PLoS ONE: Genome Wide Gene Expression Analysis i cancerceller afslører 3D Vækst at påvirke ECM og processer i forbindelse med Cell Adhesion men ikke DNA Repair

Abstrakt

Cell morfologi bestemmer celle adfærd, signaltransduktion, protein-protein interaktion, og lydhørhed over for eksterne stimuli. I kræft, disse funktioner dybt bidrage til resistensmekanismer at radio- og kemoterapi. Med hensyn til dette aspekt, denne undersøgelse sammenlignet genomet brede genekspression i eksponentielt voksende cellelinier fra forskellige tumor enheder, lungecarcinom og pladecellecarcinom, under mere fysiologiske tredimensionale (3D) versus monolag celledyrkningsbetingelser. Hele genomet cDNA microarray analyse udførtes under anvendelse af Affymetrix HG U133 Plus 2.0 genet chip. Betydning analyse af microarray (SAM) og t-test analyse afslørede signifikante ændringer i genekspression profiler af 3D forhold til 2D celledyrkningsforhold. Disse ændringer påvirkede den ekstracellulære matrix og blev hovedsageligt forbundet med biologiske processer som vævsudvikling, celleadhæsion, immunsystemet og forsvaret respons i modsætning til udtryk vedrørende DNA-reparation, som manglede væsentlige ændringer. Udvalgte gener blev verificeret ved semikvantitativ RT-PCR og Western blotting. Derudover viser vi, at 3D vækst medierer en betydelig stigning i tumorceller radio- og kemoresistens forhold til 2D. Vores resultater viser signifikante genekspression forskelle mellem 3D og 2D cellekultursystemer og viser, at cellulær respons på ekstern stress såsom ioniserende stråling og kemoterapeutika væsentlige påvirkes af differentiel ekspression af gener, der er involveret i reguleringen af ​​integrin signalering, celle form og celle-celle kontakt

Henvisning:. Zschenker O, Streichert T, Hehlgans S, Cordes N (2012) genom-Wide Gene Expression Analysis i cancerceller afslører 3D vækst at påvirke ECM og processer i forbindelse med Cell Adhesion men ikke DNA Repair. PLoS ONE 7 (4): e34279. doi: 10,1371 /journal.pone.0034279

Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: Juni 21, 2010; Accepteret: 27 februar 2012; Udgivet: 11 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Zschenker et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen og forfattere var delvist støttet af en bevilling fra Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning, Tyskland (BMBF Contract 03ZIK041 til NC) og af EFRE (den Europæiske Fond for Regionaludvikling) Europäische Fonds für regionale Entwicklung, Europa fördert Sachsen (100.066.308). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mikromiljø er en grundlæggende regulator af celle adfærd [1], [2], [3]. En stor mængde arbejde har vist, hvordan interaktioner af celler med den ekstracellulære matrix (ECM), som et af de centrale elementer i mikromiljø, bidrager til reguleringen af ​​kritiske cellefunktioner såsom celle form /arkitektur, overlevelse, proliferation og differentiering [2], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Celle-ECM interaktioner styrer også genekspression og kromatin organisation i en vækst- og ECM-afhængig måde [10], [11]. De seneste nye resultater viser, at især de vækstbetingelser spiller en afgørende rolle for den cellulære respons på eksterne stimuli. Dette blev tydeligt i tre-dimensionelle (3D) ex vivo cellekulturer dyrket i ECM og i kugleformede modeller [4], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17]. Vigtigere er, disse 3D cellekulturmodeller bedre efterligner en fysiologisk mikromiljø end konventionelle ucoatede eller ECM-præcoatede cellekultur plast [15], [18].

