PLoS ONE: Udvikling af en biosensor til påvisning af pleura mesotheliom kræft Biomarkør Brug Surface Imprinting

Abstrakt

Hyaluronan-bundet protein 1 (HAPLN1), som har vist sig at være stærkt udtrykt i maligne pleurale mesotheliomas (MPM) , blev påvist i serum under anvendelse af en elektrokemisk overflade-prægende metode. Først blev påvisningsmetoden optimeret anvendelse af bovint serumalbumin (BSA) som model protein til at efterligne de optimale betingelser til at trykke lignende molekylvægt protein HAPLN1. BSA blev præget på guld elektrode med hydroxyl opsagt alkan thioler, som dannede en selvstændig samlet monolag (SAM) omkring BSA. Analytten (BSA) blev derefter vasket væk og dens aftryk (tom hulrum med form-hukommelse) blev anvendt til påvisning af BSA i en opløsning, under anvendelse af elektrokemisk åbne kredsløb potentiel metode, nemlig potentiometri. Faktorer for at optimere betingelserne indbefatter inkubationstid, proteinkoncentration, detektionsgrænse og størrelse af elektroden. Maldi-time of flight-massespektrometri (MALDI-TOF MS) blev anvendt til at bekræfte selektiviteten af ​​prægning. Med de opnåede prægning kontrolparametre, blev HAPLN1 præget i to eksemplarer og påvisning af spidse HAPLN1 er blevet gennemført i serum

Henvisning:. Mathur A, Blais S, Goparaju CMV, Neubert T, Pass H, Levon K ( 2013) Udvikling af en biosensor til påvisning af pleura mesotheliom kræft Biomarkør Brug Surface prægning. PLoS ONE 8 (3): e57681. doi: 10,1371 /journal.pone.0057681

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: May 10, 2012; Accepteret: 28 Januar 2013; Udgivet: 13 marts, 2013 |

Copyright: © 2013 Mathur et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er finansieret af en hær tilskud (W911NF-09-1-0499) for Potentiomeric påvisning af patogener. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En mulig helbredelse af kræft ville være mere sandsynligt, hvis sygdommen kunne detekteres tidligt for at optimere de terapeutiske procedurer. Extracellulære matrix (ECM) har sin betydning ikke kun for den fysiske understøttelse af forskellige celler, men også i celle-celle interaktioner cellesignalering og celle reparationsprocesser. Derfor ECM-proteiner selv udgøre en potentiel overvågning mål afspejler de løbende ændringer. Hvis der forekommer ændringer på grund af tilstedeværelsen af ​​en sygdom, såsom cancer, ville påvisning af disse ændringer være en formodet afsløring af kræft, før eventuelle symptomer opstår. Som et eksempel, heparanase enzym [1], en endo-ß-glucuronidase, er et multifunktionelt enzym påvirker afgørende trin i udviklingen af ​​mange typer af cancere, såsom gastrisk [2], non-small lung [3], esophageal [4] , hoved og hals [5], bryst [6] og pancreas [7] cancere som eksempler.

heparanase spalter enzymatisk heparinsulfat og med serinproteinaser og metalloproteinaser spiller en afgørende rolle i den ekstracellulære matrix remodeling forbundet både med in situ tumorvækst og metastatis-relaterede invasion af cancerceller. Det enzymatisk inaktiv form af heparanase har vist sig at påvirke cellesignalering, og dermed øge cancervækst med opregulering af adskillige gener ekspression [8]. Kommercielle biomarkører til overvågning asbest-induceret lungehindekræft aktivitet er mesothelin og opløselige mesothelin relateret peptid (SMRP). Osteopontin (OPN) og CA125 har på lignende måde relateret til kræft-linked heparanase-aktivitet foruden hyaluronan, TRA og ferritin. De ECM remodeling begivenheder kan sikkert være et mål for diagnose af de tidlige stadier af kræft invasion [9] samt mål for anti-kræft behandlinger. Hyaluronsyre (hyaluronan, hyaluronat, HA) er en lineær, meget høj molekylvægt glycosaminoglycan, er en af ​​de mest udbredte ECM-proteiner. HA har vist sig at eksistere på et højt niveau i tyk-, epitelial ovariecancer og brystkræft [10] – [12] og også tumor væksthæmning er blevet dokumenteret, da HA-bindende motiver er blevet berørt [13]. HA overekspression er i høj grad afhængig af CD44, så reguleringen af ​​blærekræft vækst, invasion og angiogenese blev bevist at ske gennem CD44 ved HA-syntase-1-ekspression [14]. Som HA-ekspression synes at være klart kraftigere ved forekomsten af ​​kræft er det ikke overraskende, at Ivanova et al har vist, at også HAPLN1 protein, som hjælper til at linke proteoglycaner til en HA kerne, har vist sig at være forhøjet i cancerceller.

