PLoS ONE: MicroRNA-214 blænder onkogenese og Udøver Indvirkning på Prognose ved målretning PDRG1 i Blære Cancer

Abstrakt

MicroRNA-214 (miR-214) er blevet rapporteret til at blive dysreguleret i humane blærekræft væv. Vi havde til formål at undersøge den kliniske sammenhæng, biologisk betydning og molekylær netværk af miR-214 i blærekræft. Vores resultater viste miR-214 blev nedreguleret i blærekræft væv og signifikant associeret med tumor stadie, lymfeknude status, klasse, multifocality, historie af ikke-muskel-invasiv blærekræft (NMIBC). Desuden kunne MIR-214 fungere som en uafhængig faktor for fornyet overlevelse (RFS) og samlet overlevelse (OS) til patienter med muskel-invasiv blærekræft (MIBC). Restaurering af miR-214-ekspression i blære cancer cellelinjer hæmmet celledeling, migration, invasion og markant fremmet apoptose. Dual-luciferase reporter assay anerkendt PDRG1 som direkte nedstrøms target genet af MIR-214. PDRG1 blev øget betydeligt i tumorer lav af miR-214 og knockdown af PDRG1 efterlignede virkningerne af miR-214 overekspression. Vores resultater åbenbart, at miR-214 kunne udøve tumor-undertrykkende effekter i blærekræft ved direkte nedregulere onkogen PDRG1 og foreslå en tiltalende roman indikator for prognostisk og terapeutisk intervention blærekræft

Henvisning:. Wang J, Zhang X, Wang L, Yang Y, Dong Z, Wang H et al. (2015) MicroRNA-214 blænder onkogenese og Udøver Indvirkning på Prognose ved målretning PDRG1 i blærekræft. PLoS ONE 10 (2): e0118086. doi: 10,1371 /journal.pone.0118086

Academic Redaktør: Chengfeng Yang, Michigan State University, USA

Modtaget: August 23, 2014 Accepteret: Jan 4, 2015; Publiceret: 23 feb 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens reaktion på bedømmere Støtte Information filer. Men af ​​etiske grunde, kan vi ikke levere disse deltager-niveau data i en understøttende oplysninger fil eller offentlig arkiv. Imidlertid kan andre forskere adgang til dem fra Medical Ethics Committee of Qilu Hospital of Shandong University og Linyi Folkets Hospital ved at kontakte 1. Medical Ethics Committee for Videnskabelig Forskning Institut, Qilu Hospital, Shandong University, 107 Wenhua West Road, Jinan 250.012, Shandong-provinsen, Kina. Tlf: + 86-531-82169035; Email: [email protected]; 2. Medicinsk Ethics Committee of Medical Department, Linyi Folkets Hospital, 27 Jiefang Road, Linyi 276.003, Shandong-provinsen, Kina. Tlf: + 86-539-8216157; Email:. [email protected]

Finansiering: Denne undersøgelse modtaget økonomisk støtte fra National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til CW (nr 81.271.916) og Natural Science Foundation of Shandong-provinsen (https://www.sdnsf.gov.cn/portal/) til XZ (ZR2013HQ063). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den fjerde mest almindelige kræftform diagnosticeret i de udviklede lande og tegner sig for den næststørste dødsårsag blandt patienter med uro-genital tract maligniteter verdensplan [1, 2]. Selvom ca. 75% af tilfældene er grupperet som NMIBC med en relativ høj 5-års overlevelse på [3, 4], andre 25% af patienterne med MIBC udsættes for efterfølgende metastatisk sygdom efter den første aggressiv behandling [5]. Undersøgelse af nye terapeutiske modaliteter og identificere prognostiske biomarkører for blærekræft baseret på nye molekylære netværk er blevet forskning hotspots for nylig.

