PLoS ONE: Global analyse af DNA Methylering af methyl-Capture sekventering afslører Epigenetisk Kontrol af cisplatin Modstand i kræft i æggestokkene Cell

Abstrakt

Cisplatin resistens er en af ​​de vigtigste årsager, der fører til den høje dødelighed af kræft i æggestokkene. Methyl-Capture sekventering (MethylCap-seq), som kombinerer udfældning af methyleret DNA ved rekombinant methyl-CpG bindende domæne af MBD2 protein med NGS, global og neutral analyse af globale DNA methyleringsmønstre. Vi anvendte MethylCap-seq at analysere hele genomet DNA-methylering profil cisplatin følsomme ovariecancer cellelinie A2780 og dens isogene derivat resistente linje A2780CP. Vi opnåede 21.763.035 rå læser for lægemiddelresistent cellelinie A2780CP og 18,821,061reads for den følsomme cellelinie A2780. Vi identificerede 1224 hyper-methyleret og 1216 hypomethylated DMRs (differentielt methyleret region) i A2780CP forhold til A2780. Vores MethylCap-seq data på denne ovariecancer cisplatin resistente model forudsat en god ressource for forskningsverdenen. Vi fandt også, at A2780CP, sammenlignet med A2780, har lavere observeret til forventede methylerede CpG nøgletal, hvilket tyder på en lavere global CpG methylering i A2780CP celler. Methylering specifik PCR og bisulfit sekventering bekræftede hypermethylering af PTK6, PRKCE og BCL2L1 i A2780 forhold til A2780CP. Desuden behandling med demethyleringsreagenset 5-aza-dC i A2780 celler demethyleres initiativtagerne og restaureret udtryk for PTK6, PRKCE og BCL2L1

Henvisning:. Yu W, Jin C, Lou X, Han X, Li L, He Y, et al. (2011) Global analyse af DNA Methylering af methyl-Capture sekventering afslører Epigenetisk Kontrol af cisplatin Modstand i kræft i æggestokkene Cell. PLoS ONE 6 (12): e29450. doi: 10,1371 /journal.pone.0029450

Redaktør: Matteo Pellegrini, UCLA-DOE institut for Genomforskning og Proteomics, USA

Modtaget 21. oktober, 2011; Accepteret: November 29, 2011; Udgivet: 22 December, 2011

Copyright: © 2011 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler til BL af Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina [2006AA02A303, 2006AA02Z4A2, 2006DFA32950, ​​2007DFC30360]. Dette arbejde er støttet af midler til JZ fra National Science Foundation (30921140312), National Research Program for Basic Research (2009CB825606, 2009CB825607 og 2010CB912802) og internationalt samarbejde Grant (2009DFA31010) til XD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lægemiddelresistens er den vigtigste grund fører til høje dødelighed af ovariecancer. Det kemoterapeutiske middel cisplatin (cis-diamminedi-chloroplatinum (II)) er særlig effektiv mod ovariecancer med en indledende svarprocent på op til 70% [1]. Imidlertid, ovariecancer vinder udvikler resistente over for cisplatin, og 5-års overlevelsesrate for patienter er kun 15-20% [2]. Cisplatin medierer sine handlinger ved at danne DNA-addukter-primært intra-streng-tværbindinger addukter [3] og aktiverer flere signaltransduktionsveje omfatter ATR, p53, p73 og MAPK pathways, hvilket resulterer i apoptose [3], [4].