malignt pleura mesotheliom er en sjælden malign forårsaget af asbest eksponering, som har en dårlig prognose. Brusk link protein HAPLN1 bliver undersøgt som en kandidat biomarkør, fundet at være overudtrykt i lungehindekræft fase 1 sammen med en stærkt udtrykt kræft biomarkør osteopontin (OPN1) placeret i det samme gen sæt [15]. Immunoassays er almindeligt anvendt til påvisning af cancer biomarkører, som de viser overlegen selektivitet, men kan være tidskrævende og dyrt. De biologiske funktioner af markører såsom heparanase understrege vigtigheden at designe omkostningseffektive metoder tillader tidlig påvisning af sådanne biomarkører i serum og væv både til diagnostiske og prognostiske formål samt til overvågning af kræftbehandling.

Også påvisning af meget lav koncentration af sådanne biomarkører med ELISA-test er vanskeligt. Derfor er der et presserende behov for udvikling af nye teknologier, der er både hurtige og meget følsom til at påvise lave koncentrationer af biomarkører. Tidlig diagnose vil give mere tid til behandling af kræft, hvilket er afgørende for at redde et liv. Molekylære præget polymerer at blive betragtet som en passende erstatning for antistof-baserede systemer som biosensorer, på grund af bedre stabilitet og genanvendelighed af overflader de bio-anerkendelse [16]. Biosensorer er sammensat af to komponenter, bio-receptorelement og signaltransduktion komponent. En bio-receptor overflade lavet med molekylære prægede polymerer ville være to størrelsesordener billigere derefter antistoffer. Som prisen på hydroxylerede alkan thiol polymer ville koste omkring $ 0,2-0,6 mg

-1 i forhold til antistoffer, som varierer afhængigt af målet. Antistoffer genereret for at målrette den menneskelige HAPLN1 protein ville koste omkring $ 900 $ 1000 mg

-1. Selv lave densitet af sådanne antistoffer på immunoaffinitetskolonner patroner har højere pris end molekylære prægede polymerer, som koster mellem $ 10 til $ 100 mg-1. Høj pris for HAPLN1 antistoffer øge udgifterne til HAPLN1 ELISA kits kommercielt tilgængelige til $ 10 /test. Betragtninger en præget guld belagt sensor chip (1 cm x 1 cm) ville koste ca $ 1.2 /test og kan bruges flere gange til flere analyser modsætning antistoffer, som ikke kan genbruges.

I vores undersøgelse sigter vi mod at udvikle et redskab til tidlig opdagelse af biomarkører. Target proteinmolekyler co-adsorbere på overfladen af ​​guld elektrode med thioler, og de sammen danner en godt pakket monolag. Fjernelse af proteinmolekylerne fra SAM formular imprint hulrum og den funktionelle hydroxyl hovedgruppen af ​​thioler giver specificitet til hulrummet. Komplementariteten i størrelse, form og hydrofobicitet giver affinitet til det samme molekyle, som er blevet præget.

påtrykt elektrode anvendes derefter til at analysere skabelonen i buffer ved anvendelse potentiometri. Som det ladede protein molekyle i buffer binder til hulrummene det ændrer potentiale måleelektroden. Syntese af aftrykket overflade er ligetil og kræver ingen kostbar teknologi til forberedelse. Det er en gammel, men lovende teknologi, der har udviklet med de udfordringer, den har stået over i fortiden.