Udover anvendelsen af ​​3D cellekulturmodeller i vævsmanipulering [ ,,,0],19], [20], [21] og undersøgelser om fosterudvikling og fysiologi [18], 3D cellekulturer i stigende grad ansat i kræftforskningen [7], [8], [9], [12], [16], [22]. I langt de fleste tilfælde, tumorcellelinjer af forskellig oprindelse vise en forøget resistens mod radio- og kemoterapi i en 3D-miljø vejledende ved øget clonogenicity og nedsat apoptose [12], [13], [14], [16], [ ,,,0],17], [23], [24], [25], [26], [27]. Bortset fra en betydelig indvirkning på integrinpositive medieret celle-ECM-interaktioner [28], et komplekst samspil af biokemiske signalveje og biofysiske /mechanotransduction-relaterede faktorer menes at tillægge denne forbedrede tumorceller modstand, hvis underliggende mekanismer fortsat skal fastlægges både på gen og på proteinniveau [2].

med hensyn til genekspression, er blevet udført en stor indsats for at identificere specifikke diagnostiske, prognostiske og terapi-overvågning af genekspression mønstre i biopsier af forskellige menneskelige maligniteter [2], [5], [6], [29], [30], [31]. Interessant nok nogle af disse undersøgelser viste stærk overlapning mellem in vivo og 3D, men ikke 2D cellekultur datasæt, som endelig aktiverede identifikation af gen signaturer prædiktive for samlet overlevelse af cancerpatienter. Det er endnu ikke afklaret, om ændringer i genekspression under 3D versus 2D vækstbetingelser kan forklare eller give hints på bestemte stress eller DNA reparation involverede veje i det forbedrede radio- eller kemoresistens af 3D voksen tumorceller. Hvis ja, målrettet kunne optimeres terapeutiske fremgangsmåder mod centrale tumor initiativtagere.

For at løse dette spørgsmål, denne undersøgelse sammenlignet basal genekspression af to menneskelige kræftceller af forskellig oprindelse og med varierende genetiske baggrund i en 3D ECM stillads eller under konventionelle 2D monolag betingelser med hensyn til deres adfærd på stråling og kemoterapi.

Materialer og metoder

cellelinjer, dyrkningsbetingelser, og celle fordobling gange

Lunge tumorceller A549 blev opnået fra ATCC (Manassas, USA). Den pladecellekarcinom cellelinje UT-SCC15 var en slags gave fra R. Grenman (Turku University Central Hospital, Finland). Til konventionel 2D cellekultur, celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, PAA, Cölbe, Tyskland) indeholdende Glutamax-I (L-alanyl-L-glutamin) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, PAA) og 1 % ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, PAA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 7% CO

2. For 3D cellekultur blev celler udpladet i en blanding af 0,5 mg /ml laminin-rige ekstracellulære matrix (Matrigel; BD, Heidelberg, Tyskland) og komplet DMEM-medium på et lag af agarose (Sigma, Taufkirchen, Tyskland) i en 24- cellekulturplade skålen (BD) som offentliggjort [12], [13], [14], [16].

fordoblingstid på celler, der vokser som monolag i celle kultur flasker blev talt i overensstemmelse med standardprotokoller. Kort fortalt blev enkelte celler udpladet i 2D eller 3D og trypsiniseret og overført til 10 ml medium indeholdende FCS. Efter forsigtig blanding i medium, blev 10 pi af cellen opløsning pipetteret på et Neubauer-tællekammer under anvendelse af en passende fortynding. Celler i 4 kvadrater blev talt mikroskopisk (Zeiss, Jena, Tyskland), og antallet af celler blev beregnet som tidligere beskrevet [32]. For celler, der vokser i en 3D Matrigel miljø blev celler isoleret som beskrevet tidligere [23], [33] ved hjælp af en Neubauer tællekammer.

3D og 2D kolonidannende analyser

Klonogen overlevelse under 3D betingelser blev testet som tidligere offentliggjort [15], [16], [17], [34]. Kort fortalt blev enkelte celler udpladet i 0,5 mg /ml Matrigel suppleret med DMEM /10% FCS /1% NEAA. Efter 24 timer blev enkelte celler bestrålet (0-6 Gy) eller behandlet med stigende Cisplatin koncentrationer (0,1, 1, 5, 10 uM; i 24 timer; Neocorp). Cisplatin blev fjernet ved 3- (2D) eller 15-gange (3D) vask med DMEM /10% FCS /1% NEAA. Derefter blev cellerne lov til at vokse til kolonier /celleklynger. Ved 8 (A549) eller 11 dage (UT-SCC15) efter plating, dyrkede kolonier /celleklynger ( 50 celler) blev mikroskopisk optalt. 2D celleoverlevelse blev opnået som offentliggjort [23]. Efter 8 dage (A549) eller 11 dage (UT-SCC15) blev celler farvet med Coomassie blue (Merck, Darmstadt, Tyskland) og kolonier ( 50 celler) blev talt. Plating effektivitet blev beregnet således: antal dannede kolonier /antal celler forgyldt. Overlevende fraktioner blev beregnet således: antal dannede kolonier /(antal celler belagt (bestrålet /Cisplatin) × plating effektivitet (ubestrålet /ubehandlet)). Hvert punkt på overlevelseskurverne repræsenterer middelværdien overlevende fraktion fra tre uafhængige forsøg.

