PLoS ONE: PTRF /Cavin-1 og MIF Proteiner er identificeret som ikke-småcellet lungekræft Biomarkører ved Label-Free Proteomics

Abstrakt

Med færdiggørelsen af ​​det humane genom sekvens, biomedicinske videnskaber har indtastet i den “omics” æra, primært som følge af højt gennemløb genomforskning teknikker og den nylige anvendelse af massespektrometri til proteomics analyser. Men der er stadig en tidsforskydning mellem disse teknologiske fremskridt og deres anvendelse i kliniske omgivelser. Vores arbejde er designet til at bygge bro mellem højtydende proteomics og klinisk rutine. Proteinekstrakter blev opnået fra frisk frossen normal lunge og ikke-småcellet lungekræft prøver. Vi anvendte en phosphopeptid berigelse efterfulgt af LC-MS /MS. Efterfølgende label-fri kvantificering og bioinformatiske analyser blev udført. Vi vurderede proteinmønstre på disse prøver, der viser dusinvis af differentielle markører mellem normale og tumorvæv. Gene ontologi og interactome analyser identificerede signalveje ændret på tumorvæv. Vi har identificeret to proteiner, PTRF /Cavin-1 og MIF, som udtrykkes differentielt mellem den normale lunge og ikke-småcellet lungekræft. Disse potentielle biomarkører valideret ved anvendelse western blot og immunhistokemi. Anvendelsen af ​​discovery-baserede proteomics analyser i kliniske prøver gav os mulighed for at identificere nye potentielle biomarkører og terapeutiske mål i ikke-småcellet lungekræft

Henvisning:. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, Calvo E, Agulló-Ortuño MT, López-Vacas R, Díaz E, et al. (2012) PTRF /Cavin-1 og MIF Proteiner er identificeret som ikke-småcellet lungekræft Biomarkører ved Label-Free Proteomics. PLoS ONE 7 (3): e33752. doi: 10,1371 /journal.pone.0033752

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, Italien

Modtaget: December 1, 2011; Accepteret: 16 Februar 2012; Udgivet 26. marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Gámez-Pozo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud FIS KP05 /00248, PS09 /01597, Rød Tematica de Investigación Cooperativa en cancer (RTICC, RD06-0020-1022) fra Carlos III Institute of Health (spanske ministerium for videnskab og innovation, Spanien) og forskningsbevillinger fra Mutua Madrileña Foundation. ISN er støttet af Fonden for Biomedical Research La Paz Universitetshospital. ED er støttet af tilskud CA10 /01.447 fra Carlos III Institute of Health. Spanske Center for Cardiovascular Research er støttet af det spanske ministerium for videnskab og innovation og ProCNIC Foundation. Den IdiPAZ Biobank er støttet af Carlos III Institute of Health, spansk sundhedsministerium (Retic RD09 /0076/00073) og Farmaindustria, gennem samarbejde Program i klinisk og translationel forskning i Madrid. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald i verden. Den samlede overlevelse efter 5 år er 15% og er ikke blevet forbedret i årtier. To tredjedele af patienterne er diagnosticeret med fremskreden sygdom, hvor terapeutiske muligheder er palliativ, og op til 55% af patienter med begrænset sygdom i sidste ende tilbagefald efter radikal kirurgi [1].

Genekspression profilering har ført til identifikation af grupper af patienter med andet resultat, hvilket afspejler heterogeniteten af ​​denne sygdom [2]. Imidlertid gen-niveau analyser ikke registrerer små ændringer forårsaget af post-translationelle modifikationer af proteiner [3]. En dyb forståelse af de processer af carcinogenese, tumorprogression og metastase kræver analysen af ​​både genomet og proteom [4]. Proteomisk teknologier baseret på massespektrometri (MS) er dukket op som foretrukne komponenter i en strategi for at opdage diagnostiske, prognostiske og terapeutiske protein biomarkører [5]. Fortsat fremskridt på dette område giver denne strategi et enormt potentiale for sådanne undersøgelser [6], [7].