DNA methylering er ofte forbundet med transkriptionel repression af genekspression [5] og med reaktioner på kemoterapi [6], [7]. Et klassisk eksempel er, at methylering af MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase) promotoren i gliomer er en nyttig indikator for modtagelighed af tumorerne til alkyleringsmiddel carmustin [1,3-bis (2-chlorethyl) -1-nitrosourinstof] samt af generel og sygdomsfri overlevelse i gliomer [6]. I ovariecancere, Taniguchi et al. foreslå en model for æggestokkene tumor progression, hvor den oprindelige methylering af FANCF efterfølges af FANCF demethylering og i sidste ende resulterer i cisplatin modstand [7]. DNA-methylering af adskillige gener i ovariecancere herunder HSulf-1 [8], [9], EZH2 [10], er fundet ABCG2 at være forbundet med lægemiddelresistens. Boettcher et al. analyseret high-definition DNA methylering profiler af 800 CpG øer (CGI’er) af udvalgte gener og identificeret, at hyper-methylering i CGI’er af BRCA1, CDH1, DNAJC15 og SULF2 samt hypo-methylering af CGI’er for ABCB1, viste APC og HIC1 gener øget doxorubicin tolerance [11]. Chang et al. brugte global genekspression profilering at analysere kræftceller før og efter behandling af DNA methyltransferase inhibitor5-aza-2′-deoxycytidin, som igen aktiverer methylering lyddæmpet gen [12]. De identificerede flere hundrede gener, der blev nedreguleret i cisplatin resistente cancerceller og genaktiveres ved DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin [12]. Li et al. sammenlignede methylering mønster af A2780 og deres afledte resistente cellelinje efter flere cyklusser af narkotika markeringer med globale CGI methylering arrays og mRNA udtryk microarrays [13].

Ved at udnytte den næste generations sekventering (NGS) teknologier , den methylerede brøkdel af genom fanget af MeDIP-seq [14], MethylCap-seq [15] og methylcap-seq [16] er blevet profileret i en større dybde end array-baseret platform, afslører mange nye områder, som er differentielt methylerede med de biologiske indhold. Her rapporterer vi sammenligningen af ​​de globale DNA methylering mønstre af ciplatin følsom (A2780) og resistente (A2780CP) æggestokkene cellelinjer til de vigtigste epigenetiske kontroller, der er ansvarlige for cisplatin modstand. Vi identificerede 1224 hyper-methyleret og 1216 hypomethylated DMRs (differentielt methyleret region) i A2780CP forhold til A2780. Vi fandt også, at A2780CP, sammenlignet med A2780, har en lavere global CpG methylering. Adskillige gener blev bekræftet at have både promotor methylering og tilsvarende udtryk ændrer herunder PTK6, PRKCE og BCL2L1, og behandling med demethyleringsreagenset 5-aza-dC i A2780 celler demethyleres initiativtagerne og genoprettet deres udtryk.

Resultater

Methylomic analyse af cisplatin resistente A2780CP og dens isogene cisplatin følsomme A2780 cellelinie

Humant ovariecarcinom A2780CP cellelinje (cisplatin-resistente) blev afledt fra A2780 (cisplatin-sensitive) cellelinie, men viser øget resistens over for cisplatin [17]. A2780CP og A2780 er isogene (samme genomisk DNA). At bekræfte, at cellelinien A2780CP vi stadig havde opretholdt cisplatin modstand, udførte vi MTT-assay til at evaluere cisplatin drug responser af A2780CP og A2780-celler. Vi fandt, at IC50 på A2780CP (5,0 ug /ml) var tæt på 3 gange højere end den for A2780 (1,8 ug /ml) (fig. 1). Vores data er i overensstemmelse med den tidligere rapporterede cisplatin respons profiler af A2780CP [17], hvilket indikerer, at cellelinierne vi havde i laboratoriet bevarer forskellen i cisplatin modstand.

Både A2780 og A2780CP blev behandlet med cisplatin i forskellige doser fra 0 ug /ml til 16 ug /ml i 72 timer.

Vi har derfor anvendt MethylCap-seq at analysere de methylomic profiler af både A2780 og A2780CP celler. Vi opnåede 21.763.035 rå læser for lægemiddelresistent cellelinie A2780CP og 18,821,061reads for den følsomme cellelinie A2780. 13.950.202 (64,1%) og 13.671.899 (72,6%), lyder blev entydigt kortlagt til humant genom for A2780CP og A2780 henholdsvis

Vi kommenteret den læser med hensyn til CpG-øer i det humane genom (http:. //Genom .ucsc.edu /) og fandt, at omkring 1,4% og 2,5% af den læser finde inde CpG øer henholdsvis A2780CP og A2780.The gennemsnitlige sekvens dybde for CpG øer dækket er omkring 16 og 24,5 gange. Omkring 68% og 66% af de humane CpG øer blev dækket i vores analyse for A2780CP og A2780 (Tabel 1). Den CpG dækning og dybde vi opnåede i vores MethylCap-seq svarer til, hvad der tidligere er offentliggjort [18].