Bestråling af cellekulturer Salg

Bestråling blev leveret ved stuetemperatur ved anvendelse enkeltdoser (0-6 Gy) af 200 kV X stråler (YXLON Y.TU 320, YXLON, København, Danmark) filtreret med 0,5 mm kobber. Dosis-rate var ca. 1,3 Gy /min ved 20 mA. Den absorberede dosis blev vurderet ved anvendelse af en Duplex dosimeter (PTW, Freiburg, Tyskland).

cDNA microarray

Genekspressionsprofil blev målt med RNA ekstraheret fra 5 x 10

6 celler dyrket i 3D eller 2D. Total RNA blev fremstillet under anvendelse NucleoSpin RNA II kit ifølge producentens instruktioner (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland). Procedurer for cDNA-syntese, mærkning og hybridisering blev udført ifølge producentens protokol (Affymetrix) og som offentliggjort [35]. Alle eksperimenter blev udført under anvendelse af Affymetrix humane genom gen chip HG U133 Plus 2.0. Første streng cDNA-syntese med 90 ng af total RNA, syntese af biotin-mærket cRNA og rydde op blev udført under anvendelse af 3 ‘IVT Express Kit (Affymetrix). For hybridisering blev 15 ug fragmenteret cRNA inkuberet med chippen i 200 pi hybridiseringsopløsning i hybridiseringsovn 640 (Affymetrix) ved 45 ° C i 16 timer. GeneChips blev derefter vasket og farvet med Affymetrix Fluidik Station 450 i henhold til den GeneChip Expression Wash, Bejdse og Scan Manuel bruge GeneChip Hybridisering, Vask og Stain Kit (Affymetrix). Mikroarrays blev scannet med Affymetrix GeneChip Scanner 7G, og signalerne blev forarbejdet ved anvendelse af GCOS (V.1.4, Affymetrix). At sammenligne prøver og eksperimenter RMA-algoritmen blev anvendt (Expression Console, V.1.1), blev yderligere analyse med TIGR MeV (v.4.6.2). Tre replikater blev anvendt til microarray analyse og statistik. For SAM analyse blev en Signal Log Ratio på 0,8 (-0,8), der anvendes som en tærskel, der er lig med en fold ændring på 1,6 og -1,6 hhv. Genekspression data er tilgængelige på GEO tiltrædelse No. GSE17347. For gen liste, funktionel berigelse vi brugte ToppGeneSuite [36]. Veje og andre funktionelle grupperinger af gener blev evalueret for differentieret regulering ved hjælp af visualisering værktøj GenMAPP (Ver. 2.1), som beskrevet tidligere [37].

SAM kræver input fra en “delta” værdi. Den “delta” definerer grænsen for antallet af falsk positive gener i validerede datasæt. For at identificere en liste over potentielt betydelige gener, vi beregnet den falske opdagelse sats (FDR). Den anslåede FDR (median antal falsk signifikante gener) for hver given “delta” ( “delta” værdi) blev bestemt ifølge Tusher et al. [38].

Semi-kvantitativ RT-PCR

For at validere microarray data ved PCR, total RNA isoleres til genekspression profilering blev brugt. cDNA blev forberedt med SuperScript ™ III revers transkriptase-kit i henhold til producentens anvisninger (Invitrogen, Karslruhe, Tyskland). Kort beskrevet cDNA blev syntetiseret i en 20 pi volumen indeholdende 1 ug DNase-behandlede total RNA, 1 pi oligo (dt)