De seneste kliniske forsøg, der viser god respons på nye lægemidler i specifikke undergrupper af patienter understreger behovet for molekylære test, der supplerer klassiske histopatologiske procedurer [8]. I denne sammenhæng kan proteomisk profilering give værdifulde biomarkør værktøjer til effektiv patient stratificering og udvælgelse terapi.

Selv om det er muligt at analysere proteiner fra væv ved hjælp af massespektrometri [3], [9], kompleksiteten af ​​den kliniske prøve, og mængden af ​​tilgængelig protein er begrænsende faktorer. Derfor er prøve berigelse i biologisk relevante analytter påkrævet [5]. De fleste eukaryote cellulære processer reguleres ved protein fosforylering, og deregulering af denne nøgle posttranslationel modifikation er almindelig i kræft og andre sygdomme. Dette forklarer, hvorfor protein kinaser er dukket op som den vigtigste klasse af nye lægemiddelkandidater inden for onkologi og andre områder [10]. I dette arbejde har vi anvendt phosphopeptid berigelse kombineret med label-fri MS-teknikker til at identificere allerede kendt og nye potentielle biomarkører i ikke-småcellet lungekræft kliniske væv og validere dem ved hjælp af Western blot og immunhistokemi.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Institutionel godkendelse fra vores etiske komité blev opnået for gennemførelse af undersøgelsen (Comité Ético de Investigación Clínica, Hospital Universitario La Paz). Data blev analyseret anonymt. Patienterne forudsat skriftligt samtykke, således at deres prøver og kliniske data kan bruges til undersøgelsesformål.

Sample valg

Frosne prøver fra patienter diagnosticeret med lungekræft blev hentet fra Patologisk Institut for Hospital Universitario La Paz (Madrid, Spanien): 5 lunge adenocarcinom (AC), 5 lunge pladecellekræft (SC) og 5 normale lunge (NL) prøver. De histopatologiske træk af hver prøve blev gennemgået af en erfaren lunge patolog at bekræfte diagnosen og tumor indhold. Mindst måtte bestå af tumorceller for det at være berettiget 50% af en prøve. Prøver fra patienter blev venligst stillet til rådighed af IdiPAZ Biobank (RD09 /0076/00073) integreret i den spanske Hospital Biobanker Network (RetBioH, www.redbiobancos.es). Prøverne blev registreret og behandlet efter gældende procedurer og faste /frosne umiddelbart efter deres modtagelse.

Total protein udvinding, opløsning og fordøjelse

Prøver blev skåret i en Leica CM3050S kryostat, opnåelse 10 afsnit af 10 mikron tykkelse hver. Væv blev forarbejdet med TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. For MS-analyser blev protein pellets resuspenderet i guanidinhydrochlorid 6 M og opvarmet 10 minutter ved 95 ° C under omrøring. Efterfølgende blev 950 pi 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 7-9) per prøve tilsat. koncentration proteinprøve blev målt ved MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific). Trypsin MS Grade Guld (Promega) blev tilsat til hver prøve til et 01:50 forhold. Fordøjelse blev udført natten over ved 37 ° C. Den fordøjede prøve blev delt i to portioner.

Parallel IMAC (PIMAC)

phosphopeptid berigelse blev udført som tidligere [11] beskrevet. Kort fortalt blev Fe (III) -baserede IMAC udføres i en portion af spaltet protein ved PHOS-Select Iron Affinity Gel (Sigma-Aldrich) ifølge producentens instruktioner. Ga (III) -baserede IMAC blev udført i en anden portion af spaltet protein ved phosphopeptid Isolation Kit (Pierce-Thermo Scientific) ved at følge producentens instruktioner. Eluater blev blandet, vakuumtørret og opbevaret ved -20 ° C til senere MS-analyse.

