PLoS ONE: En metaanalyse af MicroRNA Expression i Liver Cancer

Abstrakt

MicroRNA (miRNA) spillede en vigtig rolle i udviklingen af ​​leverkræft og dens diagnostiske og prognostiske værdier er ofte undersøgt. Men forskellige microarray teknikker og lille stikprøve førte til inkonsistente fund i tidligere undersøgelser,. Vi udførte en omfattende meta-analyse af i alt 357 tumor og 283 noncancerous prøver fra 12 publicerede miRNA udtryk undersøgelser med anvendelse af robust rang sammenlægning metode. Som følge heraf identificerede vi en statistisk signifikant meta-underskrift fem opreguleret (MIR-221, MIR-222, MIR-93, MIR-21 og MIR-224) og fire nedreguleret (MIR-130a, MIR-195, miR- 199a og MIR-375) miRNA. Vi derefter udført miRNA mål forudsigelse og gangsti berigelse analyse for at finde det biologiske proces disse miRNA kan påvirke. Vi fandt, at de fleste af de veje blev ofte forbundet med cellesignalering og kræft patogenese. disse miRNA kan således inddrage i opståen og udvikling af leverkræft og tjene som potentielle diagnostiske og terapeutiske mål for denne malignitet

Henvisning:. Yang J, Han S, Huang W, Chen T, Liu Y, Pan S et al. (2014) En metaanalyse af MicroRNA Expression i leverkræft. PLoS ONE 9 (12): e114533. doi: 10,1371 /journal.pone.0114533

Redaktør: Isabelle A. Chemin, CrCL-INSERM, Frankrig

Modtaget: Juli 3, 2014 Accepteret: November 10, 2014; Udgivet: 9. december 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Research Project i Guangxi Læreanstalter og universiteter (201203YB035) og Guangxi Key Project for Videnskab og Teknologi (1355005-4-8). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Leverkræft hos mænd er den næsthyppigste årsag til kræft død og er den sjette hyppigste årsag til kræft død hos kvinder, som forårsager ca. 700 tusind dødsfald om året med omkring 750 tusinde nye diagnosticerede tilfælde på verdensplan. [1] Low overlevelse tilskrives sen diagnose, modstandsdygtighed over for kemoterapi, tumor tilbagefald, og metastase, dermed at understrege behovet for hidtil ukendte diagnostik og terapeutiske midler. Talrige genekspression undersøgelser har vist, at en generel afvigende aktivering af signalveje blev tilskrevet den onkogenicitetsstudie imidlertid én signatur eller et enkelt fremtrædende karakteristisk pathway kunne ikke defineres i leverkræft. [2] Salg

MikroRNA’er (miRNA), små ikke-kodende RNA af 18-25 nukleotider i længden, og som blev set til at styre genekspression i næsten alle cancerceller, blev rigeligt undersøgt vedrørende forekomst, udvikling, klassificering, diagnosticering og behandling af tumorer nylig. Inddragelsen af ​​miRNA i kræft patogenese er veletableret, da de kan opføre sig som onkogener eller tumorsuppressorgener afhængigt af cellulære funktion af deres mål. [3] Forståelse biologi miRNA og dens bidrag til udviklingen af ​​kræft, kan løfte tidlig diagnose og effektiv kontrol af maligne tumorer.

De seneste resultater fra integrative og mekanisme-baserede profilering undersøgelser har givet vigtige oplysninger om de roller, miRNA i normale celler og sygdomstilstanden. Disse undersøgelser kunne forbedre vores forståelse af de molekylære mekanismer i kroniske leversygdomme og leverkræft. Talrige undersøgelser linker til dereguleringen af ​​miRNA udtryk for leverkræft er rapporteret med mangeartede metoder. [4] Men på grund af anvendelsen af ​​forskellige teknologiske platforme og lille stikprøve størrelse, miRNA udtryk profilering indsats har ført til forskellige resultater mellem undersøgelserne.