20 (50 uM) og 1 pi 10 mM dNTP Mix, 4 pi 5 × Første streng buffer, 1 pi 0,1 M DTT, 1 pi RNase OUT, og 1 pi Superscript III (200 U /pl). RNA, dNTP’er og oligo (dt) primer blandedes først, opvarmet til 65 ° C i 5 min, og anbragt på is, indtil tilsætning af de resterende reaktionskomponenterne. Derefter blev reaktionsblandingen inkuberet ved 55 ° C i 45 minutter og afsluttet ved varmeinaktivering ved 70 ° C i 15 minutter. En identisk reaktion uden revers transkriptase blev udført for at verificere fraværet af genomisk DNA. Semikvantitative RT-PCR blev udført for generne TXNIP, DUSP6, CEACAM1, NPC1 og BCL2A1 anvendelse af primere, der er opført i tabel 1 (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Tyskland), 2 pi cDNA og Hotstar Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Tyskland ) ifølge standard PCR-protokoller. Forward primere for alle gener blev udvalgt ved at søge den oprindelige oligonukleotidsekvens af det tilsvarende gen identifikationsnummeret på det Affymetrix genet chip på Affymetrix hjemmeside (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). De reverse primere blev udformet baseret på gensekvensen tilvejebragt på Affymetrix webside. Annealing temperaturer på 50 ° C blev anvendt til TXNIP, DUSP6 og BCL2A1 eller 55 ° C i CEACAM1 og NPC1. Til normalisering, blev et β-actin-fragment på 540 bp amplificeret samtidigt under anvendelse af primere der er anført i tabel 1 [39]. Resultaterne af tre uafhængige forsøg blev analyseret ved hjælp af 1% agarose (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) geler og densitometrisk analyse med Image J® software (National Institutes of Health, Bethesda, USA) efter farvning geler med ethidiumbromid (Carl Roth).

totalt protein ekstrakter og vestlige blotting

i alt protein ekstrakter fra 4-dages 3D og 2D cellekulturer blev isoleret som beskrevet tidligere [13]. Kort fortalt blev celler behandlet med modificeret RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI (Carl Roth), pH = 7,4), 1% Nonidet-P40 (Sigma), 0,25% natriumdeoxycholat (AppliChem, Darmstadt, Tyskland), 150 mM NaCl (VWR International, Darmstadt, Tyskland), 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (Merck), komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche, Mannheim, Tyskland), 1 mM Navo

4 (AppliChem), 2 mM NaF (AppliChem)). Prøver blev opbevaret ved -80 ° C. Samlede proteinmængde blev målt under anvendelse af bicinchoninsyre-assay (Pierce, Bonn, Tyskland). Efter natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese og overførsel af proteiner på nitrocellulosemembraner (Schleicher Schull, Dassel, Tyskland), blev påvist proteiner med følgende antistoffer: anti-fibronectin (BD, Heidelberg, Tyskland), anti-CTGF, anti- ErbB3 (Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland), anti-BCL2A1 (LifeSpan Biosciences, Seattle, USA) og anti-β-actin (Sigma); peberrodsperoxidasekonjugeret æsel-anti-kanin, æsel-anti-gede og fåre-anti-muse (Amersham, Freiburg, Tyskland) sekundære antistoffer. SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrat (Pierce, Bonn, Tyskland) og Amersham Hyperfilm ECL (GE, München, Tyskland) blev anvendt til detektion. Densitometri blev udført under anvendelse Billede J® software. Der er udført tre uafhængige forsøg.

Resultater

3D og 2D-celle vækst egenskaber og celle overlevelse efter radio- eller kemoterapi

Cell form og morfologi var forskellige mellem 3D og 2D celle vækstbetingelser (fig. 1a). Fire dage efter udpladning blev cellerne eksponentielt voksende med lignende fordoblingstider (fig. 1B). Denne lighed i celle fordoblingstider billede sammenlignelige forsøgsbetingelser for hele genomet genekspression analyse. Vigtigere, blev tidligere forsøg evaluerer overlevelse A549 og UT-SCC15 celler stråling gentaget således danner grundlaget for den præsenterede undersøgelse link vækst-afhængige radio- og kemoresistens med vækst-afhængige genekspression modifikation [11]. Under 3D-betingelser, viste begge cellelinier signifikant højere klonogene overlevelse efter udsættelse for stigende enkeltdoser af røntgenstråler eller stigende koncentrationer af cisplatin sammenlignet med 2D (fig. 1C og D). Disse data tyder på en sammenhæng mellem vækstbetingelser og cellemorfologi og cellulære radio- og kemoresistens.