For at opdage differentierede methylering regioner (DMRs) i det humane genom mellem de sensitive og resistente celler, vi brugte MEDIPS, et nyligt udviklet software værktøj specialiseret til analyse immunpræcipitation baseret methylering analyse (f.eks MeDIP-seq og MethylCap-seq) [19]. Vi sætter kriterierne for væsentlige DMRs: længden af ​​toppe blev sat til 500 basepar og toppe med 20 rpm (læser per million), p-værdi mindre end 0,001 og forholdet mellem omdrejningstal mellem to cellelinje 20. Vi opnåede 1224 DMRs der er hyper-methyleret i A2780CP forhold til A2780 (tabel S1) og 1216 DMRs der er hyper-methylerede i A2780 sammenlignet med A2780CP (tabel S2). Disse DMRs blev kommenteret med deres genomiske placeringer og tilhørende gener i -5 K bp til 5 K bp til transcription start sites (tabel S3 og 4).

Næsten halvdelen af ​​DMRs var placeret inden for 5 k bp af udskrift starte sites (TSS) af gener. 190 og 270 DMRs var placeret til opstrøms af TSS henholdsvis A2780 og A2780CP (tabel 1). Resten mappet til andre regioner i det humane genom, herunder introns, exoner, intergeniske regioner og gentagelser (Ensembl menneskelige genom annotationer) (Fig. 2A). Hypermethyleret regioner i promotorer af gener er kendt for at formindske genekspression [17], men effekten af ​​hypermethyleringsassocierede regioner andet sted i genregion forbliver usikkert. Den hypermethylering af repetitive genomiske sekvenser kan forhindre kromosomal ustabilitet, translokationer, og gen-forstyrrelser forårsaget af reaktivering af transposerbare DNA-sekvenser [17], [20].

A. Andel af hypermethyleret toppe baseret på deres lokaliserede genomiske funktioner. B. Fordeling af CpG

o /e for hypermethyleret toppe baseret på deres lokaliserede genomiske funktioner.

Li et al. sammenlignet isogen A2780 og deres udvalgte resistente cellelinje ved hjælp af 60-mer oligo microarray indeholdende 40.000 CpG-rige fragmenter fra 12.000 kendte gen initiativtagere (Agilent, Santa Clara, Californien) [13]. Ved hjælp af en cutoff-værdi på 1,5 gange, de identificerede 595, 870 og 1.176 hypermethyleret gener for Round1, Round3 og Round5 resistente underlinjer sammenligne med forældrenes ( “Round0”) A2780 celler [13]. Teknologien de brugte er forskellen methylering hybridisering (DMH) [21], hvor methylerede DNA blev adskilt fra den umethylerede ved methylering følsomme enzym diagestion til sondering oligonukleotidet vifte af de humane CpG øområder. DMH er forskellig fra MDB-seq, hvori methyleret DNA blev udfældet ved rekombinant methyl-CpG bindende domæne af MBD2 protein, og derefter sekventeret. I DMH blev isoleret DNA nedbrudt med methylering-ufølsomme restriktionsenzym BfaI (C∧TAG), ligeret til linkere, og fordøjet igen med methylering følsomme enzymer HinP1I (G∧CGC) og HpaII (C∧CGG). Fordøjelsesprodukteme blev derefter amplificeret ved anvendelse af linkere og mærket med Cy3 eller Cy5 farvestoffer for sammenlignende hybridiseringer [21]. Trods forskellige anvendte teknologier, vi sammenlignet vores MDB-seq data med Li et al. S DMH data. Vi fandt, at 221 (af 1224, 18,1%) og 142 (1216, 11,68%) af de hypermethyleret og hypomethylated gener i A2780CP sammenlignet med A2780 var også på arrayet, at Li et al. anvendt (tabel S3, S4). Vi fandt, at 15 regioner (svarende til 13 gener) og 23 regioner (21 gener), der er fælles mellem de to datasæt (tabel 2), som er yderst betydelige overlapninger med hypergeometriske sandsynligheder for 1.11E-5 og 4.22E-20 henholdsvis . De almindeligt hypermethyleret gener i de resistente celler indbefatter retinoblastoma protein 8 (RBBP8), SRY-box 1 (SOX1), wingless-typen MMTV integrationspositionen familie (WNT9A), generel transskriptionsfaktor IIIA (GTF3), og de almindeligt hypomethylated gener i de resistente celler indbefatter solut carrier familie 22 (extraneuronal monoamintransporterfunktion) (SLC22A3), aldehyd-dehydrogenase 1 familie (ALDH1A3), hyaluronansyntase 3 (HAS3) og CUB-domænet indeholdende protein 1 (CDCP1) (tabel 2).