For at overvinde begrænsningerne i de nuværende undersøgelser, vi udførte en meta -analyse anvende den robuste rang sammenlægning metode, [5] efterfulgt af sti-analyse, at identificere miRNA deregulering i leverkræft, og de veje, at centrale miRNA kan påvirke. Orloven-én-out krydsvalidering metode blev anvendt til at validere resultaterne. Identifikation af miRNA meta-signatur og invovled veje ville give potentielle mål for yderligere eksperimentelle undersøgelser af udviklingen leverkræft.

Materiale og Metode

Study udvælgelse og dataudtræk

En systematisk litteratursøgning blev udført til identifikation af leverkræft miRNA udtryk profilering undersøgelser ved hjælp af en to-niveau søgestrategi. Først, vi foretog en søgning webbaseret i Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm.-nih.gov/geo/) ved hjælp af søgeord (( “Neoplasmer” [Mesh] OG “Lever” [Mesh]) OG “MikroRNA’er” [Mesh]) og “mennesker” [Mesh]. For at udføre en omfattende hentning, søgning i ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress), blev den Pubmed og Embase databasen også udført. For det andet blev de referencelister af alle relevante og eksisterende undersøgelser revideret gennem en manuel søgning til yderligere identifikation af potentielle relevante undersøgelser.

Abstracts blev screenet omhyggeligt og fulde ordlyd af relevante potentielle abstracts blev evalueret. Undersøgelser med originalt eksperimenterende design, der analyserede miRNA udtryk profilering i menneskelig mellem leverkræft væv og ikke-tumorform levervæv blev inkluderet. I mellemtiden, undersøgelser var ikke berettiget til meta-analyse, hvis de opfyldte følgende udvælgelseskriterier:. 1) kun bruger cellelinjer, 2) forvalgte kandidatgener forskning, 3) profilering forskellige kliniske eller histologiske undertyper uden herunder ikke-tumor-væv

Lister over statistisk signifikante udtrykte miRNA blev udvundet fra publikationer. Forfattere blev kontaktet, når kunne ikke opnås listerne. Alle miRNA navne blev standardiseret gennem miRBase udgave 20. miRNA, der ikke kan henføres til enten -3p eller -5p i miRBase blev betegnet med HSA-miR- *, såsom HSA-miR-210. De, identificeret som døde post i miRBase blev holdt deres navne nævnt i litteratur

Statistisk analyse

Listerne over miRNA blev udtrukket baseret på statistiske test p-værdier ( . 0,05 blev betragtet som signifikant ). Derefter blev miRNA i alle liste prioriteret af fold ændringer eller andre værdier, der kunne indikere graden af ​​deregulering. For at sikre, at udtrukne miRNA kan rangordnes i en mere pålidelig måde, vi brugte robust rang sammenlægning metode. [5] Metoden er baseret på en sammenligning af faktiske data med en null model, der antager tilfældig rækkefølge af input lister. En P-værdi er tildelt hvert element i den aggregerede liste beskrevet, hvor meget bedre det var rangeret end forventet. I tilfælde af falsk positive resultater, blev Bonferroni korrektion udført. I mellemtiden, for at vurdere stabiliteten af ​​erhvervede p-værdier, efterlade en ud krydsvalidering blev påført på den robuste rang sammenlægning algoritme. En gennemsnitlig p-værdi blev opnået fra tilfældige gen lister efter at have gentaget analyserne 10.000 gange.

Clustering analyse

For at undersøge korrelationerne blandt miRNA udtryk profiler af de enkelte studier, vi udførte hierarkisk klyngedannelse hjælp de liberaliserede miRNA. To-dimensionelle gennemsnit-kobling hierarkisk gruppering af en Spearman rank korrelation lighed matrix konstrueret af separate analyser for opreguleres og nedreguleres gen lister blev udført.