LC-MS /MS-analyser

peptidblandinger blev underkastet nano-væskekromatografi koblet med MS for protein identifikation. Peptider blev injiceret i en C-18 omvendt fase (RP) nano-søjle (100 um ID og 12 cm, Mediterranea havet, Teknokroma) og analyseret i en kontinuerlig acetonitrilgradient bestående af 0-40% B i 90 min, 50-90 % B i 20 min (B = 95% acetonitril, 0,5% eddikesyre). Ved afslutningen af ​​gradienten blev søjlen vasket med 90% B og ækvilibreret med 5% B i 20 minutter. En strømningshastighed på 300 nl /min blev anvendt til at eluere peptiderne fra RP nano-søjle til en emitter nanospray nål til tidstro ionisering og peptidfragmentering på en LTQ-Orbitrap XL massespektrometer (Thermo-Fisher). En forbedret FT-opløsning spektrum (opløsning = 60000), efterfulgt af MS /MS-spektre fra de fem mest intense moderioner blev analyseret langs kromatografisk serie (130 min). Dynamisk udelukkelse blev fastsat til 1 min. For proteinidentifikation fragmentering spektre blev søgt mod MSDB databasen (version 091.509) ved hjælp af Mascot 2.1-programmet (Matrixscience). To mistede spaltninger var tilladt, og en fejl på 10 ppm eller 0,8 Da blev sat for fuld MS eller MS /MS-spektre søgninger hhv. Alle identifikationer blev udført af Proteome Discoverer 1.0 software (Thermo-Fisher). Decoy databasesøgning for forkerte opdagelse sats analyse blev fastsat til 0,05 ved at anvende tilsvarende filtre. Rå datafiler blev behandlet og sammenlignet med SIEVE version 1.2 (Thermo-Fisher). Protein identifikationer valideret ved anvendelse af BLAST værktøj fra BLASTP suite (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). For detaljerede peptid masse fingeraftryk og protein identifikation indstillinger, se tabel S4.

Inmunoblotting analyser

For inmunoblotting analyser, protein pellets blev resuspenderet i 2% SDS og opvarmet 10 minutter ved 95 ° C under omrøring . koncentration proteinprøve blev målt ved MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific) .Western blots blev udført under anvendelse WesternDot systemet (Invitrogen) i en SNAP i.d. enhed (Millipore). MIF antistof 1: 250 fortynding (R 0,05 blev betragtet som signifikant. Sieve og densitometridata værdier blev sammenlignet ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient

Bioinformatik

Protein lister blev behandlet ved hjælp af databasen for anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) version 2.0 (http:. //David. abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) [12], [13]. For at identificere virksomheder og over-repræsenterede funktionelle kategorier brugte vi proteinanalyse gennem Evolutionary Relationships (PANTHER) database v 6.1 (www.pantherdb.org) [14]. Tumor protein liste blev sammenlignet med den normale lunge listen ved hjælp af binomialtest [15] for hver molekylær funktion, biologisk proces eller sti sigt i PANTHER. Protein-protein interaktioner blev opnået fra søgeværktøj for Retrieval interagere Gener /Proteiner (STRING) database v9.0 indeholder kendte og forventede fysiske og funktionelle protein-protein interaktioner [16]. STRING på protein tilstand blev brugt, og kun interaktioner baseret på eksperimentelle protein-protein interaktion og kurateret databaser- med sikkerhedsgrænser løbet 0,5- blev holdt.

Resultater

I denne undersøgelse har vi vurderet forskelle på proteinniveauet mellem ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) og lunge normalt væv ved anvendelse af et phosphopeptid berigelse strategi og en etiket-fri tilgang. Prøver blev analyseret på en LTQ-Orbitrap XL efter at være underkastet væskekromatografi. Da det er kendt, at forskellige teknikker isolere særlige og overlappende segmenter af fosfoproteom [17], herunder Fe (III) og Ga (III) IMAC [18], blandede vi den Fe (III) og Ga (III) IMAC fraktioner fra hver prøve og analyseret dem sammen.

