], [23], [25] kunne tavshed på grund af promotor methylering. Til dette formål blev methylering status -150 til 400 bp region analyseres ved hjælp af bisulfit sekventering. Genomisk DNA prøver indsamlet til denne analyse omfattede frisk isolerede celler fra normalt humant blod, dyrkede menneskelig hud fibroblaster og dyrkede kræftceller (AGS og HeLa). Bisulfit behandling af det genomiske DNA resulterede i konvertering af alle cytosiner i det sekventerede promotorområde til thymidiner, i alle prøver (fig. 1D og fig. S1). Eftersom methylering af CpG øer på CIP2A promotor ikke blev observeret i normale celler, er det usandsynligt, at promotor de-methylering ville forklare øget CIP2A udtryk i kræftceller.

A. Identifikation af transkriptionsfaktorbindingssites med matrix lighed på 95% og kerne lighed på 100% på -1802 bp CIP2A promotor hjælp Genomatix software. B. fylogenetisk træ afbilder den evolutionære bevarelse af CIP2A promotoren. C. Identifikation af formodede CpG Island fra -150 bp til 400 bp (blå skraverede område) på CIP2A promotor hjælp MethPrimer software. D. Viser sekventeringsresultaterne af det ekstraherede genomiske DNA fra normalt humant blod. Alle CpG sites (repræsenteret ved sorte rektangulære blokke) ligger inden for CpG øen blev konverteret fra CG til TG når de behandles med bisulfit, hvilket indebærer, at CIP2A promotor på disse steder er umethyleret.

Funktionel og SNP-analyse af CIP2A promotor

single nucleotide (SNP’er) er rapporteret til at skabe hidtil ukendte transkriptionsfaktor bindende sites på genpromotorer. Specifikt viste en tidligere undersøgelse, at en SNP på MMP-1 promotoren skabt en hidtil ukendt ETS-bindingssted som augmented MMP-1 transskription i cancerceller [27]. For at vurdere SNP status CIP2A promotor, en region, der indeholder CIP2A promotoren afbildet i fig. 1A og exon 1 (-1802 bp til 182 bp) blev sekventeret fra genomisk DNA ekstraheret fra normal human perifert blod, humane ikke-maligne mononukleære monocytter (MN-50), normale humane dermale fibroblaster (NHDFc), human fibrosarkom cellelinie ( HT1080), pladecellecarcinom cellelinje (SCC7), cervical carcinom-cellelinie (HeLa) og gastrisk adenocarcinom cellelinie (AGS). Denne analyse identificeret adskillige SNPs på det analyserede område, men kun to af dem (T C ved -592 i HeLa og G A ved -1100 i SCC7) blev ikke fundet fra enhver normale prøver (figur 2A.). Men da hver af disse to SNP’er blev fundet kun fra én cancercellelinje, men ikke i de andre analyserede, er det usandsynligt, at de ville medføre transkriptionsfaktorbindingssites som ville forøge CIP2A transskription generelt i cancer. Notatet T C ved -592 i HeLa-celler er ikke tidligere blevet dokumenteret i databaserne

A.. Identificerede single nukleotid polymorfier på -1802 til at 182 region CIP2A promotor fra angivne celler. To cancercellelinje specifikke ændringer blev observeret, nemlig G /A ved -1101 i SCC-7 cellelinie og T /C ved -592 i HeLa-cellelinje. B. Relativ Luciferase assay viser den relative aktivitet af -1802 bp af CIP2A promotoren sammenlignet med velkendte onkogene promotorer som EGFRLuc og 5xJunLuc. C. Luciferase assay viser sammenligning af aktivitet mellem vildtype (WT) CIP2A promotoren og de angivne SNP mutanter. D. Luciferase assay viser aktiviteten af ​​angivne CIP2A promotorer. Høj basale aktivitet medieres af første 392 bp af promotoren, hvoraf næsten to tredjedele af det skyldtes den første 108 bp. B-D, Vist er Mean + SD fra tre uafhængige forsøg.