der er 410 hypermethyleret DMRs (tabel S3) og 316 hypomethylated (tabel S4) i A2780CP sammenlignet med A2780, der ikke var på den array, Li et al. anvendt, og ville ikke have været identificeret af DMH tilgang. Disse nye DMRs afslørede magt MDB-seq identificere hidtil ukendte DMRs uden forudgående kendskab til kandidat-promotorer sættes på arrays, der skal anvendes i DMH. Desuden kan disse nye DMRs skyldes forskelle i de afledte resistente cellelinier, der blev brugt af Li et al. og os.

En lavere global CpG methylering i cisplatin resistente A2780CP celler sammenlignet med cisplatin sensitive A2780 celler

For at forstå den globale mønster af CpG methylering i begge cellelinier, vi analyserede karakteristika af hypermethyleret CpG’er tværs af hele genomet ved at tælle antallet af tilstødende CpG’er inden de 500 bp regioner omgivende hypermethyleret steder og beregnet CpG observerede /forventet forhold (CpG

o /e) for hver CpG anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Ruike et al . [22]. Vi fandt, at i almindelighed, A2780CP har lavere CpG

o /e end A2780, hvilket antyder en lavere global CpG-methylering i A2780CP forhold til A2780 (fig. 2B, øverste venstre panel). Forskellene var hovedsagelig manifesteret i højere CpG

o /e i intronen og gentag sekvenser af A2780 sammenlignet med A2780CP. Sammenligning CpG

o /e på tværs af forskellige genomiske region kategorier (fig. 2B), CpG

o /e var større end 0,6 i exoner og promotorer til både resistente og sensitive cellelinjer, men mindre end 0,6 i andre genomiske regioner (gentagelser, introner og intergeniske regioner) (fig. 2B).

Funktionelle anmærkninger og sti berigelse analyse for DMR gener

Vi udførte GO analyse for hypermethyleret gener i både den resistente (tabel S5) og følsom cellelinie (tabel S6). Vi fandt, at hypermethyleret gener i den følsomme cellelinje blev beriget for GO vilkår: anti-apoptose (GO: 0.006.916), negativ regulering af celledød (GO: 0.060.548), og regulering af intracellulært protein kinase kaskade (GO: 0.010.627). De hypermethyleret gener i den resistente cellelinje har flere beriget udtryk relateret til udskrift faktor regulering såsom GO: 0030528 transskription regulator aktivitet og GO: 0003677 DNA-binding

Vi udførte også Kegg pathway analyse for DRM-gener og fundet. at gener med hypermethyleret initiativtagere blev beriget i følgende Kegg veje herunder 11 gener i hsa04010 (MAPK signalvej), 18 gener i hsa05200 (veje i kræft), 5 gener i hsa04310 (Wnt signalvejen), 5 gener i hsa00982 (Drug stofskifte ), og 5 gener i hsa04115 (p53-signalvejen) (tabel 3).

Interessant blev mange ECM-relaterede og membran kanalproteiner hypermethyleret. For eksempel KCNS1 og KCNA1, to kalium spændingsstyret kanal protein, og SLC15A4 (opløst stof carrier familie 15, medlem 4) er hypermethyleret i A2780CP celler, mens SLC4A11 (opløst stof carrier familie 4, natriumborat transportør, medlem 11) er hypermethyleret i A2780 celler. COL18A1 (kollagen, type XVIII, alfa 1) er hypermethyleret i A2780 celler, mens KRTAP10-6 (keratin protein 10-6) og LRFN5 (leucin rige repeat og fibronektin type III domæne, der indeholder 5) er hypermethyleret i A2780CP celler. Vi identificerede også hypermethylering på flere microRNA loci herunder hypermethylering af MI6A2, MIR129-2, MIR124-1, MIR124-3, og MIR10A i A2780CP og hypermethylering af MIR185, MIR548Q, MIR642A og MIR661 i A2780 (tabel 4).