Integrativ identifikation af miRNA mål

meta-signatur miRNA blev udvalgt til mål forudsigelse ved hjælp Targetscan database version 6.2 [6], PicTar (forudsigelser fra miRWalk database) [7] og DIANA-microT-CDS v5.0 (ved hjælp miTG score tærskel 0.7) [8]. TarBase v6.0database [9], og CLIP-Seq database starbase [10] blev anvendt til at erhverve validerede targets. For at forbedre nøjagtigheden af ​​målet forudsigelse blev konsensus mål udvundet for de overlappende mål forudsagt af mindst to algoritmer plus validerede mål fra TarBase og starbase.

Berigelse analyse

For at identificere veje for forudsagt mål miRNA, Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg), Panther veje og Gene ontologi vilkår blev udført med GeneCodis web værktøj (https://genecodis.dacya.ucm.es/). [11]

Resultater

Study udvælgelse og dataudtræk

Database søgninger oprindeligt gav i alt 251 publikationer og 16 studier mødte inklusionskriterierne. (Fig. 1) Fire research [12] – [15] blev udelukket i sidste ende, fordi listerne over klassificeret miRNA var ikke hverken offentligt eller personligt tilgængelige fra de tilsvarende forfattere. De fleste af de undersøgelser blev offentliggjort mellem 2009 og 2013. To tredjedele af de undersøgelser kom fra Asien, og resterne kom fra Amerika og Europa. Desuden inkluderede studier anvendt forskellige microarray platforme og det gennemsnitlige antal miRNA sonder var 626 (lige 121-1205). I alt 357 tumor og 283 noncancerous prøver blev inkluderet. De fleste af de undersøgelser, der fokuserer på hepatocellulært carcinom (HCC) sammenlignet med tilstødende nontumorous væv eller normal lever væv undtagen Cario 2010 og Selaru 2009, der henholdsvis fokuserer på hepatoblastoma (HB) og kolangiokarcinom (CCA). De vigtigste karakteristika ved disse undersøgelser blev anført i tabel 1.

I alt blev der rapporteret 136 miRNA som markant opreguleres og 138 som signifikant nedreguleret i inkluderede studier. Antallet af betydeligt deregulerede miRNA varierede meget på tværs studier (fra 14 til 91).

Cluster analyse

For at vurdere graden af ​​overensstemmelse mellem miRNA lister og mulig sammenhæng i henhold til de undergrupper af tumor histologi, region, og prøve størrelse, hierarkisk klyngedannelse analyse blev udført (S1 figur). Den gruppering af disse lister viste, at resultaterne af Shih 2012, Sato 2011 og Li 2008 med HCC væv var mere ligner hinanden end nogen andre undersøgelser. De mest lignende resultater var Li 2008-1 og Li 2008-2, udført af samme arbejdsgruppe ved hjælp af den samme platform, selvom prøvens størrelse varierer meget. Det er ikke klart, om der var en vis overlapning af prøverne mellem de to undersøgelser, men hvis dette er tilfældet, kan det være en forklaring på den høje lighed af resultaterne. Ikke mere åbenlyse ligheder blev set mellem andre undergrupper.

miRNA meta-signatur

Vi identificerede en statistisk signifikant meta-underskrift fem opreguleret miRNA og fire nedreguleret miRNA i prøver leverkræft forhold til noncancerous leveren væv ifølge permutationen p-værdi. (Tabel 2) Kun to opreguleret men ikke nedreguleret miRNA nåede statistisk signifikans efter Bonferroni korrektion. Antallet af meta-signatur miRNA studier rapporterede varierede meget, men mindst tre deregulerede miRNA blev rapporteret af hver undersøgelse, med en undtagelse af Cairo 2010 og Selaru 2009, som netop separat rapporteret to opreguleres miRNA. De mest betydeligt dereguleret miRNA, miR-221, miR-222, henholdsvis rapporteret af ni og ti datasæt. Desuden permutation p-værdier for yderligere tre opreguleret miRNA, MIR-93, MIR-21 og MIR-224, og fire nedreguleret miRNA, miR-130a, miR-195, miR-199a og MIR 375 er 0,05, men ikke når den korrigerede betydning.