(A) Repræsentative billeder og skematiske af 2D (

jeg

,

iii

) og 3D (

ii, iv

) cellevækst som findes på dag 4 umiddelbart før RNA isolation. Barer, 50 uM. (B) Fordobling tider med 2D og 3D cellekulturer på dag 4 efter plating. Resultater viser middel ± SD (n = 3). N. S., ikke signifikant. Klonogen overlevelse 2D eller 3D dyrkes cellerne eksponeret for stigende X-ray doser (2, 4 eller 6 Gy) (C) eller Cisplatin koncentrationer (0,1, 1, 5, 10 uM) (D) anvendt 24 timer efter udpladning. Cisplatin blev fjernet efter 24 timer efter 3- (2D) eller 15 gange (3D) vask med DMEM /10% FCS /1% NEAA. Resultater viser middel ± SD (n = 3; t-test). * P 0,05; ** P 0,01. CDDP, Cisplatin. Bar, 200 um.

Hele genom genekspression analyse af A549 og UT-SCC15 dyrket i 3D eller 2D

Denne genom bred genekspression analyse blev udført under ubehandlede forhold og har til formål at identificere specifikke genekspressionsmønstre af enkelte gener eller funktionelt tilknyttede gen grupper, der kan være knyttet til tumorceller radio- og kemoresistens. Fra gen profilering, hierarkisk klyngedannelse og statistisk analyse ved hjælp af SAM, det var tydeligt, at vækstbetingelser påvirker genekspression mønstre (Fig. 2A og B). Den estimerede falske opdagelse sats (FDR) var 0 ned til den indstillede “delta” ( “delta” = 2,873 i A549; “delta” = 2,445 i UTSCC15). Et højere antal gener blev differentielt udtrykt i A549 (376 transkripter) end i UT-SCC15 (178 transkripter) celler (fig 2A, tabel 2. Tabel S1 og S2). I 3D viste A549 og UT-SCC15 celler flere gener opregulerede end nedreguleres sammenlignet med 2D (fig. 2A og B).

(A) Hierarkiske klynger af gener af 2D og 3D cellekulturer på dag 4 efter plating. Rød indikerer gener udtrykt over gennemsnittet; grøn indikerer gener udtrykt under gennemsnittet og sort angiver gennemsnitlig udtryk efter betydning Analyse af microarrays (SAM). “Positive” angiver gener opreguleret i 3D versus 2D. “Negative” angiver gener nedreguleret i 3D versus 2D. (B) Plot af antal udskrifter mod signal log nøgletal fra 3D versus 2D cellekulturer af A549 og UT-SCC15 celler. (C) Gene Ontology-afhængig plotning af absolutte tal og i procent af betydeligt modificerede gener i 3D versus 2D cellekulturer ifølge SAM-analyse.

Ifølge SAM, A549 celler havde 242 udskrifter op – og 134 nedreguleret mens UT-SCC15 celler havde 125 udskrifter op- og 53 udskrifter ned-reguleret (figur 2A og B, tabel S1 og S2.). Intriguingly viste disse to forskellige cellelinier, en overlapning af cellulære komponenter og biologiske funktioner at blive påvirket under 3D vækstbetingelser med hensyn til gen-ontologi (fig. 2C, tabel S3 og S4). UT-SCC15 celler generelt viste mindre gener modificeret af 3D vækst sammenlignet med A549-celler (fig. 2A, tabel S2). Fra en én-til-én-genekspression sammenligning, blev det klart, at ændringerne forekommer i forskellige gener i de samme grupper af cellulære bestanddele eller biologiske funktioner i en cellelinje-afhængig måde. Oven på SAM, udførtes t-test analyse, hvor 856 gener blev opreguleret og 721 nedreguleres i 3D A549 cellekultur forhold til 2D (at bemærke: SLR tærskel +/- 0,8). I UT-SCC15 celler blev 429 gener opreguleres og 277 nedreguleres i 3D sammenlignet med 2D. Overlappet af differentielt udtrykte gener upon SAM og t-test for 3D-til-2D sammenligning afslørede 238 udskrifter opreguleret og 128 udskrifter nedreguleret i A549 celler og 119 udskrifter up-reguleret og 52 udskrifter nedreguleret i UT- SCC15 celler (tabel S5 og S6) .Disse resultater viser, at processer, der er forbundet med celleadhæsion, biologiske vedhæftning, immunsystemet reaktioner, forsvar reaktioner, væv udvikling og reaktion på organisk stof overvejende reguleret via differential genekspression når celler overføres fra en 2D til et 3D matrix-baserede mikromiljø. Uden markante udtryk ændringer af gener involveret i DNA-reparation, kan det spekuleret, at radio- og kemoresistens af 3D dyrkes celler resulterer fra særdeleshed endnu ikke identificeret, ændringer i celle arkitektur og herved inducerede modifikationer af den cellulære interactome i form af signaltransduktion og protein protein interaktioner.