Vi vurderede antallet af unikke peptider og deres tilsvarende proteiner, samt phosphopeptider og deres tilsvarende phosphoproteiner, der er konstateret i lunge adenocarcinom (AC), lunge pladecellecarcinom (SC) og normal lunge (NL) prøver, der anvender en lokkedue database søgning på falsk opdagelse sats 0,05. Den omfattende analyse udført i NSCLC og NL prøver ved anvendelse af LC-MS /MS tilladt os at identificere et gennemsnit på 381 unikke peptider per prøve, hvoraf en middelværdi på 56 var phosphopeptider. Disse peptider svarer til et gennemsnit på 138 unikke proteiner identificeret per prøve, hvoraf et gennemsnit på 39 blev phosphoryleret. Fraktionen af ​​phosphopeptider identificeret (antal fosforylerede peptider * 100 /antal identificerede peptider) var 19,9%.

Gene ontologi analyser blev udført ved hjælp af alle identificerede proteiner. tumor protein liste den blev sammenlignet med den normale lunge protein liste for hver molekylære funktion (fig S1), biologisk proces (figur S2), eller pathway (figur 1) form under anvendelse PANTHER. Denne fremgangsmåde viste signifikante forskelle mellem normale lunge- og tumorprøver (fuldstændige analyser er vist i tabel S1). Forskelle i molekylære funktioner er hovedsageligt relateret til samspillet med nukleinsyrer og regulering af proteinsyntese og aktivitet. Processer kontrollerende exocytose, immunrespons, reaktion på stimulus, reaktion på stress og transport var betydeligt underrepræsenteret i tumorer, mens kategorier relateret til celle-matrix adhæsion eller respons på toksin var overrepræsenteret. På den anden side, homeostase kategorier var underrepræsenteret, mens kategorier relateret til energiproduktion og celledeling var overrepræsenteret i tumorer. Bemærkelsesværdig forskelle i pathway analyse optrådte i kategorier relateret med signaltransduktion kontrol. Mens cytoskeletal regulering af Rho GTPase, betændelse medieret af chemokin og cytokin signalvejen, integrin signalvejen og Wnt signalvejen var underrepræsenteret i tumorprøver, EGF-receptor-signalvejen, Glycolysis, p53 pathway og PI3 kinase pathway var overrepræsenteret.

Sammenligning af antal proteiner tildelt hver GO pathway kategori. Normale kategorier vævsprøve er repræsenteret som fold-ændring i forhold til denne kategori. Statistisk signifikans er testet under anvendelse af binomialtest. Kun væsentlige kategorier (p 0,05) er vist

Differential udtryk analyse mellem NSCLC vs normal lunge blev udført ved hjælp af SIEVE 1.2 software.. Der blev fundet i alt 296 differentielt udtrykte m /z toppe, 115 som havde rådighed MS2 spektre, føre til identifikation af proteiner udtrykkes differentielt mellem normal lunge og NSCLC prøver (tabel 1). Alle data fra SIEVE analyser, herunder relative udtryk værdier, findes i tabel S2.

PTRF /cavin-1 og MIF outstand blandt de differentielt udtrykte biomarkører mellem NSCLC og normale lunge prøver i label-fri analyser som den mest nedreguleres og opreguleret henholdsvis (figur 2). PTRF /Cavin-1 viste tab af udtryk i både adenocarcinom og pladecellekræft prøver. På den anden side viste MIF en øget ekspression i disse prøver. For at undgå falske positive identifikationer blev over tyve MS2 spektre for hver MIF og PTRF /Cavin-1-peptider evalueres manuelt (figur S3 og S4 og tabel S3). Ændringer i PTRF /Cavin-1 og MIF udtryk i NSCLC prøver blev valideret ved hjælp af immunhistokemi (IHC) og western blot analyser. De samme prøver, der anvendes til MS /MS-analyser og ni yderligere prøver af adenocarcinom, pladecellekræft og normal lunge blev evalueret for MIF og PTRF hjælp western blot. Fem yderligere prøver af adenocarcinom, pladecellekræft og normal lunge blev evalueret for MIF og PTRF hjælp IHC. Alle tumorer viser positiv farvning for MIF og negativ farvning for PTRF, mens alle normale væv var negative for MIF og positiv for PTRF farvning. MIF over-ekspression i tumorvæv blev bekræftet både ved IHC og western blot (figur 3 og 4). På den anden side, tumorprøver bekræftede tab af PTRF /Cavin-1-ekspression sammenlignet med normal lunge (figur 3 og 4) med begge teknikker. Pearsons korrelation mellem Sieve label-ytringsfrihed værdier og western blot kvantificering var r = 0,723 og r = 0,754 (p 0,005) for MIF og PTRF /Cavin-1 henholdsvis

