PLoS ONE: anticancer effekter af 15d-Prostaglandin-J2 i Wild-Type og doxorubicin-resistente ovariecancerceller: Nye aktioner på SIRT1 og HDAC

Abstrakt

15-deoxy-delta-12,14-prostaglandin -J

2 (15d-PGJ

2), en arachidonsyre metabolit og en naturlig PPARy agonist, vides at inducere apoptose i tumorceller. I denne undersøgelse undersøgte vi nye terapeutiske potentialer af 15d-PGJ

2 ved at bestemme dens anticancer effekter i vildtype- og doxorubicin-resistente ovariecarcinomaceller. Trods høj ekspression af resistens-inducerende gener som MDR1, Bcl2 og Bcl-xl, 15d-PGJ

2 kraftigt induceret apoptose i doxorubicin-resistente (A2780 /AD) celler i lighed med vildtype (A2780). Dette viste sig at være relateret til caspase-3 /7- og NF-KB pathways, men ikke til dens PPARy agonistisk aktivitet. 15d-PGJ

2 også var i stand til at reducere doxorubicin modstand A2780 /AD-celler ved lave doser som bekræftes af hæmning af genekspression af MDR1 (p-glycoprotein) og SIRT1 (et lægemiddel ældning gen). Vi undersøgte også effekten af ​​15d-PGJ

2 om celle migration og transformation ved hjælp af en sårhelende assay og morfologiske analyser, hhv. Vi fandt, at 15d-PGJ

2 inhiberede migration sandsynligvis skyldes NF-KB-inhibering og induceret transformation af de runde-shape A2780 /AD-celler i aflange epitelceller grund HDAC1 inhibering. Ved hjælp af en 15d-PGJ

2 analog, fandt vi virkningsmekanismen af ​​disse nye aktiviteter af 15d-PGJ

2 om SIRT1 og HDAC1 gen udtryk og enzymaktiviteter. Som konklusion den foreliggende undersøgelse viser, at 15d-PGJ

2 har et højt terapeutisk potentiale til at dræbe lægemiddelresistente tumorceller og, de nyligt beskrevne inhiberende virkninger af denne cyclooxygenase produktet på SIRT1 og HDAC vil give nye muligheder for kræft terapi

Henvisning:. de Jong E, Winkel P, Poelstra K, Prakash J (2011) anticancer effekter af 15d-Prostaglandin-J

2 i Wild-Type og doxorubicin-resistente ovariecancerceller: Novel handlinger på SIRT1 og HDAC. PLoS ONE 6 (9): e25192. doi: 10,1371 /journal.pone.0025192

Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians University, Tyskland

Modtaget: April 26, 2011; Accepteret: August 29, 2011; Udgivet: 21 September, 2011

Copyright: © 2011 de Jong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af EU-projekt af Innovative Action Program Groningen, Holland, og ved en Vici bevilling fra hollandske Technical Foundation (STW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostaglandiner (PG) er en familie af biologisk aktive endogene metabolitter af arachidonsyre. De styrer et stort udvalg af fysiologiske funktioner, såsom regulering af glat muskel-tonus, inflammation, cellulær vækst og differentiering [1]. 15-deoxy-Δ

12,14-prostaglandin J

2 (15d-PGJ

2) er en dehydrering derivat af PGD

2, som også er kendt som en naturlig agonist af nukleare receptor peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (PPARy). 15d-PGJ

2 er blevet rapporteret at vise flere farmakologiske aktiviteter (anti-inflammatoriske, anti-fibrotiske og apoptotiske aktiviteter) enten via PPARy-afhængige veje eller PPARy-uafhængige veje såsom Nuclear Factor-kappaB (NF-KB) – , Keap-Nrf2-, STAT1, og p53-afhængige veje [2], [3]. I vores seneste undersøgelse, har vi vist, at 15d-PGJ

2 var i stand til at hæmme tumor progression betydeligt

in vivo

i tumor-bærende mus. Dens effektivitet viste sig at være kontrolleret af sin stærke men reversible serumalbumin binding og ved den efterfølgende indtrængning af albumin i tumorerne, som var afhængige af tumorvaskulaturen [4]. Også andre grupper har rapporteret anti-tumor aktiviteten af ​​15d-PGJ

2 in vivo i forskellige tumormodeller [5], [6]. Disse resultater antyder, at der kan forudses en potentiel anvendelse af 15d-PGJ

2 til terapeutiske formål som et anticancermiddel.