Meta-signatur miRNA gener er spredt på forskellige kromosomale steder med en undtagelse af miR-221 og miR-222 gener, der begge ligger på Xp11.3. MIR-224-gener er placeret i det samme kromosomale region, Xq28, som er et cytogenetisk region, der indeholder en stor del af cancer /testis antigen-genfamilien. [16]

Target forudsigelse og berigelse analyse

Konsensus mål for miRNA nå robust rang sammenlægning betydning blev udtrukket for de overlappende mål forudsagt af mindst to algoritmer plus eksperimentelt validerede mål fra to databaser. Den sommerlig af target tæller er præsenteret i fig. 2. MIR-130a og miR-195 har flere mål end andre miRNA, hvorimod miR-199a har ingen mål, fordi det blev forudsagt af kun én algoritme.

Berigelse analyser blev udført ved hjælp af forudsagte målgener med GeneCodis web-værktøj. Flere veje beriget af Kegg og Panther veje var relativt betydelige, og de fleste af dem var ofte forbundet med cellesignalering (fx neurotrophin, Wnt, FGF, og p53-signalvejen) og kræft. (Tabel 3, fig. 3, S2 figur)

Intensiteten af ​​farve repræsenterer FDR-korrigerede p-værdi. Kun de veje, som var betydeligt mere end fire miRNA er vist (der foreligger fuldstændige data S2 Figur).

Diskussion

Brug robust rang sammenlægning metode, 14 prioriterede miRNA lister fra de 12 offentliggjorte undersøgelser blev analyseret og endelig identificeret fem opreguleret og fire nedreguleret miRNA. Men efter Bonferroni korrektion kun to opreguleres miRNA nåede statistisk forskel.

De deregulerede miRNA identificeret ved forskellige forskningscentre tillod ikke en ensartet konklusion. Forskelle mellem microarray teknikker, stadium af tumoren, histologiske udseende og ætiologiske faktorer tilskrives heterogenitet. [17] Der har været forsøg på at opdele datasættene i undergrupper på basis af platformen og tumor-typen subtype, men ingen af ​​to undersøgelser har anvendt samme platform og størstedelen af ​​tumorprøver var fra HCC væv. klyngen analyse viste imidlertid, at to datasæt gennemført af én arbejdsgruppe brugt en identisk platform gjort høj lighed og anther meta-analyse brugt robust rang sammenlægning metode også ført til den samme konklusion som os. [18]

I denne undersøgelse anvendte vi den Bonferroni metode til at kontrollere falske positive og gjort resultaterne mere pålidelige. I sidste ende, miR-221 og miR-222 var kun to statistisk signifikante meta-signatur miRNA. Desuden permutation p-værdier i en anden tre opreguleret (MIR-93, MIR-21 og MIR-224) og fire nedreguleret miRNA (miR-130a, miR-195, miR-199a og miR-375) var 0,05, men deres rettede p-værdier var ikke signifikant. Følgende begrænsninger kan forklare disse fund: 1) der ikke var tilstrækkeligt datasæt for integration, 2) prøvestørrelserne af datasættene var relativt små, 3) forskellige metodologi Forskerne brugte gjort mere afvigende

Selv om der ikke stærk betydning. blev set i alle meta-signatur miRNA, eksperimentelle studier i de seneste år vist, at de var meget forbundet med leverkræft. MIR-221 blev den hyppigst undersøgte blandt de meta-signatur miRNA. Fornari et al. [19] har vist, at miR-221 fungerede som et onkogen i hepatocarcinogenese ved at målrette CDKN1B /p27 og CDKN1C /p57 i 2008. I mellemtiden resultater Gramantieri et al. [20] har vist, at miR-221 hæmmede apoptose ved at målrette BMF og dets overekspression var forbundet med en mere aggressiv fænotype i 2009. Tilsammen disse resultater impliceret, at miR-221 kan være et potentielt mål for ikke-konventionelle behandling mod HCC. Desuden Park et al. [21] fandt, at miR-221 lyddæmpning blokerede hepatocellulært carcinom og fremmet overlevelsen i et gyldigt ortotopisk musemodel af HCC og Callegari et al. [22] og Pineau et al. [23] har henholdsvis bekræftet den onkogene rolle MIR-221 i musemodel. Desuden Li et al. [24] viste, at serum MIR-221 kan give prædiktiv betydning for prognose af HCC patienter og He et al. [25] har vist, at MIR-221 lyddæmpning inhiberede liver cancer maligne egenskaber in vitro og in vivo. Sammen har miR-221 været dybt studeret på dens indvirkning på leverkræft, og det kan være en potentiel kandidat mål for leverkræft diagnose og behandling.