I 1930 en sovjetisk videnskabsmand MV Polyakov viste, at silicagel fremstillet i nærvær af et opløsningsmiddel additiv viste foretrukne bindende til det samme opløsningsmiddel [17]. Linus Pauling og Frank Dickey offentliggjort i 1949, at silica viser specificitet for farvestoffer præget på overfladen [18]. Stort gennembrud i molekylær prægning fandt sted i 1972, da Gunter Wulff forberedt molecular imprinted organiske polymerer ved hjælp af kovalente binding fremgangsmåde, der kan skelne mellem enantiomerer af glycerinsyre [19]. Wulff et al. anvendt en tilgang, der blev den mest berømt for molekylær prægning studier i løbet af 70’erne, indtil en anden teori blev indført i 1981 af Mosbach og kolleger. De skabte molekylære aftryk baseret på ikke-kovalent binding med skabelonen [20]. Det var den enkelhed af denne tilgang, som udløste en eksplosion i 90’erne med molekylær prægning polymerer. Vi har anvendt ikke-kovalent binding, der blev indført ved Wulff et al. til at trykke HAPLN1 biomarkør ved hjælp hydroxyl funktionelle grupper på thioler, der danner svage interaktioner med proteinet og et godt udstyret skimmel omkring samme. Dette tilvejebringer større specificitet til hulrummet, hvilket gør fjernelsen af ​​HAPLN1 fra hulrummet lettere. Aftrykket blev optimeret for potentiometri anvendelse af BSA (66 kDa) protein (figur 1), på grund af dets lighed i størrelse med HAPLN1 cancer biomarkør (65 kDa). Vi testede specificiteten af ​​de prægede hulrum, ved hjælp af MALDI-TOF, ved at udføre tests for at vise, at en relativt mindre protein Myoglobin (17 kDa) ikke binder til BSA aftryk.

(A-C) Indsættelse af protein i SAM. (D) Wash. (E-F) Binding af BSA analyt protein, hæmoglobin som en ikke-specifik kontrol.

Materialer og metoder Salg

Princippet om potentiometrisk detektion

i vores teknologi, har vi brugt potentiometri til påvisning af målanalyt HAPLN1. En potentiometer måler den potentielle forskel mellem en referenceelektrode (Ag /AgCl) og arbejdselektroden. Analyt binder til bioreceptor overflade på arbejdselektroden i en pufferopløsning, hvilket resulterer i en ændring i potentialforskel mellem de to elektroder. Denne ændring måles derefter af systemet. Mindre biomacromolecular ioner ikke resulterer i en spænding som de forbliver i ligevægt med elektrolytten.

De stærke spænding respons resultater fra macroions bindende via omfattende makromolekylære hydrogenbindinger omkring aftryk på arbejdselektroden (Gold belagt silicium chip ), en stor biomacromolecule rekombinant HAPLN1, 65 kDa størrelse protein samler med thioler, der danner en organiseret, tætte SAM omkring analytten. Thioler har tendens til selv samle på guld overflade som svovlgruppen på slutningen af ​​thioler danner et svovl-metalbinding med guld [21]. Organiseret SAM er en vigtig “fugemasse” mod interferrents og pinholes for parasitiske strøm. Makromolekylet vaskes derefter fra overfladen, hvilket resulterer i dannelse af hulrum. Den påtrykt elektrode fungerer som bioreceptor element biosensoren. Således påtrykt elektrode arbejder med samme principper som kommerciel ion selektive elektroder, som har en specifik ionophor at genkende analyt ion. Vi viser, at potentiometri kan anvendes med god følsomhed og selektivitet til at påvise mål-cancer biomarkør i bufferopløsning og i spiked serum. Den elektrokemiske reaktion opnås med denne teknik skyldes den potentielle ændring efter binding af skabelonen protein. Ændringen i potentiale måles i forhold til en reference Ag /AgCl-elektrode [22], [23].