Boxplots repræsenterer middelværdien og 25.-75. percentil. ; whiskers repræsenterer minimun og Maximun. Målinger blev opnået fra fem forskellige prøver i hver tilstand. Kruskall-Wallis test p-værdier er vist. AC: Adenocarcinom; SC: Pladecellekræft; NL:. Normal lunge

a) Western blot af totalt protein udvundet angivne prøver, ved hjælp af anti-MIF og anti-PTRF /Cavin-1 primære antistoffer. b) Densitometrisk analyser af western blot. ImageJ 1.38e software blev anvendt til at måle intensiteten af ​​bånd. Alle værdier i arbitrære enheder. c) Immunhistokemi af angivne prøver, under anvendelse af anti-MIF og anti-PTRF /Cavin-1 primære antistoffer. AC: Adenocarcinom; SC: Pladecellekræft; NL:. Normal lunge

Box-Plot grafer, der viser PTRF og MIF western blot kvantificering hjælp ImageJ 1.38e software. Alle værdier i arbitrære enheder. Hver Box indeholder værdier fra ni forskellige prøver. Forskelle mellem normale og tumorale prøver var p. 0,005 i begge tilfælde (Kruskall-Wallis test)

Vi søgte i databasen STRING for interactomic forbindelser MIF og PTRF. For at minimere antallet af falske positiver, vi elimineret partnere bruger strenge kriterier, og kun eksperimenterende protein-protein interaktioner og veje fra curated databaser blev taget i betragtning. PTRF indgår i RNA-transkription pathway, og fysisk interagerer med TTF1. Andre PTRF interaktioner omfatter proteiner involveret i transskription regulering og EGFR (figur 5). MIF er relateret til phenylalanin metabolismen pathway, og interagerer med p53 og proteiner af COP9 signalosom kompleks, et kompleks involveret i forskellige cellulære og udviklingsmæssige processer, herunder p53 phosphorylering-medieret nedbrydning [19]. Andre interaktioner omfatter proteiner relateret med celledød regulering og inflammatorisk proces (figur 6).

En graf over PTRF netværk bygget ved hjælp af STRING v9.0 vises. Forskellige line farver repræsenterer de typer af beviser for foreningen:. Lyserødt til eksperimenter og blå for databaser

En graf af MIF netværk bygget ved hjælp af STRING v9.0 vises. Forskellige line farver repræsenterer de typer af beviser for foreningen:. Lyserødt til eksperimenter og blå for databaser

Diskussion

Proteomics i almindelighed og fosfoproteom i særdeleshed bliver de foretrukne metoder til protein discovery-baserede analyser. Brugen af ​​label-fri, opdagelse tilgange kan hjælpe opdage uventede biologiske forbindelser på grund af fravær af tidligere viden bias. Bioinformatik værktøjer, såsom gen ontologi og interactome analyser, der anvendes på kliniske prøver har et stort potentiale til at identificere veje og molekyler med konsekvenser på det terapeutiske niveau og kan tilbyde spor til tilblivelsen af ​​sygdomme og deres underliggende molekylære forandringer. både selve teknologien og data analyseværktøjer, bør imidlertid være yderligere raffineret før de træder i klinikken.

phosphopeptid berigelse af prøver forud for MS-analyse ved hjælp PIMAC fungeret rimeligt godt, som 20% af målte peptider var phosphoryleret. Tidligere undersøgelser har vist en berigelse af phosphopeptider på ca. 50% ved anvendelse af en IMAC protokol svarende til vores på tryptisk fordøjelse af en blanding af flere reference-proteiner [20]. I betragtning af at vores prøver var meget komplekst, og at vi ikke bruge nogen fraktionering skridt, phosphopeptid berigelse var vellykket, og sammenlignes med den, der opnås i tidligere værker [21], [22]. Men de fleste af spektrene viser en phosphat tab præsenteret en dårlig fragmentering, og intet peptid identifikation blev genereret. Brugen af ​​ny fragmentering teknikker, som højere energi kollisionsdæmper dissociation, forbedre kvaliteten af ​​fragmentering spektre [23], så at udføre storstilet fosfoproteom analyse.