Udover miR-221, nogle andre miRNA er blevet eksperimentelt vist sig at knytte til forekomst, udvikling og metastaser. Tre opreguleres meta-signatur miRNA, miR-222, MIR-21 og MIR-224, kan forværre HCC gennem AKT signalveje. [26] – [28] MIR-222 overekspression er almindelig i HCC og kunne give metastatiske potentialer i HCC celler muligvis ved at øge AKT signalering. [26] MIR-21 undertrykker PTEN og hSulf-1-ekspression og fremmer HCC progression gennem AKT /ERK veje, og som for miR-224, det muligvis Actives den AKT signalveje ved at målrette PPP2R1B. [27], [28] En nylig undersøgelse viste, at MIR-21 og MIR-222 udtryk differentielt blev moduleret af hepatitis B virus X protein i maligne hepatocytter. [29] Desuden miR-224 kan spille en betydelig rolle i migration og invasion af HCC celle. [30] – [32] Det er interessant, to nedreguleret meta-signatur miRNA, miR-195 og miR-375, måske spiller vigtig hæmmende roller i HCC progression. [33] – [38] For eksempel kan MIR-195 inhiberer HCC progression ved at målrette LATS2 og NF-KB-signalvejen [33], [34] og undertrykke angiogenese og metastase af hepatocellulært carcinom ved at inhibere ekspressionen af ​​VEGF, VAV2 og cdc42. [35] Xu et al. har vist, at MIR-195 spillede en vigtig rolle i cellecykluskontrol og i den molekylære ætiologi HCC. [36] Desuden MIR-195 kan målrette PCMT1 i hepatocellulært carcinom, der øger tumor levetid [39] og negativt regulere proteinniveauer af steroid receptor coaktivator-3 ved at målrette dens 3′-utranslaterede region i HCC-celler [40]. En anden nedreguleret miRNA, MIR-375, også har vist sig at undertrykke leverkræft cellevækst in vitro eller in vivo. [37], [38]

Selvom vi har vist, at miRNA kan indebære at fremme eller hæmme leverkræft progression ved at målrette nogle gener i de centrale veje for regulering kræft, er der stadig lang vej at gå at fortolke virkningen af ​​miRNA på leverkræft. Det fremtidige arbejde bør holde løbende fokus på den mekanisme, gennem hvilken miRNA regulere forekomst, progression og metastase af leverkræft. Desuden er der behov for undersøgelser med stor stikprøvestørrelse og samme platform.

Som konklusion foreslår vi, at de meta-signatur miRNA er vigtige regulatoriske førere af den onkogene proces, som kan være gode potentielle mål for diagnose og behandling af leverkræft.

Støtte Information

S1 figur.

Cluster analyse af miRNA listen. Mulig sammenhæng blev vist i henhold til de undergrupper af tumor histologi, region, og prøve størrelse. Clustering blev udført ved hjælp af Pearson korrelation og gennemsnitlig kobling metode

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114533.s001

(TIF)

S2 Figur.

Pathway berigelse af meta-signatur miRNA mål. Intensiteten af ​​farve repræsenterer FDR-korrigerede p-værdi. Clustering blev udført ved hjælp af Pearson korrelation og gennemsnitlig kobling metode

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114533.s002

(TIF)

S1 Tjekliste.

PRISMA Tjekliste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114533.s003

(DOC)

Tak

Vi takker Mr. Hui Chen og Ms Shanshan Zeng for deres støtte på systue og genfinding netværk.