Validering af gener med DMRs ved MS-PCR og bisulfit sekventering

ekspression af gener med hypermethyleret promotor blev kontrolleret ved RT-qPCR, hvis udtrykket var signifikant ændret derefter methylering specifik PCR (MS PCR) blev anvendt til at validere status for methylering af DMR regioner mellem to cellelinjer. Vi identificerede følgende gener BCL2L1 (BCL2-like 1), PPKCE (protein kinase C, epsilon), PTK6 (PTK6 proteintyrosinkinase 6), RAC2 (ras-relaterede C3 botulinumtoksin substrat 2), SECTM1 (udskilt og transmembrane 1) og DDIT3 (DNA-skader-inducerbare udskrift 3), som ændret i både promotor methylering og udtryk. Figur 3A viste udtrykket ændringer af disse gener, og figur 3B viste promotor mønstre for methylering af disse gener. DDIT3 blev hypomethylated i A2780-celler sammenlignet med A2780CP, mens resten viste det modsatte (fig. 3B). For yderligere at bekræfte DMRs mellem A2780 og A2780CP, brugte vi bisulfit sekventering at sekventere promotorregionerne af tre tilfældigt plukket gen fra de 6 gener. Figur 3C viste, at alle promoter regioner af plukket gen PTK6 blev PRKCE og BCL2L1 hypomethylated i A2780CP sammenlignet med A2780.

A. Real-time PCR viser den differentielle ekspression af udvalgte gener mellem cisplatin følsomme A2780 og cisplatin resistente A2780CP celler. B. MS-PCR data, der viser differentielle methylering i promotorområder for de udvalgte gener mellem A2780 og A2780CP celler. C. Bisulfite sekventering resultat for promotorområder af udvalgt gen PTK6, PRKCE og BCL2L1 (hvid cyklus: umethyleret CpG, Sort cyklus: methylerede CpG).

Restaurering af genekspression af DMR berørte gener ved treatmentwith 5 aza-dc demethyleringsreagenset

for yderligere at bekræfte vores data, vi brugte 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) for at se, om vi kan genaktivere methylering-lyddæmpet gener, vi identificeret. 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) er en analog af cytosin. Når inkorporeret i DNA, det irreversibelt binder methyltransferase enzymer, hvilket resulterer i passiv de-methylationand reaktivering af epigenetisk tavshed gener [23]. Vi brugte 5-aza-dC at behandle begge A2780CP og A2780 celler i forskellige doser fra 0 pM til 10 uM. Udtrykket af gener behandles med den laveste (0 uM) blev sammenlignet behandlet med den højeste (10 uM) dosis af demethyleringsreagenset.

Vi viste, at vi var i stand til at demethylate initiativtagerne i hypermethyleret PRKCE, BCL2L1, RAC2, PTK6, SECTM1 (fig. 4A, B), og genoprettet deres udtryk efter behandling med 5-aza-dC i A2780 celler. Ligeledes kunne vi demethylate initiativtagerne til den hypermethyleret gen DDIT3, og restaureret sit udtryk efter behandling med 5-aza-dC i A2780CP celler (Fig. 4A, B).

A. Validering af ændringerne i status for methylering af MS-PCR for de seks gener under behandling med 0 pM og 10 pM 5-aza-dC. B. genekspression ændringer (Y-akse, relative fold ændringer) af de udvalgte seks gener efter behandling med forskellig koncentration (X-aksen) af demethyleringsreagenset 5-aza-DC.

Diskussion

Vi beskriver her for første gang en MDB-seq analyse af en cisplatin respons model af ovariecancerceller. De epigenetiske ændringer mellem isogene par af cisplatin følsomme A2780 og dens resistente afledte A2780CP celler antyder en epigenetisk mekanisme til cisplatin modstand kontrol. Den globale MDB-seq datasæt genereret for dette par isogene celler vil være en nyttig ressource for forskningsmiljøet interesseret i cisplatin modstand og epigenetik, og kræft i æggestokkene i almindelighed. Global DNA-methylering skifter under carcinogenese og er ofte en prædiktor for terapi responser. For eksempel Anisowicz et al. viste, at selv den normale del af lungen fra en cancerpatient allerede har oplevet et tab af global DNA-methylering sammenlignet med et normalt individ [24]. Kim et al. viste, at globale CpG methylering spiller en rolle i epigenetisk styring af radiosensitivitet i lungekræft cellelinier [25]. I gliomer, LINE-1 methylering, en global DNA methylering markering, er proportional med MGMT promotor methylering og højere LINE-1 methylering er en gunstig prognostisk faktor i primære GBMS, selv i forhold til MGMT promotor methylering [26]. Her observerede vi en lavere global CpG methylering i cisplatin resistente A2780CP celler sammenlignet med cisplatin sensitive A2780 celler, hvilket tyder på, at den globale DNA methylering mønstre kan være i stand til at forudsige cisplatin modstand for ovariecancer. Yderligere forsøg er nødvendigt at evaluere denne hypotese.