microRNA (miRNA) udgør en klasse af små, endogene, ikke-kodning, 22-nukleotider RNA molekyler, funktion som post-transkriptionel regulator ved delvis bindingen med 3′-utranslaterede regioner (UTR) af mål-mRNA’er, der fører til mRNA nedbrydning eller translationel undertrykkelse [6, 7]. Det er blevet slået fast, at miRNA kan regulere 60% af humane protein-kodende gener [8] og spiller afgørende roller i forskellige fysiopatologiske processer [9, 10]. miRNA er blevet identificeret som enten tumor undertrykkere eller onkogener [11]. I betragtning af deres sygdoms- og vævsspecifikke udtryk profiler og fantastiske lovgivningsmæssige muligheder, der miRNA bliver vurderet som fascinerende biomarkører for kræft diagnose og prognose [12]. Tidligere rapporter har vist afvigende regulering af miRNA i blærekræft og flere miRNA (

e

.

g

., MiR-9, miR-182, miR-200b, miR-145 og miR- 129) viser prognostiske værdi [13-17]. Yderligere undersøgelser er forlangte at afkode de underliggende regulatoriske veje, som miRNA deltager i carcinogenese for blærekræft, og identificere miRNA fungerer som nye terapeutiske mål eller som prognostiske biomarkører for blærekræft.

Nogle undersøgelser har rapporteret, at miR- 214 blev opreguleret og bidrog til sygdomsprogression og fjernmetastaser i malignt melanom [18, 19], mens andre har vist, at miR-214 var nedreguleret og havde en tumor-undertrykkende effekt i livmoderhalskræft [20], brystkræft [21] og human hepatocellulært carcinom [22]. Ovenstående beviser peger på, at miR-214 kan spille afgørende og forskelligartede roller i onkogenese af forskellige tumortyper, men alligevel potentielle mekanismer miR-214 er stadig ikke helt bragt i orden. Hidtil har der været lidt offentliggjort papirer, der involverer den funktionelle analyse og molekylær netværk af miR-214 i blærekræft, selvom et par miRNA profilering undersøgelser viste, at miR-214 blev dysreguleret i blærekræft [23, 24].

i denne undersøgelse, vi vurderede udtryk niveau af miR-214 i humane blærekræft væv, analyseret sin mulige prognostisk relevans og udført de relevante funktionelle eksperimenter. Vi opdagede, at miR-214 kunne hæmme blærekræft celleproliferation, migration, invasion og udøve afgørende proapoptotiske funktion. Endvidere blev onkogen PDRG1 verificeres for første gang som en direkte downstream mål for miR-214 i blærekræft. Denne rapport impliceret en tumor suppressor rolle og reguleringsmekanismer for miR-214 i blærekræft.

Materialer og metoder

Cell kultur

ikke-malign SV-40 udødeliggjort blære epitelcelle (SV-HUC-1) og to blærekræft cellelinjer (T24 og 5637) blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) den 22. maj 2014 at have bestået prøven af ​​DNA-profilering (kort tandemgentagelser, STR). SV-Huc-1 celler blev dyrket i F12K-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; TBD, Tianjin, Kina) og de to blære cancercellelinier dyrkedes i modificeret RPMI 1640-medium (Hyclone, Logan, UT) suppleret med 10% FBS (TBD, Tianjin, Kina) ved 37 ° C i en befugtet inkubator (5% CO2). Salg

Patienter og vævsprøver

Denne undersøgelse blev godkendt af Medical Ethics Committee of Qilu Hospital of Shandong University og Linyi Folkets Hospital. Alle patienter underskrevet skriftligt informeret samtykke før deres indskrivning. I alt 106 drift patienter med patologisk bekræftet primær blære overgangsordning celle karcinom blev rekrutteret mellem januar 2004 og august 2009 fra Qilu Hospital i Shandong University (n = 45) og Linyi Folkets Hospital (n = 61). Blandt disse patienter, 31 patienter gennemgik transuretral resektion af blæren tumor og 75 patienter gennemgik radikal cystektomi. Ingen af ​​patienterne havde modtaget præoperativ terapi. Tilstødende normale blære væv blev opnået fra regioner uden for tumor-margin ( 5cm) hos patienter. Alle væv blev makro-dissekeret inden for 15 minutter efter kirurgisk resektion, bekræftet ved patologisk analyse af sekventielle frosne snit, og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Scenen og kvalitet af tumorerne blev evalueret i overensstemmelse med Union for International Cancer Control 2009 TNM-systemet [25] og 2004 WHO klassifikationssystem [26] hhv. Alle patienter blev fulgt op af klinik besøg hver 3. måned i de første 2 år, hver 6. måned i 2 år, og hvert år derefter. RFS og OS blev defineret som tidsintervallet mellem første kirurgisk resektion og dato for begivenhed eller sidste opfølgning.