Gene ontologi analyser af biologisk proces og veje viste en stigning i kategorier relateret til energiproduktion i celler, såsom glycolyse og generering af prækursor metabolitter og energi. Disse forskelle i energistofskiftet mellem normale og tumorceller er kendt som Warburg effekt [24]. Fra signalveje underrepræsenteret i NSCLC væv, har chemokine- og cytokin-medieret inflammation tidligere vist sig at være underrepræsenteret i NSCLC [25]. Det er bemærkelsesværdigt, overrepræsentation af proteiner, der tilhører EGFR signalvej, i en sammenhæng, hvor den kliniske anvendelse af EGFR-hæmmere er blevet paradigme for personlig terapi for NSCLC [26], [27], [28].

Mere end 10% af de registrerede peptider udviste en differentiel ekspression mellem normale og tumorprøver. Procentdelen af ​​differentierede peptider var mindre end 2%, når man sammenligner adenocarcinom og lunge pladecellekræft prøver, men stadig var der betydelige forskelle mellem disse to NSCLC histologiske undertyper, som vi tidligere har vist [11].

Vi var stand til at validere NSCLC potentielle biomarkører identificeret i shotgun proteomics analyser bruger IHC og Western blot tilgange. MIF (makrofag migration inhibitorisk faktor) diskriminerede mellem normal lunge og NSCLC prøver. Denne velkendte faktor er et proinflammatorisk cytokin kan fungere som opløselige vækstfaktor, udtrykkes og udskilles som respons på mitogener og integrin-medieret signaler. MIF-proteinet er involveret i mange maligniteter, da det fremmer cellulær transformation, inhiberer cytolytisk immunrespons mod tumorceller og fremmer neovaskularisering [29]. Interactome analyser viste en tæt sammenhæng mellem celledød regulering og MIF, og det er ikke overraskende, at MIF overekspression blev beskrevet i mange typer af kræft, herunder kolorektal, bryst-, prostata-, hud- og lungekræft [30], [31], har en vigtig rolle i udviklingen af ​​tumorer i centralnervesystemet [32]. Tumorer co-udtrykkende MIF og dens membran receptor (CD74 protein) har øget vaskularisering [33]. Selv om der er flere molekyler, der hæmmer enzymatisk aktivitet af MIF, har sin høje IC50 begrænset sin kliniske anvendelse hidtil [34], men nye molekyler er under løbende udvikling [35]. Vores resultater viser en øget ekspression af MIF i NSCLC prøver ved label-free proteomics, bekræftet ved både Western blot og immunhistokemi.