Materialer kræves til elektrokemisk måling

bovint serumalbumin (BSA) fra okseblod ( mw = 66,3 K), Myoglobin fra equin skeletmuskel (Mw = 17,6 K), 11-mercapto-1-undecanol (97%) (thiol), absolut ethanol, methanol og isopropanol blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Human HAPLN1 (64,68 kDa) i fuld længde ORF (AAH57808, 1-354 a.a.) rekombinant protein med GST-tag ved N-terminal blev indkøbt fra Abnova Corporation (Walnut, CA) og opbevaret ved -80 ° C. Alle proteinerne og kemikalier blev anvendt som modtaget. To slags elektroder blev anvendt som måleelektroden: guld (50 nm) katodecoatet siliciumwafer (1 cm x 2 cm) og guldelektroder (2 mm

2) indkøbt fra basi (West Lafayette, IN). De potentiometriske målinger blev udført i 10 ml 1X PBS i 20 ml glasbeholder udstyret med en magnetisk omrører. Når det fortyndes til en 1X koncentration, 10 X phosphatpufret saltopløsning indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), hvilket gav en phosphatpuffer koncentration på 0,01 M og en natriumchloridkoncentration på 0,154 M med pH 7,4. De to-elektrode bestod af en Ag /AgCl som referenceelektrode og silicium overtrukket guld chip guldelektrode som arbejdselektroden. Potentialerne for arbejdselektroden mod referenceelektroden blev målt med en Accumet AR15 potentiometer købt fra Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) og EMF 16 kanals Elektrokemisk interface købt fra Lawson Labs (Malverin, PA)

påkrævet

Materialer til MALDI TOF

Guld måltavle blev købt fra Bruker Daltonics (Billerica, MA). TA-opløsning (0,1% trifluoreddikesyre /acetonitril, 02:01, vol:vol) og sinapininsyre blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) i matricen forberedelse at immobilisere proteinbundet på overfladen af ​​målpladen . Bruker Autoflex MALDI-TOF købt fra Bruker Daltonics (Billerica, MA) blev anvendt til at bestemme specificiteten af ​​proteinbinding til respektive aftryk på overfladen af ​​målpladen. Kemisk resistent komfortabel PTFE (Teflon) Tape blev købt fra CS Hyde selskab (Lake Villa, IL). Nitrogen gas blev leveret af Presto-O-salg og service (LIC, NY).

BSA Sensor Fabrication

De siliciumchips blev renset ved lydbehandling i deioniseret vand, methanol og isopropanol. Siliciumchips fik lov at tørre natten over og derefter katodecoatet med guld. Guld belagte chips blev derefter vasket med deioniseret vand og tørret med ren nitrogengas. Tilsvarende guldelektroder blev renset med 0,1 og 0,05 mikron aluminiumoxid og derefter sonikeret med deioniseret vand for at fjerne eventuelle bundne aluminiumoxidpartikler. Da proteiner denaturerer i ikke-vandig opløsning og thioler viser ringe opløselighed i vandig opløsning proteiner blev opløst i deioniseret vand henviser thioler blev opløst i absolut ethanol. Kompromittere blandede opløsninger af 19:01 og 18:02 (water: ethanol) med endelig thiol koncentration på 0,1 mM og 0,2 mM blev forberedt i rene glasbeholdere og forholdsvis undersøgt for at opnå en god opløselighed thioler og undgå proteinpræcipitation. Guldet belagt elektrode dyppes derefter inde i blandede opløsning til dannelse af selvsamlende monolag af protein og thiol. Lederen rum i beholderen er fyldt med inert nitrogengas og dækket med parafilm. Inkubationstid på chippen i den blandede opløsning blev varieret for en bedre præget overflade. Guldchippen derpå grundigt skyllet med deioniseret vand for at fjerne det bundne protein. Også forskellige proteinkoncentrationer på 30 pg /ml, 10 ng /ml og 1 ng /ml blev anvendt til at danne aftrykkene og de bindende resultater blev sammenlignet. Elektroderne forberedt blev derefter brugt til at kontrollere bindende svar med variable koncentrationer BSA i bufferopløsning.