Vi har vist, at 15d-PGJ

2 inducerer apoptose i forskellige cancerceller gennem PPARy-uafhængig NF-KB og caspase-afhængige veje [4], som også fremgår af andre undersøgelser [7], [8]. Kendskab til inddragelse af NF-KB-vejen i reguleringen af ​​multiresistens (MDR1) og anti-apoptotiske gener (Bcl-2 og Bcl-xl) [9], vi nu til formål at undersøge, om 15d-PGJ

2 er i stand inducere apoptose i doxorubicin-resistente cancerceller sammenlignet med vildtypen. Vi undersøgte endvidere, om virkningerne fremkaldt af 15d-PGJ

2 blev medieret gennem PPAR-afhængige og /eller NF-KB-afhængige veje. Chu og medarbejdere har vist, at Silent Information Regulator type 1 (SIRT1), en kvalitetsklasse III histon deacetylase (HDAC), er overudtrykt i forskellige kemoresistent tumorer af kræftpatienter og inhibering af SIRT1 genekspression fører til fald i MDR1-ekspression og stigning i lægemiddelfølsomhed [10]. Vi sammenlignede derfor SIRT1 udtryk i menneskelig vildtype og doxorubicin-resistente ovariecancer celler og undersøgt virkningerne af 15d-PGJ

2 på denne SIRT1 genekspression. I løbet af disse eksperimenter, bemærkede vi, at 15d-PGJ

2-behandlede doxorubicin-resistente celler transformeret fra runde-formede celler til en aflang form. Vi undersøgte yderligere denne fænotypiske forandringer og fandt, at 15d-PGJ

2 inducerede disse virkninger ved at hæmme klasse-I HDAC-enzymer. Mange farmakologiske aktiviteter af 15d-PGJ

2, f.eks inhibering af PPARy, NF-KB, p53 og NRF-keap veje induceres ved at lave et stabilt kompleks med frie cystein i disse proteiner gennem en af ​​de elektrofile carbonatomer [11]. For at afgøre, om hæmmende effekter af 15d-PGJ

2 på SIRT1 og HDAC’er også var relateret til sidstnævnte mekanisme, vi udførte flere

in vitro

eksperimenter ved hjælp af en analog af 15d-PGJ

2 . Vores resultater viser mange nye aktiviteter af denne endogene arachidonsyremetabolit på kræftceller og belyse virkningsmekanismen for denne cyclooxygenase produkt.

Metoder

Cell eksperimenter

Wild -typen (A2780) og doxorubicin-resistente (A2780 /AD) humane ovarie carcinom-cellelinier blev opnået fra University Medical Centre Groningen, Holland. A2780 og A2780 /AD (doxorubicin-resistente) cellelinier blev holdt på Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, BioWhittaker, Verviers, Belgien) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og antibiotika (penicillin, 50 enheder /ml plus streptomycin, 50 ng /ml) ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2. A2780 /AD-celler blev dyrket i nærvær af doxorubicin (2 uM). To uger før forsøgene en separat kolbe af doxorubicin-resistente celler blev opretholdt uden doxorubicin. Disse celler blev anvendt til yderligere eksperimenter for at undgå indflydelse af doxorubicin på vores eksperimenter. Siden 15d-PGJ

2 in vitro mister sin aktivitet i tilstedeværelse af FCS, blev udført alle forsøg i FCS-frit medium.

Cell levedygtighed undersøgelser.