For at initiere funktionel karakterisering af CIP2A promotoren, -1802 bp til 182 bp 5 ‘opstrøms region CIP2A gen, blev analyseret for SNPs ovenfor, blev klonet ind pGL4.10 vektor for at skabe CIP2A promotor luciferase-reporterkonstruktion (-1802CIP2ALuc). Promotorregionen blev amplificeret fra det genomiske DNA af AGS-celler, og denne særlige klon nærede nucleotider A i position -98 og T ved den position -1487 (fig. 2A). For at vurdere den relative transkriptionelle aktivitet af det klonede CIP2A promotorfragmentet sammenlignede vi luciferaseaktiviteten af ​​-1802CIP2ALuc at promotor /luciferase-konstruktioner, der vides at være aktive i cancerceller. Som vist i fig. 2B, -1802CIP2ALuc aktivitet var enten tilsvarende eller klart højere end aktiviteten af ​​EGFRLuc [28] eller minimal 5xJunLuc [29] initiativtagere hhv. Baseret på dette resultat konkluderede vi, at det klonede -1802 bp til 182 bp 5 ‘opstrøms region CIP2A gen indeholder et aktivt CIP2A promotor

Næste det -1802CIP2ALuc konstruktion blev anvendt til at analysere, om SNPs 592 T C og 1100 g A identificeret ovenfor var funktionelle. Til dette formål 592 T C og 1100 g A mutationer blev introduceret til -1802CIP2ALuc ved stedspecifik mutagenese og aktiviteten af ​​mutante konstruktioner blev sammenlignet med vildtype 1802CIP2ALuc i AGS celler. Ved sammenligning med vildtypen, var der ingen ændring ses i CIP2A luciferaseaktivitet med 1100 G En mutant klon, mens 592 T C mutant klon viste et markant fald i luciferaseaktiviteten (figur 2C).

Endelig er det for at karakterisere de regioner på CIP2A promotoren, som medierer dets høje transkriptionsaktivitet, flere 5′-deletioner af promotor /reporter blev klonet. Sammenligning af de basale aktiviteter af disse deletionskonstruktioner i AGS celler viste, at regioner mellem -392 og -1802 ikke synes at indeholde transkriptionsfaktorbindingssites som i høj grad ville bidrage til høje basale aktivitet af CIP2A promotoren (fig. 2D). Interessant nok blev den høje luciferaseaktivitet af -392CIP2ALuc væsentligt reduceret, når yderligere 57 nukleotider er blevet slettet resulterer i -335CIP2ALuc konstruktion (fig. 2D). Dette syntes at være forårsaget af eksponering af en transkriptionel repression domæne, som yderligere deletion af -335CIP2ALuc til -108CIP2ALuc resulterede igen i markant øget luciferaseaktivitet (fig. 2D). Interessant nok dette 108 bp CIP2A promotor udgjorde mere end 50% af luciferaseaktiviteten produceret af -1802CIP2ALuc (fig. 2D).

Tilsammen har dette data viser første funktionel analyse af CIP2A promotorregion. Desuden er disse resultater tyder på, at SNPs på CIP2A promotor ikke bidrage væsentligt til CIP2A overekspression i cancer.

Regulering af CIP2A udtryk ved EGFR-MEK1 /2 pathway

Resultater ovenfor antydet, at CIP2A ekspression kan reguleres positivt af signalveje, som stimulerer dets gen promotoraktivitet. For at løse, om kendte onkogene signalveje havde rolle i reguleringen CIP2A ekspression blev AGS celler behandlet med veldefinerede kemiske pathway hæmmere og aktivatorer. Mens hæmning af enten p38 eller PI3 kinaser ved SB23580 eller LY294002 henholdsvis ikke regulere i CIP2A mRNA-niveauer, både MEK1 /2 og EGFR-hæmmere (PD98059 og AG1478) faldt CIP2A mRNA-ekspression (fig. 3A). Desuden behandling af celler med phorbolester TPA, en velkarakteriseret aktivator af MEK1 /2-ERK signalvej, øget CIP2A mRNA-ekspression mere end tre gange (fig. 3A). Som vist i fig. 3B, virkningerne af både AG1478 og TPA på CIP2A mRNA-ekspression var allerede tydeligt 6 timer efter behandling, som antyder en direkte virkningsmekanisme. For at kortlægge området på CIP2A promotor, som reagerer på EGFR-MEK1 /2 pathway aktivitet, celler transficeret med forskellig længde af CIP2A luciferase promotorkonstruktioner blev behandlet med AG1478 eller TPA, og luciferaseaktivitet, sammenlignet med kontroldyr DMSO behandling, blev målt som en udlæsning af promotoraktivitet. Som vist i fig. 3C og D, AG1478 behandling faldet, mens TPA behandling øgede luciferaseaktiviteten fra alle undtagen den korteste -27CIP2ALuc konstruktion.