validering af microarray data ved PCR og Western Blotting

for validering microarray data, blev udvalgte gener og proteiner undersøgt ved hjælp af semi-kvantitativ RT-PCR (thioredoxin interagerende protein (TXNIP) , dobbelt specificitet fosfatase 6 (DUSP6), carcinoembryonisk antigen-relateret celleadhæsionsmolekyle 1 (CEACAM1), Niemann-Picks sygdom, type C1 (NPC1) og BCL2-relateret protein A1 (BCL2A1)) og Western Blotting (Fibronectin (FN1), bindevæv vækstfaktor (CTGF), v-erb-b2 erythroblastic leukæmi viral onkogen homolog 3 (ErbB3) og BCL2A1), hhv.

signal log forhold mellem udvalgte gener fra 3D eller 2D cellekulturer vises i Figur 3. TXNIP og DUSP6 tilstedeværende gener i stigende grad udtrykt i begge cellelinier, når de dyrkes i 3D forhold til 2D (fig. 3). CEACAM1 induktion og NCP1 og BCL2A1 undertrykkelse blev kun observeret i 3D A549 cellekulturer (Fig. 3). Semikvantitative RT-PCR på RNA-prøver, der anvendes til microarray analyse bekræftede induceret TXNIP ekspression i 3D, mens forøget DUSP6 ekspression kun kunne bekræftes i UT-SCC15-celler (fig. 4A og B). Forbedrede CEACAM1 mRNA-niveauer var påviselige i både 3D A549 og 3D UT-SCC15 cellekulturer, som var bekræftende for A549 og borderline for UT-SCC15-celler med hensyn til DNA microarray data (fig. 4A og B). De gener NPC1 og BCL2A1 viste reduceres eller stabilt niveau i genomet brede analyse A549 eller UT-SCC15 celler, henholdsvis; resultater fuldt bekræftet ved semikvantitativ RT-PCR (fig. 4A og B).

Ekspression af generne TXNIP1, DUSP6, CEACAM1, NPC1 og BCL2A1 afgrænses forholdsvis fra 3D versus 2D cellekulturer af A549 og UT -SCC15 celler.

(A) Semi-kvantitativ RT-PCR blev udført som beskrevet under materialer og metoder. Vist er 1% agarose geler med RT-PCR-fragmenter af TXNIP, DUSP6, CEACAM1, NPC1 og BCL2A1 mRNA isoleret fra A549 eller UT-SCC15 celler. Prøver blev amplificeret fra cDNA genereret ved revers transkription af totalt RNA af 4-dag gamle 3D og 2D cellekulturer. Alle eksperimenter (V1, V2, V3) er udstillet. p-actin-ekspression tjente som ladningskontrol (540 bp). (B) Grafer vise resultater fra densitometrisk analyse af angivne mRNA-ekspression efter normalisering til p-actin. Resultater viser middel ± SD (n = 3).

Dernæst et andet sæt gener (FN1, CTGF, ErbB3, BCL2A1) blev kontrolleret på proteinniveauet ved Western blotting. De signal log forhold af disse gener, der genereres af mikromatrice var: FN1 = 1,6 /N.C.. (A549 /UT-SCC15); CTGF = 1,2 /-3,8 (A549 /UT-SCC15); ErbB3 = 2,2 /N.C.. (A549 /UT-SCC15); BCL2A1 = -3,8 /N.C.. (A549 /UT-SCC15) (fig. 5A, tabel S1 og S2). I 3D-A549 cellekulturer, proteinekspression analyse bekræftede mikromatrice-baserede opregulering af fibronectin, CTGF og ErbB3 samt nedregulering af BCL2A1 (fig. 5B og C). 3D UT-SCC 15 cellekulturer udviste ingen ændringer af de undersøgte proteiner, herunder CTGF, der viste stærk undertrykkelse ifølge vores microarray-baseret analyse (fig. 5B og C). I de fleste tilfælde viste disse data lignende resultater mellem hele genomet bred genekspression analyse under anvendelse mikroarrayformat og RT-PCR eller Western blotting.