RNA isolering, cDNA syntese og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra væv eller celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Mængden og kvaliteten af ​​RNA blev kontrolleret med BioPhotometer plus (Eppendorf AG, Hamburger, Tyskland). Til påvisning af PDRG1, blev cDNA syntetiseret ved anvendelse af en ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO, Osaka, Japan). For MIR-214, RNA revers transkriberet under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) og specifikke revers transkription primer (RiboBio, Guangzhou, Kina). Ekspressionsniveauerne af MIR-214 og PDRG1 blev kvantificeret ved hjælp af QRT-PCR under anvendelse Realtime PCR Master Mix kit (TOYOBO, Osaka, Japan) og ABI 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, USA) med snRNA U6 som deres endogene henvisning gen. PCR-reaktionen bestod af et indledende denatureringstrin (95 ° C i 60s), 48 cyklusser (95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C i 30 sek, 72 ° C for 45s) og smeltekurveanalyse. De 2

-ΔΔCT metode blev udført for at beregne den relative ekspression og ekspressionsniveauer af negative kontroller blev anvendt som kalibrator.

Modne miRNA eller siRNA transfektion

blære cancerceller blev dyrket ved 3 × 10

4 celler /brønd i plader med 96 brønde eller 1 × 10

5 celler /brønd i 24-brønds plader eller 5 × 10

5 celler /brønd i 6-brønds plader i vækstmedium uden antibiotika til ca. 24 timer, indtil nå 80% sammenløb og forbigående transficeret med miRNA efterligner (Ribobio, Guangzhou, Kina) eller siRNA (Ribobio, Guangzhou, Kina) ved hjælp af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. MIR-214 mimic og MIR-negativ kontrol (MIR-NC) mimic blev anvendt i gain-of-function eksperimenter, hvorimod si-PDRG1 og si-negativ kontrol (si-NC) blev anvendt i tab-af-funktion eksperimenter . Til at sikre faktisk transfektion blev QRT-PCR udført for at detektere transfektionseffektiviteten i hvert eksperiment 24 timer senere. For proliferation, sårheling, migration, invasion og apoptoseassays blev celler høstet 24 timer efter transfektion. Til Western blot-assay blev cellerne opsamlet 48 timer efter transfektion.

Celleproliferationsassay

Ifølge producentens protokol, celleproliferationen blev detekteret ved 24, 48, 72 og 96 timer efter transfektion ved brug af WST-8 farvning med Cell Counting Kit-8 (Byotime, Haimen, Kina).

Apoptose assay

blærekræft celler blev høstet, vasket i koldt PBS, resuspenderes, dobbelt farves med FITC-Annexin V /propidiumiodid Apoptose Detection Kit (BestBio, Shanghai, Kina) i overensstemmelse med producentens anbefalinger og straks analyseret ved en flowcytometri (BD FACSCanto II, BD Biosciences, San Jose, USA).

sår -healing assay Salg

celler blev udpladet i 6-brønds skåle med serumholdigt medium indtil subkonfluens og sultes for serum i 24 timer, derefter cellemonolaget blev ridset hen over midten af ​​pladerne efter at cellerne havde nået konfluens ved anvendelse en P-20 mikropipettespids [27]. Den oprindelige hul længde (0 timer) og residualt længde på forskellige tidspunkter (6, 12 og 24 timer) efter sårede blev fotograferet (200 ×) og beregnet under IX71 omvendt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