A. Kvantitativ PCR (qPCR) analyse, der viser niveauer af CIP2A mRNA ekstraheret fra AGS celler behandlet med DMSO, SB23580 (20 uM), LY294002 (10 uM), PD98059 (20 uM), AG1478 (10 uM) og TPA (100 nM) ved 24 h tidspunkt. Mens en formindskelse i CIP2A mRNA-niveau blev observeret med PD98059 og AG1478 behandlinger, TPA behandling augmented de CIP2A mRNA-niveauer i AGS-celler. B. qPCR analyse viser tidsafhængig regulering af CIP2A mRNA-niveauer i AGS celler behandlet med DMSO, AG1478 (10 uM) og TPA (100 nM) for angivne tidspunkter. C og D Luciferase undersøgelser, som viser aktiviteten af ​​angivne CIP2A promotorsekvenser deletioner i celler behandlet med enten DMSO, AG1478 (10 uM) eller TPA (100 nM) i 24 timer. (*,

P

0,05; n.s. = ikke-signifikant). B-D. Vist er Mean + SD fra tre uafhængige forsøg.

Samlet set viser disse resultater, at CIP2A udtryk er positivt regulated` af EGFR-MEK1 /2 vej, og at regionen lydhør for pathway aktivitet løgne mellem -27 bp og -672 bp på CIP2A promotor.

Karakterisering af MEK1 /2 kinase lydhør region på CIP2A promotor

for at validere bidrag MEK1 /2 kinaser i positiv regulering af CIP2A ekspression blev AGS celler behandlet med UO126, en mere specifik og potent MEK1 /2-inhibitor end det tidligere anvendte PD98059, og CIP2A proteinekspression blev undersøgt 48 timer efter behandling. Som vist i fig. 4A, UO126 dosisafhængigt reduceret CIP2A proteinekspression. Desuden to forskellige siRNAs mod både MEK1 og MEK2 faldt CIP2A proteinekspression i AGS-celler (fig. 4B). Vigtigere var virkningerne ikke cellelinie specifik som enten kemisk eller siRNA-baserede MEK1 /2-inhibering inhiberes CIP2A proteinekspression også i PC-3 prostatacancer-cellelinie (fig. S2). At indsnævre MEK1 /2-responsive region på CIP2A promotoren blev AGS celler transficeret med serier af CIP2A luciferase reporterkonstruktioner behandlet med UO126 (20 uM) og luciferase-aktiviteter blev målt 48 timer efter behandling. I overensstemmelse med resultaterne set med AG1478 og TPA behandlinger, nedsat luciferaseaktivitet af alle de andre konstruktioner undtagen -27CIP2ALuc blev observeret i UO126 behandlede celler (fig. 5A). For yderligere at indsnævre MEK1 /2-responsive region på CIP2A promotoren, blev forskellige yderligere CIP2A luciferase promotorkonstruktioner klonet (fig. 5B). Sammenligning af de basale aktiviteter af disse nye konstruktioner sammen med udvalgte promotorkonstruktioner allerede analyseret i fig. 2D, bekræftede yderligere, at der er både undertrykkende en aktiverende promotorregioner på CIP2A promotor mellem -27 bp og -400 bp (fig. 5B). Men uanset den basale aktivitet af reporter, UO126 behandling inhiberede aktiviteten af ​​alle reportere, herunder -108CIP2ALuc, med en bemærkelsesværdig undtagelse af -27CIP2ALuc konstruktion (fig. 5C). Derfor viser disse resultater, at MEK1 /2 kinaser positivt regulerer både CIP2A promotoraktivitet og proteinekspression. Desuden disse resultater identificerer 81 bp mellem -108 bp og -27 som MEK1 /2-responsive region på CIP2A promotor.

A. Western blot, der viser koncentrationsafhængig virkning af specifik MEK-inhibitor, U0126, på CIP2A proteinniveauer i AGS-celler ved 48 timer tidspunkt. B. Western blot, der viser virkningen af ​​både MEK1 og MEK2 siRNA’er på CIP2A proteinniveauer i AGS-celler ved 72 h tidspunkt.

A. Luciferase assay viser aktiviteten af ​​forskellige længde CIP2A promotorer når de behandles med DMSO og U0126 (10 uM) i 24 timer, identificerer MEK responsive region at ligge mellem -672 bp til -27 bp af CIP2A promotoren. B. Luciferase assay viser den basale aktivitet angivet CIP2A promotorer. C. luciferaseassays viser aktiviteten af ​​forskellige længde CIP2A promotorer når de behandles med DMSO og U0126 (10 uM) i 24 timer, yderligere indsnævre MEK responsive region til at være mellem -108 bp og -27 bp af CIP2A promotoren (*,

P

0,05, **,

P

0,00; ns = ikke-signifikant). Vist er Mean + SD fra tre uafhængige forsøg.