Udarbejdelse af Imprints på MALDI-TOF måltavle

Bortset overfladen indeholder 384 brønde, resten af ​​den guld måltavle (8 cmx12.5 cm) blev dækket med ikke-reaktiv Teflon tape. Guld måloverflade blev renset med ethanol og deioniseret vand. Kontrolleret strøm af inert nitrogengas blev anvendt til at tørre måloverfladen. Opløsning A blev fremstillet med en 19:01 blanding af 16.17 mg Myoglobin (dvs. 1,7 uM) i 540 ml deioniseret vand og 0,22 g 11-mercapto-1-undecanol (dvs. 2 mM) i 540 ml absolut ethanol. Denne løsning blev dannet for at skabe myoglobin aftryk på den ene halvdel af guld måltavle. Opløsning B indeholdt 19:01 forholdet blanding (water: ethanol) af 16.17 g bovint serumalbumin (dvs. 0,432 uM) opløst i 540 ml deioniseret vand og 0,22 g 11 mercapto1-undecanol (dvs. 2 mM) i 540 ml absolut ethanol. Denne løsning var parat til at oprette BSA aftryk på den anden halvdel af guld målplade. Halvdelen af ​​Au pladen blev nedsænket i opløsning A i 12 timer til at co-absorbere protein og thiol, hvorefter den blev tørret med ren nitrogengas. Tilsvarende den anden halvdel af guldet målplade er nedsænket i opløsning B i 12 timer og tørres med ren nitrogengas. Protein- og thiol koncentrationer blev holdt samme som anvendt til prægning på guld elektrode til potentiometri. Huller, som er komplementære med skabelon proteiner blev skabt i monolag ved at fjerne de proteinmolekyler gennem gentagne skylning med deioniseret vand. Opløsning C blev fremstillet med ækvimolær blanding af 1 ng /ml BSA og myoglobin i 540 ml deioniseret vand. Denne opløsning blev dannet til assay proteinbinding til to forskellige typer hulheder på guld målplade overflade. Brønde på måloverfladen blev inddelt i fire kvadranter (figur 2) og brønde i række I (1-24) til P (1-24) blev dyppet i 10-15 minutter i opløsning C. Overfladen blev skyllet forsigtigt og fik lov at tørt med nitrogengas. Derefter 1 pi SA matrix tilsættes til målet og fik lov at tørre. Godt i række A (1-24) til H (1-24) blev anvendt til kontrol studier. Målet plade blev derefter brugt til MALDI- TOF analyse.

Kolonner (1-12) til myoglobin og søjler (13-24) for BSA prægning sites. Rækker I til P blev nedsænket i analytopløsningen C indeholdende både analyt proteiner.

HAPLN1 Sensor Fabrication

HAPLN1 protein er overudtrykt i de fleste mesotheliomas og dermed betragtes som en potentiel biomarkør for detektion af kræft. I en ren glasbeholder 20 ug HAPLN1 (64,68 kDa) protein blev opløst i 10 ml deioniseret vand (dvs. 0,03 uM) og 4 mg 11-mercapto-1-undecanol blev opløst i 10 ml ethanol (dvs. 0,1 mM) . En blandet opløsning dannes ved at opløse begge opløsningerne i 19:01 ratio (water: ethanol), således at den endelige koncentration af thiol i opløsningen bliver 0,1 mM. Tre guldelektroder A, B og C blev dyppet i opløsningen i 12 timer og derefter elektroderne blev skyllet grundigt med deioniseret vand til fjernelse af bundet protein på overfladen.