In vitro

migration og invasion analyser

Blære kræftceller i serum-frit medium blev placeret i det øverste kammer af indsatsen med 8 mm porer i 24-brønds vævsdyrkningsplader (Corning Costar, NY, USA) med eller uden matrigel (BD Bioscience, Bedfold, MA, USA). Modificeret RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS i det nedre kammer tjente som kemoattraktant. Efter 24 timers inkubation blev celler klæber til nedre membran vasket, fikseret og farvet med 0,1% krystalviolet og 20% ​​methanol, afbildes (400 ×) og talt under anvendelse IX71 omvendt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Dual-luciferase reporter assay

The pmiR-RAPPORT vektorer (RiboBio, Guangzhou, Kina) blev konstrueret med vildtype (WT) -PDRG1 sekvenser eller mutant (Mut) -PDRG1 sekvenser indsat mellem hRluc og hLuc genet. Blære cancerceller i 96-brønds plader blev co-transficeret med MIR-NC /MIR-214 efterligner og WT- PDRG1 3′-UTR vektor /Mut PDRG1 3′-UTR vektor under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Aktiviteterne i Renilla og ildflue luciferaser i cellelysater blev målt ved hjælp af Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI) og kvotienten af ​​Renilla /ildflueluciferase aktiviteter (Rluc /Luc) blev betragtet som normaliserede data.

Western blot-

Lysis buffer (Beyotime, Haimen, Kina) blev anvendt til at ekstrahere total protein fra blære cancerceller og koncentration af protein blev bestemt med Enhanced BCA protein Assay Kit (Byotime, Haimen, Kina). Protein lysat blev separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membran. Efter at være blevet blokeret, blev membranerne inkuberet med anti-PDRG1 kanin mAb (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA, USA) eller anti-β-actin muse-mAb (1: 500; SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) natten over ved 4 ° C, derefter mærket med hest rødlig peroxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology). Specifikke komplekser blev visualiseret med chemiluminescens HRP substrat (Millipore, Little Chalfont, UK).

Target gen søge efter miR-214

For at identificere potentielle target gener af miR-214, tog vi fordel af en integreret bioinformatik analyse, starbase v 2.0 (https://starbase.sysu.edu.cn/targetSite.php), som i fællesskab kan bruge fem offentlige tilgængelige algoritmer (herunder Targetscan, picTar, PITA, RNA22 og Miranda).

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser og grafer blev udført ved hjælp af SPSS-version 17,0, GraphPad Prism-software og Microsoft excel. Signifikante forskelle mellem uafhængige grupper blev beregnet ved Wilcoxon Rank Sum, Kruskal-Wallis test eller t-test. Wilcoxon-testen blev anvendt til at sammenligne MIR-214-ekspression i parrede blærekræft væv og tilstødende normalt væv. RFS og OS kurver blev bestemt ved Kaplan-Meier-metoden og overlevelsesprocenten forskelle patienter i undergrupper blev evalueret ved log-rank test. Uafhængige prognostiske faktorer for overlevelse forudsigelse blev estimeret ved Cox regression multivariat analyse. Spearman rang korrelationsanalyse blev påført beregne forholdet mellem MIR-214 og PDRG1.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

miR-214 er ofte svækket i blærekræft, som er involveret i kræft progression

Vi har registreret udtrykket niveau af miR-214 i 106 par menneskelig blære kræft frosne væv og matchede tilstødende normale prøver ved QRT-PCR og opdagede, at miR-214 var signifikant underexpressed i blærekræft væv (

P

0,001) med median ekspressionsniveauet ti gange lavere end for de noncancerous enheder (median ekspression = 0,084 og 0,864, henholdsvis) (fig. 1A). Desuden 74% af blærekræft vævsprøver viste mere end to gange lavere MIR-214 niveau sammenlignet med matchede normale væv (Fig. 1B og 1C). Vi vurderede endvidere sammenhængen mellem miR-214-ekspression i blære kræft væv og clinicopathologic funktioner (tabel 1), og bemærkede, at den svækkede miR-214-ekspression var signifikant forbundet med højere tumor stadie (

P

0,001), højere lymfeknude status (

P

0,001), højere lønklasse (

P

0,001), multifocality (

P

= 0,003) og historie NMIBC (

P

= 0,033). Ikke desto mindre blev der ikke signifikant sammenhæng fundet mellem miR-214 udtryk og andre klinisk-patologiske karakteristika. Disse fund åbenbart, at MIR-214 kan spille en tumor-undertrykkende rolle i blærecancer og dets nedregulering blive indblandet i cancer progression.