EGFR-MEK1 /2-vejen regulerer CIP2A udtryk gennem ETS1

For at identificere transskription faktor (er) medierer den stimulerende virkninger af EGFR-MEK1 /2-vejen i reguleringen CIP2A ekspression, vi vendt tilbage til den biofarmaceutiske analyse udført for området mellem -27 bp til -108 bp (fig. 1A). Ud af de transkriptionsfaktorer forventes at binde til den region, ETS1 har en etableret rolle som en nedstrøms effektor af MEK1 /2 pathway [11], [12]. Derfor vi næste skabt mutanter for disse ETS1 sites og sammenlignet luciferaseaktiviteten af ​​-108CIP2ALuc konstruktionerne huser mutationerne til den for vildtypen. De to ETS sites og mutationen strategi er afbildet i fig. 6A, B. Som vist i fig. 6C, mutation af en af ​​de ETS1 sites dramatisk nedsatte CIP2A promotoraktivitet. For at undersøge om ETS1 medierer MEK1 /2-afhængige CIP2A regulering, celler transficeret med både vildtype og ETS1 mutant (site 1) -108CIP2ALuc konstruktioner blev behandlet enten med AG1478, UO126 eller TPA. Mens vildtype -108CIP2ALuc aktivitet blev signifikant inhiberet af AG1478 (fig. 6D) eller UO126 (fig. 6E), og omvendt aktiveres af TPA (fig. 6F), har ETS1 mutant-promotoren ikke signifikant reagere på disse behandlinger.

A. Skematisk diagram af 108 bp fragmentet af CIP2A promotor viser placeringen af ​​to overlappende forudsagte ETS1 bindingssteder. B. sekventeringsresultaterne af ETS-1 bindingssted mutanter på CIP2A promotoren oprettet ved hjælp mutagenese. Sekvensen på toppen repræsenterer vildtypesekvensen (læst fra 5 ’til 3′ enden), medens sekvensen nedenfor er den muterede sekvens (læst fra 5 ’til 3′ enden). Den inducerede ændring i sekvens er vist i den rektangulære kasse. C. Luciferase assay sammenligner aktiviteten af ​​enten vildtype -108CIP2ALuc eller indikeret ETS-bindingssted mutant -108CIP2ALuc konstruktioner. D, E F. Luciferaseassays sammenligner aktiviteten af ​​enten vildtype -108CIP2ALuc eller ETS1 site1 mutant -108CIP2ALuc konstruktioner efter behandling med DMSO, AG1478 (10 uM, D), UO126 (10 uM, E) eller TPA (100 nM; F) i 24 timer. (*,

P

0,05, **,

P

0,01; n.s. = ikke-signifikant). Vist er Mean + SD fra tre uafhængige forsøg.

Samlet disse resultater identificere to funktionelle ETS1 sites på den proksimale CIP2A promotor. Desuden disse resultater tyder på, at MEK1 /2-afhængig stimulering af CIP2A promotor-aktivitet medieres af ETS-familie transkriptionsfaktorer.

ETS1 binder sig til CIP2A promotor og regulerer dets ekspression i cancerceller

for at kontrollere, at ETS proteiner binder til CIP2A promotor på MEK1 /2-aktivitet-afhængig måde, vi udførte kromatin immunoprecipitation eksperiment med ETS1 antistof og forstærkning af -66 bp til 20 bp fragment af CIP2A promotoren. Som vist i fig. 7A, ETS1 immunfældning resulterede i ca. 4-fold berigelse af CIP2A promotor belægning sammenlignet med kontrolgruppen IgG. Interessant nok i det samme forsøg CIP2A berigelse var endnu stærkere end UNQ9419, en etableret ETS1 mål, der blev anvendt som en positiv kontrol [30]. Endvidere berigelse af CIP2A promotoren blev signifikant inhiberet ved behandling af celler med U0126. Og mens inhiberingen af ​​CIP2A berigelse af UO126 var statistisk signifikant, inhibering af UNQ9419 berigelse var ikke (fig. 7A).