Celler blev podet ind i 96-brønds plade som 1 × 10

4 celler /brønd i 200 pi medium med 10% FCS. Efter 48 timer blev cellerne vasket med serumfrit medium og derefter inkuberet med forskellige koncentrationer af 15d-PGJ

2 i serum-frit medium i 48 timer. I tilfælde af behandling med den irreversible PPARy-antagonist GW9662 (2-chlor-5-nitrobenzanilid, Sigma) blev celler præinkuberet med GW9662 (10 uM) i 3 timer og derefter inkuberet med en blanding af 15d-PGJ

2 (Cayman kemikalier, Ann Arbor, MI) og GW9662 i 48 timer. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved anvendelse af Alamar Blå farvestof (Serotec, Oxford, UK), som måler antallet af celler på grundlag af mitokondriel aktivitet. Efter 48 timer af inkubationen blev mediet indeholdende Alamar blue farvestof (fortyndet 1:10) tilsat til cellerne og inkuberet i yderligere 4 timer. Derefter metaboliseres farvestof (fluorescerende) blev påvist med et fluorimeter ved Excitation 560 nm og emission 590 nm.

Caspase 3/7 enzymassays.

Caspase-3 og -7 enzymer aktivitet blev bestemt hjælp Caspase 3/7 Glo (Promega, Medison, WI). 1 × 10

4-celler blev podet i 96-brønds plade i 200 pi dyrkningsmedium. Efter 48 timer blev cellerne vasket med serumfrit medium og inkuberet med forskellige koncentrationer af 15d-PGJ

2 i 100 pi medium i 5,5 timer. Efterfølgende blev 100 pi af Caspase 3/7-rekonstitueret reagens tilsat til cellerne og inkuberet i 30 minutter i inkubatoren. Luminescensen blev bestemt ved et luminometer (Lumicount, Packard, Meriden, CT).

Annexin V-farvning.

Annexin V-farvning blev udført på cellerne for at bestemme induktion af apoptose efter behandling med 15d-PGJ2. 1 × 10

4-celler blev podet i en 8-brønds plade (Lab-tek, Nunc, Roskilde, Danmark) i 400 pi dyrkningsmedium. Efter 72 timer blev cellerne vasket med serumfrit medium og inkuberet med forskellige koncentrationer af 15d-PGJ

2 i 200 pi medium i 6 timer. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med 100 pi af annexin V-FITC (Roche, Mannheim, Tyskland) i 15 minutter ved stuetemperatur, vasket og fikseret med 4% paraformaldehyd. Derefter blev cellerne monteret med DAPI-holdige monteringsløsning og farvning blev undersøgt under et fluorescerende mikroskop.

Genekspression undersøgelse.

1 × 10

5 celler per brønd blev podet i 12 brønds plade og dyrket i 48 timer og derefter inkuberet med forskellige forbindelser i 48 timer. Cellerne blev lyseret ved anvendelse af en lyseringsbuffer og RNA blev isoleret under anvendelse Absolutely RNA microprep kit (Stratagene, La Jolla, CA) ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationer blev kvantificeret med et UV-spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Derefter cDNA blev syntetiseret ud fra lige store mængder af RNA ved anvendelse af Superscript III første streng syntese kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primerne til human art blev opnået fra Sigma-Genosys (Haverhill, UK). Primersekvenserne er indrulleret i tabel 1. genekspressionsniveauer for forskellige gener blev målt ved kvantitativ realtids-RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af SYBR Green som en fluorescerende probe (Applied Biosystems). Endelig blev tærskel cyklus numre (Ct), der anvendes til at beregne genekspression for hvert mål ved at normalisere til huset-holder gen GAPDH.

Transfektion og Luciferaseassayreagens for NF-KB-aktivitet.