(A) Ekspression niveau af MIR-214 blev bestemt ved hjælp af QRT-PCR og normaliseret mod U6 RNA, en endogen kontrol, i 106 par af humane blærecancer væv (BC) og matches tilgrænsende normale væv (NT). ***

P

0,001, blev Wilcoxon test, n = 106. (B) Den svækkede ekspression af MIR-214 findes i 74% (78 af 106) for blærekræft væv sammenlignet med tilstødende normale prøver. (C) Relativ udtryk for miR-214 blev præsenteret som log

2 gange ændring (BC /NT) og log

2 gange ændring blev defineret som følger: 1, underekspression; 1, overekspression; de resterende blev defineret som uændret. (D) Kaplan-Meier RFS og OS kurver baseret på miR-214 ekspressionsniveauer af patienter med blærekræft. Cut-off punkt var medianen miR-214 ekspressionsniveauet i blære kræft vævsprøver de. (E) Kaplan-Meier RFS og OS kurver baseret på MIR-214 ekspressionsniveauer af patienter med MIBC. Cut-off punkt var medianen miR-214 ekspressionsniveauet i MIBC vævsprøver.

miR-214 fungerer som en uafhængig prognostisk predicator for patienter med MIBC

Under opfølgningen, 54,7% (58 af 106) patienter med blærekræft oplevet tilbagefald og 5-års samlede overlevelsesrate var 61,3% (65 af 106). Den mediane opfølgning af RFS og OS var 57,5 ​​måneder (interval, 0.5-79 måneder) og 62 måneder (interval, 1-79 måneder) hhv. Kaplan-Meier overlevelse viste at blærekræft patienter med lav miR-214 udtryk undergik betydeligt kortere RFS (log-rank test = 26,207;

P

0,0001) og OS (log-rank test = 45,174;

P

. 0,0001) end dem med høj ekspression (fig 1D), mens multivariat Cox regressionsanalyse viste, at miR-214 var hverken uafhængig prognostisk variabel af RFS (

P

= 0,269) eller OS (

P

= 0,397) for patienter blærekræft.

Så vi spillede separat analyse for NMIBC og MIBC tumorer. I NMIBC gruppen, efter en median opfølgning på 59 måneder (interval, 42-79months), 54,8% af NMIBC patienter (17/31) præsenterede tilbagefald, men miR-214 hverken forudsagt RFS eller OS når dereguleret af Kaplan-Meier analyse. I MIBC gruppen, efter en median opfølgning på 32 måneder (interval, 0.5-76 måneder), var lokal eller metastatisk tilbagefald observeret for 54,7% af de 75 MIBC patienter (41/75), der alle døde. Det 5-års samlede overlevelsesrate var 45,3% (34 af 75), og den mediane opfølgning af OS var 35 måneder (interval, 1-76 måneder). Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at nedsat ekspression af miR-214 var signifikant associeret med dårligere prognose både RFS (log-rank test = 14,214;

P

= 0,0002) og OS (log-rank test = 13,797;

P

= 0,0002) (fig 1E).. Endvidere blandt de undersøgte i denne undersøgelse, alder forskellige klinisk-patologiske parametre, historie NMIBC, tumor stadium og lymfeknude-status var signifikant forbundet med udfaldet af MIBC på et signifikansniveau på 5% i univariat analyse. Multivariat Cox regressionsanalyse herunder alder, historie NMIBC, tumor stadie, lymfeknude status og miRNA-214 viste, at scenen, lymfeknude status og miRNA-214 var uafhængige prognostiske predicators af RFS og OS til MIBC (tabel 2).

sdddwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwz

miR-214 genindførelse undertrykker onkogenicitetsstudie

in vitro

først blev fundet udtryk for kønsmodne miR-214 til at være ned-signifikant reguleret i blære cancerceller sammenlignet med i SV-HUC-1 ved anvendelse af QRT-PCR (fig. 2A). For at undersøge den potentielle tumor undertrykkende rolle miR-214, så genindført vi miR-214 i blære cancer cellelinjer efterfulgt af funktionelle assays. Relativ MIR-214-ekspression i T24 og 5637 celler transficeret med MIR-214 mimic var 22319 og 10276 gange højere end transficeret med MIR-NC efterligner bekræftet ved hjælp af real-time PCR 24 timer efter transfektion (fig. 2B). Som angivet i fig. 2C, blev der observeret betydelige spredning hæmninger i miR-214-forbedrede celler sammenlignet med kontrol Cell Counting Kit-8 assay. Vi bemærkede også, at apoptotisk celle andel blev øget markant på miR-214 restaurering sammenlignet med miR-NC ved flowcytometri (fig. 2D), hvilket indikerer en proapoptotiske rolle miR-214 i reguleringen carcinogenese. Endvidere blære cancerceller overudtrykker MIR-214 udviste en signifikant reduktion i indvandringen evne i sammenligning med kontrollerne ved sårheling assay (fig. 3A) og transwell migration assay (fig. 3B). Som vist i fig. 3C, transwell invasion assay med matrigel belægning præsenterede at miR-214 reexpression også væsentligt forringet invasionen evne begge cellelinier. Det er bemærkelsesværdigt, at inkubationstiden for migration og invasion analyser var inden for 24 timer efter transfektion, hvorunder væksten af ​​blærekræft celler ikke blev ramt af miR-214. Så de inhibitoriske virkninger på cellemigration og invasion blev ikke forårsaget af nedgang i celleantal. Disse observationer viser, at miR-214 genindførelse undertrykker onkogenicitetsstudie af blærekræft celler

in vitro

.

(A) miR-214-ekspression signifikant nedreguleret i blære cancer cellelinjer end ved normal blære cellelinje (SV-HUC-1). (B) Relativ ekspression af MIR-214 efter miRNA mimic transfektioner som bestemt ved qRT- PCR. (C) Cell levedygtighed assay i mock /miR-NC /miR-214 transficerede blære cancerceller (statistisk analyse mellem miR-NC og miR-214: ***

P

0,001, t-test, n = 4). (D) Flowcytometri-analyse viste, at tvungne ekspression af MIR-214 fremmes signifikant apoptose. Fejlsøjler svarer til middel ± standardfejl på middelværdien (SEM). ***

P

0,001, t-test, n = 6.

(A) sårheling assay, (B) Transwell migration assay og (C) Transwell invasion assay i mock /miR-NC /miR-214 transficeret blære cancerceller. Fejlsøjler svarer til gennemsnit ± SEM. ***

P

0,001, t-test, n = 6.

Oncogene PDRG1 er en direkte downstream mål for miR-214

Siden miRNA normalt udøver sin rolle ved at hæmme ekspression af nedstrøms target gener , vi yderligere kiggede for målene i miR-214 at belyse den underliggende mekanisme af sine antitumorigenic effekter. Integreret bioinformatik analyse (Targetscan, picTar, PITA og Miranda) viser, at PDRG1 indeholder en potentiel gratis miR-214-bindingssted på sin 3′-UTR (fig. 4A). Eftersom vi først konstrueret pmiR-RAPPORT luciferase vektorer indeholdende vildtype eller mutant 3

‘- UTR af PDRG1 indsat mellem hRluc og hLuc genet, og derefter udført Dual-Luciferase reporter assay ved cotransfektion ovenfor vektorer med miR -214 efterligner eller miR-NC i blære cancerceller. Som vist i fig. 4B, miR-214 undertrykte signifikant den relative luciferaseaktivitet af reporteren indeholder vildtype 3’-UTR, men ikke mutant reporter, der betyder, at PDRG1 er en direkte downstream mål for miR-214 i blære cancerceller.

i overensstemmelse hermed blev der observeret deprimeret endogen ekspression af PDRG1 i både mRNA og protein niveauer i mIR-214 reexpressed blære cancerceller (fig. 4c og 4d). Desuden var der en omvendt korrelation mellem MIR-214 og PDRG1 ekspression i blærekræft væv (fig. 4E). Tilsammen vores resultater kraftigt kontrollere, at miR-214 negativt regulerer PDRG1 udtryk ved direkte binding til sine 3′-UTR gratis sekvenser.