PTRF (polymerase I og Transcript Frigivelse Factor), også kendt som cavin-1, er en protein afgørende for RNA-transkription [36] og caveolae formation [37]. Disse invaginationer af celleoverfladen er forbundet med processer vesikulær transport, cholesterol homeostase, signaltransduktion [38] og lipolyse kontrol [39]. Derfor er det ikke overraskende, at PTRF /Cavin-1-mutationer er associeret med medfødt generaliseret lipodystrofi, type 4 i mennesker [40]. PTRF /Cavin-1 colocalizes med caveolin 1 (CAV1) inden caveolae [41], og positivt modulerer sit udtryk [42]. Interactome analyser tyder på, at PTRF huser ukendte funktioner ud over nogle nyligt beskrevet [43], [44], [45]. Tab af PTRF /Cavin-1-ekspression i prostatakræft er blevet relateret til progression [46], og det er påvist, at dets udtryk nedsætter migration af PTRF /Cavin-1-mangel prostatacancerceller [47]. Tabet af PTRF /Cavin-1-ekspression i tumorigene HBE-celler sammenlignet med normale humane bronchiale epitelceller er blevet bevist for nylig [48]. Bai og kolleger har rapporteret for nylig, at PTRF protein blev nedreguleret i brystcancercellelinier og brysttumorvæv, og at nedregulering af PTRF i brystcancerceller blev associeret med promotoren methylering [49]. PTRF /Cavin-1 phosphorylerede arter er blevet beskrevet i celler, som overudtrykker EGFR, hvilket tyder på en funktion i denne signalvej [50]. Vores label-free proteomics resultater viser, at PTRF ekspression går tabt i NSCLC prøver. Disse resultater blev bekræftet ved anvendelse af både western-blot og immunhistokemisk farvning. Dette er den første undersøgelse, der viser PTRF /Cavin-1 tab af ekspression i NSCLC tumorvæv på proteinniveauet. Dette tab af udtryk, sammen med PTRF-EGFR interaktion og EGFR pathway deregulering i NSCLC prøver, antyder en rolle PTRF i NSCLC udvikling.

Vores arbejde viser, at det er muligt at identificere potentielle biomarkører ved hjælp af en etiket-fri differential proteomics strategi på virkelige kliniske prøver. Vi identificerede flere differentierede markører, hvoraf to blev valideret af alternative klassiske proteom metoder. Desuden viser vi, at gen-ontologi og interaktion analyser kan identificere veje og processer ændret på tumorvæv, som kan give et fingerpeg til tilblivelsen af ​​sygdommen og dens underliggende molekylære forandringer, og kunne være modtagelige for terapeutisk intervention. I den forstand, dette arbejde viser, at PTRF rolle i NSCLC og dets forhold til EGFR vej fortjener yderligere udforskning.

Støtte Information

Figur S1.

Analyse af forskelle i GO Molekylær Funktion mellem NSCLC og normal lunge. Sammenligning af antallet af proteiner tildelt hver GO pathway kategori. Normale kategorier vævsprøve er repræsenteret som fold-ændring i forhold til denne kategori. Statistisk signifikans er testet under anvendelse af binomialtest. Kun væsentlige kategorier (p 0,05) er vist

doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s001

(TIF)

Figur S2..

Analyse af forskelle i GO biologisk proces mellem NSCLC og normal lunge. Sammenligning af antallet af proteiner tildelt hver GO pathway kategori. Normale kategorier vævsprøve er repræsenteret som fold-ændring i forhold til denne kategori. Statistisk signifikans er testet under anvendelse af binomialtest. Kun væsentlige kategorier (p 0,05) er vist

doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s002

(TIF)

Figur S3..

Fragmentering spektre fra PTRF SLKESEALPEK tryptiske peptid. Diagram viser fragmentioner svarende til main fragmentering serien (b-amino og y-carboxy). * Viser vandtab; 2+, dobbelt ladede fragment. Parental ion er markeret med en pil

doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s003

(TIF)

Figur S4.

Fragmentering spektre fra MIF PMFIVNTNVPR tryptiske peptid. Diagram viser fragmentioner svarende til main fragmentering serien (b-amino og y-carboxy). * Viser vandtab. Parental ion er markeret med en pil

doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s004

(TIF)

tabel S1.

Gene ontologi analyser udført med PANTHER. Normal lunge protein liste blev anvendt som reference liste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s005

(PDF)

tabel S2.

SIEVE label-fri kvantificering. Data fra SIEVE analyser, herunder relative udtryk værdier

doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s006

(PDF)

tabel S3.

PTRF og MIF MS2 spektre.

doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s007

(PDF)

Tabel S4.

Peptide Mass Fingeraftryk og proteinidentifikation indstillinger.

doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s008

(DOC)

Tak

Vi ønsker at især anerkende patienterne i denne undersøgelse for deres deltagelse og IdiPAZ Biobank integreret i den spanske Hospital Biobanker Network (RetBioH, www.redbiobancos.es), for de generøse gaver af kliniske prøver, der anvendes i dette arbejde

.