NF-KB-aktivitet blev bestemt ved anvendelse af et Luciferase reporter assay som tidligere beskrevet [4]. Kort sagt, PNF-KB-Luc (Clontech, Mountain View, CA), der indeholder en specifik bindende sekvens for NF-KB og en tom Luciferase plasmid, pTAL-Luc (kontrol) blev anvendt til transfektion studier. 1 × 104 celler pr brønd blev podet i hvide plader med 96 brønde og transfektion af plasmiderne blev udført under anvendelse FuGENE 6-transfektionsreagens (Roche) efter 24 timer. Celler blev behandlet med et kompleks af 0,17 ug DNA /0,5 pi FuGENE 6 i 100 pi normal medier med 10% FCS i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne vasket med serumfrit medium og inkuberet med 15d-PGJ

2, BAY 11-7082 (Sigma), ciglitazon med eller uden TNF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ) i 4 timer. Derefter blev cellerne vasket med PBS og lyseret med 20 pi cellelyseringsbuffer, og suppleret med 100 pi luciferasesubstrat (Promega). Luciferaseaktivitet blev målt ved et luminometer (Lumicount, Packard). De luminescens enhedsværdier for PNF-KB-Luc blev neutraliseret ved at trække pTAL-Luc værdier.

sårheling assay.

1 × 10

5 celler per brønd blev podet i 12 brønds plade og dyrket i 48 timer i dyrkningsmedium. Derefter blev en ridse (sår) indført i sammenflydende cellelag ved anvendelse af en gul spids anbragt i et stillads, tillader standardisering af bunden. Celler blev vasket tre gange med medium for at fjerne løsnede celler. Celler blev derefter inkuberet med forskellige forbindelser i 48 timer og billeder af en defineret viklet plet blev foretaget med computerstøttet fasekontrastmikroskop (Olympus) ved t = 0, 24 og 48 timer. Det område af såret i de mikroskopiske billeder blev målt ved hjælp af billede J software (National Institutes of Health, MD) på forskellige tidspunkter. Procentdelen sårheling efter 24 timer eller 48 timer blev beregnet i forhold til den totale sårområde ved t = 0 timer på det samme sår stedet.

SIRT1 og HDAC1 enzymaktivitetassays.

SIRT1 og HDAC1 enzyminhibering assays blev udført for at bestemme virkningen af ​​15d-PGJ2 om deres aktiviteter ved hjælp af kommercielle kits fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). De SIRT1 og HDAC1 enzymassays blev udført i mikroplader i henhold til instruktionerne fra fabrikanten. Først assaypuffer, SIRT1 eller HDAC1 enzym og opløsningsmiddel (DMF) eller forskellige koncentrationer af behandlinger (15d-PGJ2 eller CAY-10410 opløst i DMF) blev blandet. CAY-10410 (9,10-dihydro-15-deoxy-Δ

12,14-Prostaglandin J

2), en analog af 15d-PGJ

2, blev købt fra Cayman kemikalier. Derefter blev substratet består af p53-sekvensen Arg-His-Lys-Lys (e-acetyl) -AMC peptid og co-substrat NAD + for SIRT1 aktivitet tilsat til enzymblandingen og inkuberet ved stuetemperatur i 45 minutter. Til måling HDAC1 aktivitet, blev en acetyleret lysin substrat tilsat til enzymblandingen og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter stop /fremkalderopløsning, indeholdende en blanding af en udvikler og nicotinamid (SIRT1 inhibitor) eller Trichostatin A (HDAC1 inhibitor) blev tilsat til mikropladen og inkuberet i 30 min og 15 min, henholdsvis ved stuetemperatur. Deacetyleret peptid reagerer med bygherren og frigiver en fluorofor. Fluoroforerne for begge assays blev analyseret under anvendelse af en excitationsbølgelængde på 350 nm og en emissionsbølgelængde på 450 nm. 100% aktivitet af enzymet blev beregnet ved inkubering med DMF alene og den procentvise inhibering af SIRT1 eller HDAC1 aktivitet blev beregnet i forhold til de tilsvarende koncentrationer af opløsningsmidler.

Statistiske analyser

Data er præsenteret som gennemsnit ± standardfejl middelværdien (SEM), medmindre andet er nævnt. De statistiske analyser blev udført ved hjælp af uparrede to-tailed t-test med

s

0,05 som det minimale niveau af betydning. Celle-levedygtighed data blev monteret i henhold til S-formet dosis-respons kurven for at beregne IC

50 ved hjælp af GraphPad Prism 4 software (La Jolla, CA).