(A) Skitse af de formodede miR-214 bindende sekvenser i PDRG1 3′ UTR og struktur af vildtype eller mutant PDRG1 pmiR-RAPPORT vektorer. Den mutant bindingssted var kursiv og understreget. (B) Dual-Luciferase aktivitet blev udført i blære cancerceller cotransficeret med miR-NC /miR-214 og pmiR-RAPPORT vektorer indeholdende WT PDRG1 3′-UTR /MUT-PDRG1 3′-UTR sekvenser. Data blev vist som normaliseret gange ændring i relativ luciferaseaktivitet (Rluc /Luc). Fejlsøjler svarer til gennemsnit ± SEM. ***

P

0,001, t-test, n = 6. (C) The PDRG1 mRNA blev nedreguleret i blære cancerceller transficeret med MIR-214 ved QRT-PCR. Fejlsøjler svarer til gennemsnit ± SEM. ***

P

0,001, t-test, n = 6. (D) Western-blot-resultater af endogen PDRG1 proteinekspression i blære cancerceller transficeret med MIR-NC /MIR-214 med β-actin som et loading kontrol. (E) Spearmans korrelation analyse viste en omvendt korrelation mellem miR-214 udtryk og PDRG1 mRNA-niveauer i blære kræft væv.

I forhold til matchede normale væv, blev PDRG1 signifikant overudtrykt i 81% af blære kræft væv påvist ved QRT-PCR (

P

0,001). Derudover har vi vurderet sammenhængen mellem PDRG1 ekspression i blærekræft væv og clinicopathologic parametre (tabel 1) og opdagede, at opreguleret PDRG1 udtryk var signifikant forbundet med højere tumor stadie, højere lymfeknude status, højere lønklasse og køn. Kaplan-Meier overlevelse kurve viste, at blære cancer patienter med høj PDRG1 udtryk lidt betydeligt kortere RFS (log-rank test = 6,578;

P

= 0,010) og OS (log-rank test = 8,990;

P

= 0,003) end dem med lav udtryk, mens multivariat Cox regressionsanalyse viste, at PDRG1 hverken var uafhængig prognostisk variabel af RFS (

P

= 0,457) eller OS (

P

= 0,145 ) for blærecancerpatienter. Udførelse separat Kaplan-Meier-analyser for NMIBC og MIBC tumorer, PDRG1 hverken forudsagt RFS eller OS når dysreguleret i begge grupper.

PDRG1 knockdown sammenfatter effekterne af miR-214 reexpression i blære cancerceller

med sigte på at undersøge, om miR-214 udøver sine antitumorigenic fungerer primært gennem PDRG1, vi behandlede blære cancerceller med PDRG1 siRNA efterfulgt af funktionelle assays. Knockdown virkning blev bekræftet ved RT-PCR og Western blot-analyse (fig. 5A og 5B). Lige som forventet, var betydelige spredning hæmninger observeret i si-PDRG1 transfekterede celler sammenlignet med kontrol (fig. 5C). Hvad mere er, blev apoptotiske celle fraktioner steget markant på PDRG1 knockdown i sammenligning med kontrol som observeret ved miR-214 genindførelse (fig. 5D). Såret healing assay og transwell migration assay begge viste, at si-PDRG1 signifikant reducerede migration evne blære cancerceller (fig. 6A og 6B). Mærkbart, transwell assay med matrigel belægning manifesteret at si- PDRG1 fremkaldte en inhiberende virkning på blæren cancercelleinvasion sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 6C). Frem for alt, PDRG1 knockdown gennem siRNA teknik efterlignede de effekt induceret af tvungen ekspression af miR-214, hvilket yderligere indikerer, at PDRG1 kan tjene som en downstream funktionel mægler for miR-214.