Sensor reaktion på HAPLN1 spiked serumprøver

HAPLN1-præget elektroder blev også anvendt til potentiometrisk reaktion på kræft biomarkør spiket i serum. Den 100 nM stamopløsning i 01:08 serum og buffer forhold blev fremstillet ved at fortynde 100 pi humant serum med 650 pi 1X PBS-opløsning og med 250 pi af den kommercielle 102 ug /mL HAPLN1 opløsning (dvs. i alt 25,5 ug HAPLN1). koncentrationen HAPLN1 i stamopløsningen blev derefter 6,5 mg /ml (100 Nm). 10 pi opløsning blev anvendt til titrering i 10 ml PBS-buffer, og den højeste koncentration af protein er 10

-9 M. Resterende standarder blev fremstillet ved at opretholde den samme fortyndingsforhold (1:08) af serum i puffer men analyt koncentration blev reduceret ti gange med serielle a 6,5 ​​mg /ml (100 nM) standard spiked løsning.

Resultater

Optimering af parametre for BSA Sensor

BSA proteinmolekyler var påtrykt den hydroxylterminerede alkan thioler på guld overflade. Som thioler danner en organiseret monolag med tiden på guldoverfladen det var afgørende at studere inkubationstiden af ​​guldbelagt silicium chip inde i proteinet-thiol løsning til at opnå stabile aftryk. I dette eksperiment koncentration BSA i den blandede opløsning var 30 ug /ml og Figur 3a viser virkningen af ​​inkubationstiden på stabiliteten af ​​prægning. Tre elektroder blev fremstillet ved at holde chips inde opløsningen i 2, 6 og 12 timer. Den blandede opløsning i dette eksperiment havde et forhold på 18:02 (water: ethanol) med 0,2 mM 11 mercapto1-undecanol. Alle målinger blev udført i phosphatpuffer saltvand (pH 7,4) i en 10 ml opløsning. En logaritmisk stigning i potentiale blev observeret med stigende BSA-koncentration i puffer kun med elektroden, som blev inkuberet i op til 12 timer. Resultaterne indikerede, at mere stabile aftryk blev dannet, når chippen blev holdt i opløsning i 12 timer. Eksperimenter blev derefter udført for at optimere betingelserne for at opnå stabilt protein prægning. Den potentiometrisk respons blev undersøgt ved at variere koncentrationen af ​​BSA trykt på elektroden til dannelse af hulrum. I dette eksperiment to elektroder blev fremstillet ved anvendelse af to forskellige koncentrationer af 30 mg /ml og 1 ng /ml BSA i blandede opløsninger af protein og thiol.

A. Virkning af sættetid af 2 timer (___), 6 timer (…) og 12 timer (—). B. Virkning af proteinkoncentration på 30 ug /ml (▴, x) og 2 ng /ml (◊, △). C. Virkning af protein koncentration på 10 ng /ml (□) og 1 ng /ml (▴) og kontrol med SAM kun (x, ◊).

Disse blandede opløsninger blev fremstillet med en 19 :1 ratio (water: ethanol) med en slutkoncentration på 0,1 mM 11-mercapto-1-undecanol. Inkubationstiden blev holdt ved 12 timer, da dette har vist sig at understøtte dannelsen af ​​de mest stabile prægning.

Som vist i figur 3b, en logaritmisk forøgelse af ændringen i potentialet sker med større koncentration protein . Svaret fra elektroden fremstillet med 30 ug /ml protein prægende koncentrationen meget højere sammenlignet med den anden elektrode fremstillet med et lavere proteinindhold prægning koncentration. Dette viser, at antallet af kaviteter dannet på overfladen stiger som mere protein er adsorberet på overfladen. Det isoelektriske punkt af et protein defineres som den pH, hvor nettoladning på et protein overflade er nul. Eftersom BSA-molekyler har et isoelektrisk punkt på 4,7, de har en netto negativ ladning i en pufferopløsning med pH 7,4. Som mere ladede molekyler binder til elektrodeoverfladen det fører til en drastisk ændring i potentiale. Resultaterne blev gentaget med succes for bekræftelse. Figur 3b viser også en højere potentiel forandring med en 19:01 (water: ethanol) forhold i forhold til en 18:02 forhold fra figur 3a. Dette resultat indikerer, at flere hulrum er dannet som thiol koncentration i opløsningen reduceres. At nedskalere processen og forberede mere følsomme elektroder, koncentrationer lave prægende af 1 ng /ml og 10 ng /ml blev valgt baseret på tidligere eksperimentelle data. Eksperimenter blev udført med guld elektrode af meget mindre overfladeareal (2 mm

2). Arbejdselektroden blev fremstillet i en 19:01 (water: ethanol) -forhold med en slutkoncentration på 0,1 mM 11-mercapto-1-undecanol. Som vist i figur 3c elektroden viser en god binding respons på 15-20 mV med meget lave koncentrationer af BSA i forhold til en lav binding respons på 2-4 mV observeret med tilberedte elektroder, som kun har SAM på deres overflade.