Resultater

15d-PGJ

2 inducerer apoptose i både A2780 og A2780 /AD-celler PPARy-uafhængigt

Vi bekræftede, at A2780 /AD-celler er meget resistente over for doxorubicin sammenlignet med vildtype-A2780 celler som IC

50 af doxorubicin i A2780 og A2780 /AD var 1,3 og 120 uM (fig. 1A). Men behandling med 15d-PGJ

2 forårsagede celledød både A2780 celler (IC

50 = 4,3 um) og A2780 /AD-celler (IC

50 = 2,6 uM) efter 48 h inkubation. 15d-PGJ

2 er en kendt PPARy agonist, men vi fandt, at induktion af celledød i begge celletyper var PPARy-uafhængig som forbehandling med den irreversible PPAR antagonisten GW9662 ikke vende virkningerne af 15d-PGJ

2 hverken i vildtype (fig. 1B) eller hos resistente (fig. 1C) cellelinier. Endvidere fandt vi, at 15d-PGJ

2 induceret apoptose i både vildtype- og doxorubicin-resistente celler gennem aktivering af caspase-vejen som caspase-3/7 enzymaktiviteter blev væsentligt induceret af 15d-PGJ

2 i disse celler efter 5,5 h inkubation (fig. 1D). Selvom A2780 /AD (resistente celler) var lidt mere følsomme 15d-PGJ

2 i celleviabilitetstest, der var lidt lavere induktion af caspase-aktivitet i disse celler sammenlignet med A2780-celler, hvilket indikerer deltagelse af caspase-uafhængig assays. Induktionen af ​​apoptose i disse celler blev også bekræftet med annexin V-farvning, en markør for tidlig apoptose. Vi fandt, at begge celletyper blev positive for annexin V-farvning (grøn farve) efter behandlingen med 15d-PGJ

2, og antallet af positive celler blev forøget ved højere koncentrationer i begge cellelinjer (fig. 1E).

(A) doxorubicin dræbt A2780 cellerne fuldstændigt ved 5 uM henviser A2780 /AD-celler var meget modstandsdygtig over for doxorubicin. I modsætning hertil 15d-PGJ

2 induceret celledød i både vildtype A2780 (B) og doxorubicin-resistente A2780 /AD (C) cellelinier dosisafhængigt efter 48 timer. Disse virkninger var ikke PPARy afhængige som præ-inkubering med en irreversibel PPARy antagonist GW9662 (10 uM) ikke blokere disse effekter. Data er præsenteret som% af kontrol, som blev beregnet ved at antage ubehandlede celler 100% levedygtige som bestemt ved Alamar Blue-assay. (D) 15d-PGJ

2 forstærket caspase 3/7 enzymer aktivitet (ved t = 5,5 timer) i begge celletyper i en koncentrationsafhængig måde. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM af gennemsnittet af mindst 3 separate eksperimenter. Forskelle versus kontroller vises som *

s

0,05, **

s

0,01. (E) Repræsentative mikrofotografier viser annexin V-farvning (grøn farve), en indikator for apoptose induktion, i A2780 og A2780 /AD cellelinier efter behandlingen med 15d-PGJ

2-koncentration-afhængigt. DAPI-farvning (blå farve) angiver det samlede antal celler. Forstørrelse, 200 ×. Kasserne viser billeder mere forstørrelse på 480 ×.