(A) Signal log forhold af udvalgte gener (FN1, CTGF, ErbB3 og BCL2A1 ) fra DNA microarray-baseret analyse underkastet Western blot analyse. (B) Helcellelysater blev fremstillet af 3D og 2D cellekulturer på dag 4 efter plating. SDS-PAGE og Western blot-analyse blev udført som beskrevet under Materialer og metoder. Repræsentative billeder viser ekspression af fibronektin (240 kDa), CTGF (38 kDa), ErbB3 (180 kDa) og BCL2A1 (20 kDa). β-actin tjente som ladningskontrol. (C) Densitometriske enheder af protein bands vist i ‘B’ er plottet ved normalisering til p-actin.

Diskussion

Tab af funktionelle og fænotypiske egenskaber opstår, når celler dyrkes ex vivo i en 2D mikromiljø [1], [4], [18], [20]. Dette kan forhindres ved at dyrke celler i fysiologiske 3D ECM scaffolds vist for forskellige endepunkter såsom protein ekspression, morfologi, og forudsigelse af gen signaturer til kliniske resultater [2], [5], [6], [29], [30] . I betragtning af disse punkter, vi fokuseret på de mekanismer, modulerende tumor celle følsomhed over for radio- og kemoterapi. For at vurdere virkningen af ​​basale genekspressionsprofiler på mere fysiologiske 3D versus de kunstige 2D cellekultur modeller, blev denne undersøgelse udført på humane epiteliale kræftceller stammer fra to af de hyppigste kræftformer i verden, dvs. lunge (A549) og hoved og hals pladecellecarcinom (UT-SCC15) [40]. Valgt fra forskellige cellelinje testet i vores laboratorium modeller, disse to cancer cellelinjer varierer i deres oprindelse og genetiske baggrund og er gode eksempler, der viser de prosurvival effekter af vækst i en 3D ECM stillads i forhold til konventionelt anvendt kultur plast [11], [ ,,,0],12], [13], [14]. Vi viser signifikante ændringer i genekspression profiler af 3D versus 2D cellekulturer. Mens gener involveret i DNA-reparation veje forblev uændret, blev størstedelen af ​​ændrede gener i begge cellelinier forbundet med biologiske funktioner som vævsudvikling, celleadhæsion og forsvar respons. Validering af microarray data blev udført på udvalgte gener på mRNA og protein niveau.

3D cellekulturer i stigende grad ansat i kræftforskning samt tissue engineering, udviklingsmæssige og cellebiologi. For udvikling terapi, celle reaktionsevne er det centrale spørgsmål og dramatisk anderledes i en 3D fysiologisk miljø i forhold til petriskål betingelser. Med hensyn til klonogen celleoverlevelse efter eksponering for røntgenstråler eller almindeligt anvendt kemoterapeutisk lægemiddel Cisplatin, både A549 og UT-SCC15 celler udviser øget overlevelsesrater i 3D forhold til 2D. Da disse er kun to eksempler ud af flere [12], [13], [14], [15], [23], [24], de paradigmer “celleadhæsion medieret radioresistance” og “celleadhæsion medieret lægemiddel resistens” hovedsageligt undersøgt i konventionelle ECM-belagt cellekultur retter har til at blive revurderet ved at tage alvorlige modifikationer i fx signaltransduktion, DNA reparationsprocesser, etc i betragtning, når cellerne vokser i 3D. Vigtigt er det, kan forskelle i parametre som hypoxi, spredning og strålingsdosimetri der er velkendte som væsentlige determinanter for cellulære radiosensitivitet udelukkes i en tidligere dybdegående sammenlignende analyse mellem 3D og 2D celle dyrkningsbetingelser [11]. Således 3D ECM-baserede cellekultur model, der anvendes her er en rimelig og gennemførlig metode til undersøgelser af tumor celle radio- og kemosensitivitet og de underliggende mekanismer.