Vi opnåede 1.224 og 1.216 DMRs der er hyper-methylerede eller hypo-methylerede i A2780CP forhold til A2780 celler (tabel S1, S2). Vi fandt, at hypermethyleret gener i den følsomme cellelinje blev beriget for GO vilkår for anti-apoptose (GO: 0.006.916) og negative regulering af celledød (GO: 0.060.548), hvilket tyder på en mulig generel mekanisme af epigenetisk inaktivering af anti-apoptose gener, resulterer i følsomhed over for cisplatin. Vi fandt også, at DMRs er beriget i flere signalveje, herunder hsa04010 (MAPK signalvejen), hsa04310 (Wnt signalvejen), og hsa04115 (p53 signalvej) veje (tabel 3). Wnt signalvejen er blevet impliceret i ovariecancer progression og kemoresistens [27]. Aktivering af JNK /p38 MAPK pathways som reaktion på cisplatin kan føre til Fas-ligand induktion og celledød i ovariekarcinomceller [4]. P53 og dens signalvej blev også været impliceret i cisplatin resistens i ovariecancerceller [28], [29]. Vores data tyder på, at epigenetisk regulering af disse signalveje er en af ​​de mekanismer for inddragelse af disse veje i cisplatin modstand i æggestokkene cancerceller.

Vi har også identificeret hypermethylering på flere microRNA loci herunder hypermethylering af MI6A2, MIR129- 2, MIR124-1, MIR124-3, og MIR10A i A2780CP og hypermethylering af MIR185, MIR548Q, MIR642A og MIR661 i A2780 (tabel 4). MikroRNA’er har været impliceret i cisplatin-resistens i ovariecancer [30]. For eksempel, Yang et al. viste, at mange miRNA er dereguleret i human ovariecancer herunder MIR-214, MIR-199a *, MIR-200a, MIR-100, MIR-125b, og lad-7 klynge, og at MIR-214 inducerer celleoverlevelse og cisplatin resistens ved rettet mod PTEN [30]. Epigenetisk tavshed microRNA har været impliceret i kræft [31], [32]. Imidlertid methylering af miRNA locus er ikke tidligere blevet rapporteret for ovariecancere; hverken er rapporter om forholdet mellem miRNA methylering og cisplatin modstand. Vores data kunne tyde på en ny retning for studiet af methylering af microRNA loci og cisplatin modstand.

Vi fandt, at BCL2L1 (BCL2-like 1), PPKCE (protein kinase C, epsilon), PTK6 (PTK6 protein tyrosinkinase 6), RAC2 (ras-relaterede C3 botulinumtoksin substrat 2), SECTM1 (udskilt og transmembrane 1) er hypermethyleret i cisplatin sensitive A2780 celler og DDIT3 (DNA-skader-inducerbare udskrift 3) er hypermethyleret i cisplatin resistente A2780CP celler. Deres ekspression også blev også ændret tilsvarende til den hypotese, at hypermethylering ville lukke munden genekspression. Vi bekræftede methylering mønster af disse gener ved MS-PCR, og også var i stand til at demethylate initiativtagerne af disse gener og genoprette deres udtryk efter behandling med 5-aza-dC, en agent, der de-methylerer og reaktiverer af epigenetisk lyddæmpede gener [ ,,,0],23].