A. Chromatin immunoprecipitation assay af ETS1 binding til CIP2A promotoren i enten DMSO eller UO126 behandlede celler. UNQ9419 promotoren er vist som en positiv kontrol. (*,

P

0,05, **,

P

0,01; n.s. = ikke-signifikant). B. Luciferase assay sammenligner aktiviteten af ​​enten vildtype -1802CIP2ALuc eller indikeret ETS-bindingssted mutant -1802CIP2ALuc konstruktioner. C, D .. D. Oncomine database analyse af genekspression profiler for EGFR-MEK-ETS1 pathwaygener afslørede M6 undertype af akut myeloid leukæmi som en cancer type, i hvilken CIP2A og repræsentative gener af hvert niveau af omsætningsvejen er signifikant opreguleret (**,

P

. 0,01)

diskussion

en nylig systematisk karakterisering af somatiske mutationer i 441 humane tumorer identificerede vækstfaktorreceptor signalering til MEK1 /2-ERK vej til at være en af de mest markant ændrede veje tværs menneskelige kræftformer [33]. Desuden hæmning af onkogen form for B-Raf i humane maligne melanomer med en lille molekyle inhibitor demonstreret meget lovende kliniske effekt allerede i fase I klinisk studie [7]. Baseret på resultaterne af disse undersøgelser og rigelig af tidligere data, som viser onkogen funktion af EGFR-medieret MEK1 /2-ERK-aktivering, er det klart, at identifikationen af ​​onkogene effektorer af pathway aktivitet er vigtig. I denne undersøgelse demonstrerer vi, at CIP2A er en roman onkogen mål opreguleret af EGFR-induceret MEK1 /2-ERK pathway aktivitet. Efter sin oprindelige kloning [34], og yderligere funktionel karakterisering [20], er CIP2A blevet påvist at fremme malign cellevækst ved hjælp af forskellige humane cancercellelinier modeller [20], [22], [23], [24], [25 ]. Desuden CIP2A protein er blevet vist, at være overudtrykt med meget høj frekvens i forskellige typer af humane maligniteter. Bortset human brystcancer, hvor CIP2A er overudtrykt i 40% af patientprøver [22], i alle andre studerede kræfttyper frekvensen er mellem 65 til 87% af patienterne [20], [23], [24], [25]. Dette gør CIP2A overekspression sammen med MEK1 /2-ERK-aktivering som en af ​​de hyppigste ændringer i humane cancere. Men forud for denne undersøgelse, de mekanismer, hvormed CIP2A udtryk induceret i humane cancerceller er blevet meget dårligt forstået.

For at identificere mekanismer, der er ansvarlige for høj basal udtryk for CIP2A i humane cancerceller, vi har i denne undersøgelse systematisk analyseret bidrag af flere potentielle gen-regulatoriske mekanismer, der er blevet tidligere vist sig at påvirke genekspression i humane cancere. Selvom vi ikke udelukkende har udelukket, at enten promoter methylering eller funktionelle SNP’er på CIP2A promotor kan bidrage til høj CIP2A udtryk i kræft, er vores data viser, at disse mekanismer sandsynligvis ikke er relevante for regulering af CIP2A promotor-aktivitet. For at identificere promotorområder funktionelt impliceret i reguleringen af ​​CIP2A udtryk i kræftceller, vi skabt alt 10 promoter sletning reporter-konstruktioner. Data, der er vist i figurerne 2D og 5B tilladt os at konkludere, at promotor-regionen mellem -335 bp og -392 bp indeholder en stærk aktiverende promoter element, mens regionen mellem -108 bp og -204 bp indeholder et stærkt repressor element. Desuden data viser, behøver at promotor region opstrøms for -417 bp ikke bidrage væsentligt til den høje basale aktivitet af det undersøgte CIP2A promotor i AGS celler, hvorimod, promoter regionen mellem -27 bp og -108 bp har en meget stærk aktiverende element udgør mindst 50% af den samlede aktivitet af -1802 bp promotor. Foruden promotorregulering, en anden vigtig mekanisme, der bidrager til proteinekspression er modifikation af dens tur af hastigheden eller stabilitet. CIP2A har tidligere vist sig at være meget længe levet protein i hepatocellulært carcinom cellelinje [26]. Derfor vil belysning af mekanismer, der bidrager til CIP2A stabilitet i kræftceller være et relevant spørgsmål, der skal behandles i fremtiden.

Vores efterfølgende eksperimenter med CIP2A promotoren identificeret to delvis overlappende ETS-bindingssteder mellem -60 bp til -30 bp stort set at være ansvarlig for høj aktivitet af fuld-længde-promotoren.