Validering under anvendelse af MALDI-TOF

i dette eksperiment 1 pi matrix blev anbragt på toppen af ​​hver brønd på påtrykt Maldi plade og fik lov at tørre. MALDI plade analyse software med en algoritme til at indsamle data med en scanning hastighed på 2000 laser skud /s for hver plet i en brønd blev valgt. Da halvdelen af ​​384 brønde på MALDI plade blev præget BSA og den anden halvdel med myoglobin protein, blev tilfældigt fem brønde valgt blandt myoglobin præget brønde og tilsvarende fem blev valgt fra BSA præget brønde, til analyse af protein bundet til hulrummene. Som vist i figur 4, er tre-tegn symbol m /z i x-aksen anvendes i massespektroskopi til at betegne den dimensionsløse mængde, der dannes ved at dividere massen af ​​en ion i ensrettede atommasseenheder ved sin chargenummer.

A. Myoglobin præget brønde og B. BSA præget brønde.

Y-aksen viser signal intensitet, men i stedet for at bruge tællinger per sekund (cps), den fælles procedure er at relatere intensitet til relative forekomst med en brug, hvis en intern standard. Som vist i figur 4a myoglobin, som har en molekylvægt på 17 kDa blev observeret at være bundet til kun myoglobin påtrykt brønde som en top forekommer ved 17 kDa for hver brønd og ingen myoglobin blev observeret i BSA hulrum som vist i figur 4b. BSA blev observeret at være af for stor molekylvægt under disse ionisering betingelser.

HAPLN1 Sensor

Efter BSA undersøgelser for at optimere betingelserne for prægning biomakromolekyler, HAPLN1 præget elektroder blev fremstillet til lav koncentration påvisning af biomarkør. Tre præget elektroder blev undersøgt for at verificere svar efter afsløring. To uafhængige forsøg viser en drastisk 25 mV ændring i potentialet ved meget lave koncentrationer på 10

-12 M som HAPLN1 blev titreret ind i pufferopløsning (figur 5a) HAPLN1. Som kontrol blev BSA også titreres under de samme betingelser, som viser en meget lav potentiel respons ved høje BSA-koncentrationer. Eksperimentet blev derefter udført i serum med en spidse HAPLN1 koncentration. Figur 5b viser, at den påtrykt elektrode har en høj drift i serum, men viser en bemærkelsesværdig potentiel ændring ved 10

-9 M koncentration af HAPLN1 i serum.

A. HAPLN1 binding til HAPLN1 aftryk (to uafhængige forsøg), Kontrol BSA respons på HAPNL1 aftryk. B. Spiked HAPLN1 analyt serum løsning til at HAPLN1 aftryk.

Diskussion

Påvisning af kræft biomarkører med en lav pris og nem at bruge metoden er vigtig for løbende overvågning af flere markører. HAPLN1 er et eksempel på stigende betydning på området som for eksempel Nelson et al [24] for nylig afsluttet en transkriptom analyse af blod vaskulære (BEC) og lymfeendotelceller (LEC) og klyngedannelse analyse viste klart differentieret genekspression for BEC og LEC . HAPLN1 blev næsthøjeste udtrykte gen i LEC og som tumorer tage fordel af disse metastatisk potentiale forstærkende molekyler, kan den observerede høje HAPLN1 udtryk føre til nye terapeutiske behandlinger for metastaser af kræft til lymfeknuder. To-dimensionelle molekylær prægning teknologi er blevet brugt til at trykke og detektere små molekyler [25] – [29] lignende peptider men prægende makromolekyler forblev en udfordrende opgave. Biologiske makromolekyler som proteiner har høj molekylvægt og dermed deres store størrelse hindrer adsorption på overfladen og fjernelse fra færdige aftryk [30] – [33]