På trods af vores viden om alvorlige ændringer af genekspression mønstre ved at adskille celler fra væv til ex vivo 2D cellekulturer [1], [41], [42], disse resultater har været meget forsømt. I 2D, blev både antallet af differentielt udtrykte gener og genet ekspressionsniveauer i cellelinier fra tumor og normale væv formindskes med op til 70% og havde et udsving område på ca. 1,5-gange sammenlignet med vævene oprindelse, henholdsvis [43 ], [44]. Sammenligning vores microarray analyse med andres arbejde, fandt vi lignende genekspression profiler. For eksempel har både A549 og UT-SCC15 udviste karakteristiske basale mønstre af gener, der koder for proteiner med funktioner i modulationen af ​​ECM som laminin, fibronectin, collagen, en konstatering ligeledes observeret i en basal genekspression analyse af 60 cancercellelinier og deres svarende cancervæv og i en undersøgelse udført på melanom [30], [42]. Disse data understøtter endvidere vores opfattelse, at 3D-cellekulturer er mere fysiologiske og væv-lignende end 2D. Trods lignende vækstrater på vores testede humane tumorcellelinier, cellulær differentiering processer i forbindelse med ændringer i f.eks ECM-proteiner kunne udpræget indflydelse reaktionsevne tumorceller til forskellige behandlingsformer.

Af største betydning for os var den konklusion, at 3D-cellekulturer differentielt udtrykkelige gener involveret i “ekstracellulære matrix” og “celleadhæsion” samt ‘forsvar svar’, men ikke i “DNA-reparation. Som modulering af gener involveret i regulering af cellestørrelse og adhæsion er ikke overraskende, når celler overføres fra monolag til et 3D-miljø, disse resultater tyder på, at niveauet af ekspression af særlige gener associeret med DNA-reparation ikke nødvendigvis er funktionelt knyttet til en observeret celle adfærd. I vores tilfælde, bestrålede eller Cisplatin-behandlede A549 og UT-SCC15 viste en højere klonogen overlevelse under 3D vækstbetingelser sammenlignet med 2D; imidlertid en tilsvarende stigning i ekspressionen af ​​f.eks DNA reparation gener, såsom PRKDC (protein kinase, DNA-aktiveret, katalytisk polypeptid), ATM (ataxia telangiectasia muteret) eller MDC1 (mediator af DNA-beskadigelse checkpoint 1) var til stede. Endegyldigt og i modsætning til at studere vurdere forudsigelse af strålebehandling og kemoterapi reaktionsevne kan det spekuleret på, at den afgørende faktor for denne forbedrede overlevelse sandsynligvis er proteinet interactome og ikke transkriptomet. Om overførsel af data fra bench-til-bedside til terapi, skal det understreges, at data, der genereres i tumorprøver med konserverede fænotyper, herunder genekspressionsprofiler, vil sandsynligvis være mere relevant end 2D data og kan anvendes til at identificere essentielle signalsystemer hubs til target terapi.

sammenfattende de præsenterede data viser tydeligt, at vækstbetingelser har dybtgående indvirkning på genekspression. Da 3D cellekulturer afspejler fysiologiske vækstbetingelser og giver terapi modstand mod kræftceller, disse resultater tyder på, at, på transkriptomet niveau, celle form og celle-celle kontakt er to af de vigtigste determinanter for cellulær lydhørhed over for ekstern stress. Dette begreb kan formeres til en mere realistisk, højere kompleksitet, hvor strukturelle og kommunikative ændringer i proteom tilføje betydelige stikord til regulering af cellulære adfærd, især terapi modstand. Fremtidige studier i optimerede cellekultur modeller som 3D ECM modellen berettiget til at løse de transkriptom og proteom mekanismer tumor cellebiologi, kræftbehandling lydhørhed og evaluering af nye potentielle cancer targets.

Støtte Information

Tabel S1.

genekspressionsanalyse i 3D versus 2D A549 cellekulturer.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034279.s001

(DOC)

tabel S2.

genekspressionsanalyse i 3D versus 2D UT-SCC15 cellekulturer.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034279.s002

(DOC)

tabel S3.

Gene ontologi Analysis, Cellular Component. Overlappet er markeret i kursiv /fed skrift.