Vi fandt BCL2L1 er hypermethyleret i de følsomme A2780 celler. BCL2L1 (bcl-xl) koder for et protein, der hører til BCL-2-protein-familien, hvis protein andelshavere optræder som anti- eller pro-apoptotiske regulatorer [33]. Over-ekspression af Bd-XL-proteinet vides at bibringe resistens over for en bred vifte af potentielt apoptotiske stimuli i carcinogenese processer herunder onkogen aktivering, hypoxi og matrix løsrivelse [34] – [37]. Vores resultat viser, at hypometylering af BCL2L1 i de resistente celler (dvs. hypermethylering af BCL2L1 i de følsomme celler) vil medføre øget BCL2L1 udtryk, hvilket giver resistens over for cisplatin. Vores data er i overensstemmelse med observationen af ​​Williams et al. at ekspressionen af ​​Bd-XL i ovariecancer er forbundet med kemoresistens og tilbagevendende sygdom [38]. Tager sammen, dette tyder på, at modulere ekspressionen af ​​BCL2L1 (Bd-XL) ved epigenetiske midler kan være en måde at overvinde cisplatin modstand i æggestokkene cancerceller.

Vi identificerede også PTK6 (protein tyrosin kinase 6) som hypermethyleret i de cisplatin følsomme A2780 celler i forhold til A2780CP celler. PTK6 direkte phosphorylerer AKT og fremmer AKT aktivering som reaktion på epidermal vækstfaktor [39]. Forholdet mellem PTK6 med cisplatin er ikke tidligere blevet undersøgt. Yderligere funktionel analyse af PTK6 rolle i modulerende cisplatin modstand er berettiget. PPKCE (protein kinase C, epsilon) er et andet gen, der er hypermethyleret i cisplatin følsomme A2780 celler sammenlignet med A2780CP celler. PPKCE er medlem af proteinet kinase C (PKC) familie, hvis medlemmer phosphorylerer et bredt udvalg af proteinmål og er involveret i forskellige cellulære signalveje [40]. Interessant cisplatin var i stand til at inducere phosphorylering og translokation af PPKCE fra plasmamembranen til kernemembranen og den cytosoliske fraktion [41]. Hypermethyleringen af ​​PPKCE i de følsomme celler ville reducere dets ekspression, hvilket resulterer i mindre translokation til kernemembranen eller cytosoliske fraktion ved tilsætning af cisplatin. Men uanset om reduceret ekspression af PPKCE giver følsomhed over for cisplatin i æggestokkene kræftceller tilbage, der skal undersøges.

Endelig identificerede vi DDIT3 (DNA-skader-inducerbare udskrift 3) som hypermethyleret i cisplatin resistente A2780CP celler i forhold til A2780 celler. Også kaldet GADD153 (vækststandsning og DNA-beskadigelse-inducerbart protein 153), DDIT3 koder for et medlem af CCAAT /enhancer-bindingsprotein (C /EBP) familien af ​​transkriptionsfaktorer, og aktiveres af endoplasmatisk reticulum stress og fremmer apoptose. DDIT3 (GADD153) ekspression kunne induceres af cisplatin [42]. Vi observerede, at det er hypermethylering i de resistente celler, som ville resultere i reduceret ekspression af DDIT3. Det er muligt, at cisplatin virker gennem DDIT3 at fremme vækst og apoptose, og reduceret ekspression af DDIT3 i cellerne ville gøre dem mere modstandsdygtige over for cisplatin. Men den detaljerede mekanisme forblev, der skal undersøges.

Sammenfattende vi skabt en global datasæt for en kræft i æggestokkene cisplatin modstand model og identificeret flere gener, der blev udsat for epigenetisk kontrol til at modulere cisplatin modstand. Disse gener måske tjener som mål at overvinde kemoresistens til cisplatin i æggestokkene kræftformer.

Metoder

Cellelinjer

A2780 og A2780CP blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen), der indeholder 10 % kalvefosterserum (10099-141) ved 37 ° C og 5% CO

2. Celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Stephen Collins fra UC San Diego (CA, USA).

cytotoksicitet analyse

Både resistente og sensitive celler blev podet i plader med 96 brønde i en koncentration på 4000 celler /brønd i fem replikater med komplet dyrkningsmedium. Derefter blev cellerne behandlet med cisplatin i anden dosis fra 0 ug /ml til 16 ug /ml. Efter 72 timer inkubation blev både levedygtige og døde celler tælles ved hjælp MTT assay, og kun de levedygtige celler blev inkluderet i dataanalyse.