(A) Relativ udtryk for PDRG1 mRNA efter siRNA transfektioner som bestemt ved qRT- PCR. (B) Protein niveauer af PDRG1 blev vurderet ved Western blot i si-NC /Si PDRG1 blære cancerceller med β-actin som et loading kontrol. (C) Cellulær proliferation assay i blære cancerceller transficeret med mock /SI-NC /SI-PDRG1 (statistisk analyse mellem si-NC og si-PDRG1: ***

P

0,001, t-test , n = 4). (D) Flowcytometri-analyse indikerede, at PDRG1 knockdown fremmes signifikant apoptose. Fejlsøjler svarer til gennemsnit ± SEM. ***

P

0,001, t-test, n = 6.

(A) sårheling assay, (B) Transwell migration assay og (C) Transwell invasion assay i blære cancerceller transficeret med mock /SI-NC /SI-PDRG1. Fejlsøjler svarer til gennemsnit ± SEM. ***

P

0,001, t-test, n = 6.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, vi kontrollere for første gang en vital tumor suppressor, miR-214, der fungerer vigtigere i patogenesen af ​​blærekræft. MIR-214 var signifikant nedreguleret i tumorgene blære cancercellelinier sammenlignet med ikke-malign udødeliggjort blære epitelcellelinie. Dæmpning af miR-214-ekspression blev vurderet i ca. 74% af blære kræft væv og forbundet med højere tumor stadie, højere lymfeknude status, højere lønklasse, multifocality og historie NMIBC, hvilket tyder på, at miR-214 kan involveret i kræft progression. Vores data er i overensstemmelse med den af ​​flere undersøgelser som følger. For eksempel MIR-214 undertrykt vækst og invasivitet af cervikale cancerceller ved målretning af UDP-N-acetyl-α-D-galactosamin [20]. Nedsat miR-214 niveauer i brystkræftceller faldt sammen med øget celleproliferation, invasion og akkumulering af Polycomb EZH2 methyltransferase [21]. Nedregulering af MIR-214 bidrog til tumorangiogenese ved at inducere sekretion af hepatom vækstfaktor i human hepatoma [22]. MIR-214 reguleret forstærker af Zestes homolog 2 hæmmede migration og invasion i human esophageal pladecellecarcinom [28]. miRNA udtrykke profilering undersøgelser viste, at miR-214 blev nedreguleret i maligne blære vævsprøver og betydeligt differentielt udtrykt mellem NMIBC og MIBC [23, 24]. Alligevel MIR-214 tjener som onkogen var blevet fundet, opreguleret i andre humane cancere, såsom ovariecancer, mave, pancreas, hals-, lunge-, nasopharyngeale og mundslimhinden cancere og maligne melanomer [18, 19, 29-32]. Det er bemærkelsesværdigt, at funktionelle forskelle i miR-214 i forskellige typer af kræft kan skyldes dets forskellige målgener eller skelnen mellem vævstyper og cellulære omstændigheder. Det er blevet rapporteret, at miRNA kan afbrydes ved strukturelle genetiske ændringer (såsom genomisk deletion og inaktiverende mutationer), promotor-DNA-methylering og tab af histonacetylering [33, 34]. Desuden blev fundet mindst én kopi af miR-214 alleler, der skal slettes i 24% af primære brysttumorer [21]. I vores undersøgelse, svækket miR-214-ekspression som følge af genomisk tab eller andre mekanismer kombineret med øget PDRG1 niveau kan give nye prognostiske biomarkører for intervention af blærekræft.

I processen med at vurdere den prognostiske betydning af miR- 214, opdagede vi, at blærekræft patienter med lav mIR-214-ekspression havde en signifikant højere tilbagefald og kortere samlet overlevelse efter kirurgi og multivariat analyse identificeret mIR-214 som en uafhængig prognostisk faktor for RFS og OS hos patienter med MIBC. Vores resultater præsenteret, at miR-214 dysregulering kunne tjene som en ny prognostisk biomarkør for MIBC, ligesom det kan være prognosticator i menneskelig hepatoma [22].