Det store antal bindingssteder og funktionelle. grupper på proteinet overfladen kan øge problemer relateret til ikke-specifik binding med molekylært prægede proteiner (i tilsagnet), der fører til dårlig selektivitet [34]. Derfor er det vigtigt at optimere alle de nødvendige parametre og betingelser for at opretholde stabiliteten af ​​sådanne store strukturer i hele processen med prægning. Vi valgte BSA-protein (65 kDa) for optimeringsprocessen grundet dens lignende størrelse til kræft biomarkør kandidat HAPLN1. I fig 3a og fig 3b mere stabile aftryk er dannet med inkubation i 12 timer tid og en stigning i respons forekommer, når flere målmolekyler er præget på 30 pg /ml sammenlignet med 1 ng /ml koncentration. Lignende betingelser blev anvendt af Wang et al [35] for at vise, hvordan aftryk dannet med forskellige størrelse proteiner er stærkt specifikke for deres respektive aftryk elektrode hjælp potentiometrisk detektion. MALDI TOF teknik har været anvendt som en ny metode i vores arbejde for at bekræfte specificiteten af ​​aftryk site, også vist ved potentiometrisk detektion. Figur 4 viser myoglobin proteiner binder specifikt til dens præget hulrum og ikke til BSA-hulrum. Vi mener, at eftersom myoglobin proteiner er meget mindre i størrelse (17 kDa) sammenlignet med BSA, ville myoglobin ikke passer ind i BSA skimmel og således ikke binding til større BSA hulrum. Resultater af BSA specificitet kunne ikke bekræftes med MALDI-TOF grundet dårlig Udstyrets følsomhed i retning proteiner med høj molekylvægt. Vi har benyttet potentiometrisk detektion til optimering af hulrum med BSA og til detektion af HAPLN1 i buffer og i spiked serum. Vores resultater i figur 5a viser 25 mV respons HAPLN1 at HAPLN1 påtrykt elektrode sammenlignet med lav reaktion fra BSA-protein i buffer og lignende resultater blev opnået i spiked serum. Selvom vi vise potentiometrisk respons opnåede er specifik for det protein, præget og er et resultat af protein binding, er en klar forståelse øjeblikket mangler til elektrokemisk signal (potentiel ændring) induceret af proteinadsorption. Adskillige mekanismer er blevet foreslået, herunder af Thompson et al. Han foreslår faktorer, som kan bidrage til at ændre i arbejdsfunktion [36] af guld, når protein binder sig til guld overflade og dermed vise, hvordan ændringer i arbejdet funktion resulterer i ændring af overfladen potentiale. I fremtidige eksperimenter planlægger vi yderligere kontrollere specificitet HAPLN1 proteinbinding til imprint hulrum ved overfladen plasma resonans teknologi (SPR) og også at opnå kliniske data til validering.

Konklusioner

Vores data demonstrerer brug af SAM danner vandopløselige hydroxylerede alkanthioler at forlag biomakromolekyler. BSA viste sig at være en effektiv model protein for at optimere styreparametre såsom proteinkoncentration, forhold mellem de molekylære komponenter, og inkubationstiden for chippen til at nedskalere processen med prægning til påvisning af lave koncentrationer af proteiner. Molekylær Indfotografering baseret biosensor lykkedes bygget til at genkende malignt pleura mesotheliom kræft biomarkør HAPLN1 og demonstreret høj følsomhed ved at registrere lav koncentration af biomarkør i serum /bufferopløsning. Sensoren viste en detektionsgrænse på picomolære koncentrationer med en responstid på 2-5 minutter. De lave omkostninger af sensoren er baseret på manglen på dyre monoklonale antistoffer, yderligere mærkning molekyler og om enkelhed af åbent kredsløb potentielle måling med et potentiometer, som også er meget let at bruge (svarende til pH-meter).