Bisulfite-modificeret DNA sekventering og Methylering-specifikke PCR

vi forberedt genomisk DNA fra dyrkede celler under anvendelse af DNeasy Blood væv Kit (Qiagen). Ca. 200 ng DNA var behandlet med bisulfit med EZ DNA-methylering-Gold kit (Zymo Research) ifølge producentens protokol. ZymoTaq Premix blev anvendt til methyleringsspecifik PCR (MSP) og i henhold til disse primere (Tabel S7). Methyleringsspecifik PCR blev kørt i et samlet volumen på 25 pi ved anvendelse ZymoTaq Premix (Zymo Research). MSP reaktioner blev underkastet indledende inkubering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 sekunder, og annealing ved passende temperatur i 35 sekunder og 72 ° C i 40 sekunder. Endelig forlængelse blev udført ved inkubering ved 72 ° C i 7 minutter. MSP produkter blev adskilt på to% agarosegeler og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning

De primere til bisulfit-modificerede sekventering (tabel S7) og MSP blev designet af web-værktøjer MethPrimer (http:. //www.urogene. org /methprimer /index1.html) [43]. Betingelserne for bisulfit modificerede sekventeringsreaktion er de samme som MSP. Produkterne blev oprenset ved anvendelse MinElute PCR oprensningskit, klonet i PMD 18-T-vektoren (Takara) og sekventeret.

RNA-isolering og Real time RT-PCR

RNA blev ekstraheret ved anvendelse af protokollen for Trizol-reagens (Invitrogen). 2 ug RNA blev først revers-transkriberet i 25 pi med en Archive Kit (Applied Biosystems) og 2 pi blev amplificeret ved Real Time PCR (Bio-Rad CFX96 Rea-time system). cDNA-prøver blev amplificeret med SYBR® forblanding Ex Taq ™. Den termisk cykling profil bestod af indledende denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder og 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. Hver prøve blev behandlet i tre eksemplarer.

5-Aza-2′-deoxycytidin behandling

Humane ovariecarcinomaceller A2780 og A2780CP blev dyrket i 5 dage i nærvær af forskellige koncentrationer af 5-aza -dC (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, og 10 uM). Frisk lægemiddel blev tilsat hver 24 timer.

Methyleret DNA-bindende protein-sekventering (MethylCap-seq)

3 ug af genomisk DNA isoleret som beskrevet ovenfor blev fragmenteret ved lydbehandling med Bioruptor (Diagenode, Belgien) og end-repareret, A-tailed, og ligeret til 2,5 mmol af “parrede-end” adaptere (IDT Inc.) i overensstemmelse med producentens anbefale protokol (Illumina Inc.). 1,2 ug af DNA’et blev fraktioneret på en hjemmelavet GST-MBD harpiks med en buffer med en trinvis forøget saltkoncentration [16]. Den høje fraktion salt blev direkte amplificeret ved 12-cyklus PCR [18]. Den 350-450 bp fraktionen af ​​PCR-produkterne blev geloprenset og kvantificeret ved anvendelse af en Agilent DNA 1000.

250-400 bp DNA-fraktioner blev udskåret og oprenset som beskrevet ovenfor. Produkterne blev vurderet og kvantificeret ved hjælp af en Agilent DNA 1000 serie II-analysen og Qubitfluorometer (Invitrogen) hhv. Hvert bibliotek blev fortyndet til 8 nM til sekventering på en Illumina Genome Analyzer II efter fremstillingen anbefalede protokol. Opnåede billeder blev analyseret og base kaldet hjælp Illumina forudsat GA rørledning software OLB 1.6.0 med standardindstillingen. Den rå læser fra MethylCap-seq blev forelagt GEO database, som tiltrædelsen nummer isGSE31418.

250-400 bp DNA brøkdel af den forstærkede fraktion var gel-renset. Hvert bibliotek blev fortyndet til 8 nM for sekventering ved Illumina Genome Analyzer II efter fremstillingen anbefalede protokol. Opnåede billeder blev analyseret og base såkaldte hjælp Illumina forudsat GA rørledning software OLB 1.6.0 med standardindstillingen. Den rå læser fra MethylCap-seq blev fremsendt til GEO-database (tiltrædelse nummer GSE31418).

Kortlægning af Sequence Læser

Menneskelig genom sekvens og kortlægning oplysninger (feb 2009 GRCh37 /hg19) blev