15d-PGJ

2 inducerer apoptose ved at hæmme NF-KB-pathway

Siden apoptose induceret af 15d-PGJ

2 var PPARy-uafhængig, undersøgte vi inddragelse af NF-KB-vejen, en vigtig regulator af celleoverlevelse og proliferation, i A2780 og A2780 /AD-celler ved anvendelse af NF-KB luciferase reporter assay. Vi inducerede NF-KB-aktivitet i disse celler med human rekombinant TNF-α som er en direkte aktivator af NF-KB-vejen. Vi fandt, at behandling med TNF-α (100 ng /ml) signifikant forbedret NF-KB-aktivitet i begge celletyper, men mere udtalt i A2780 (13-fold) sammenlignet med A2780 /AD (6,0 gange) (fig. 2A) . Behandling med 15d-PGJ

2 reducerede signifikant basal og TNF-α-induceret NF-KB-aktivitet i begge celletyper i en koncentrationsafhængig måde (Fig 2B og 2C). Men de hæmmende virkning var stærkere i A2780 /AD end A2780 som kan blive bemærket på 2,5 og 5,0 uM koncentrationer. Disse data indikerer, at apoptose-inducerende virkninger af 15d-PGJ

2 blev medieret gennem NF-KB-vejen. Desuden har PPARy agonist ciglitazon ikke hæmme den basale NF-KB-aktivitet ved 10 uM koncentration, men kun ved højere koncentrationer. I yderligere eksperimenter med ciglitazon derfor brugte vi koncentrationer, der inducerer kun PPAR-specifikke effekter (EF

50 = 3,0 uM) [12] og ikke NF-KB-medierede virkninger. Et velkendt NF-KB-specifik inhibitor, dvs. BAY-11-7082 inhiberede NF-KB-aktivitet i begge celletyper Tilsvarende og denne inhibitor blev anvendt i yderligere forsøg for at bestemme virkningen af ​​NF-KB-inhibering i disse celler.

for at måle NF-KB-aktivitet blev begge A2780 og A2780 /AD-celler transient transficeret med et plasmid indeholdende NF-KB-promotoren med en luciferase reporter element (pnf-KB-Luc) i 24 timer. Efter 24 timer, 15d-PGJ

2, ciglitazon eller BAY-11-7082 blev inkuberet med og uden TNF-α i 4 timer og derefter luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse af et luminescens-assay til bestemmelse af NF-KB-aktivitet. (A) The NF-KB-vejen aktivator, TNF-α (100 ng /ml), inducerede NF-KB-aktivitet i begge celletyper selvom stigningen var højere i A2780 celler. Behandling med 15d-PGJ

2 signifikant inhiberede NF-KB-aktivitet i både A2780 (B) og A2780 /AD-celler (C), som var mere udtalt i TNF-α-aktiverede celler. Ciglitazon inhiberede NF-KB ved højere koncentrationer eller i TNF-a-aktiveret A2780 /AD-celler. BAY-11-7082 inhiberede NF-KB-aktivitet i begge celletyper med lignende effekt. Data viser gennemsnittet af mindst 3 separate eksperimenter. Statistiske forskelle versus de respektive kontroller vises som *

s

0,05 og **

s

. 0,01

15d-PGJ

2 reducerer mRNA ekspression af Bcl-2, Bcl-xl, MDR1 og SIRT1

Efter genekspression analyser, fandt vi, at A2780 /AD-celler havde væsentlig induktion af anti-apoptotiske gener, såsom Bcl-2 (120- fold) og Bcl-xl (2 gange) sammenlignet med ikke-resistente A2780-celler (fig. 3A). Behandling med lave koncentrationer af 15d-PGJ2 (1,0 og 2,5 uM) i 48 timer reducerede Bcl-2 og Bcl-xl ekspressionsniveauer i A2780 /AD stærkere end i A2780-celler (fig. 3A), som også kan forklare den højere celledræbende potens i A2780 /AD-celler. Disse virkninger var ikke på grund af PPARy-agonistisk aktivitet eller NF-KB inhibitoriske virkninger af 15d-PGJ

2 som den velkendte PPARy agonist ciglitazon og selektiv NF-KB inhibitor kun havde mindre virkning sammenlignet med 15d-PGJ

2 (fig. 3A).

(A) A2780 /AD-celler havde en højere genekspression af Bcl-2 og Bcl-xl forhold til A2780-celler. Virkninger af 15d-PGJ

2, ciglitazon og BAY-11-7082 om blev bestemt af genekspression efter 48 timers inkubation i begge celletyper. A2780 /AD-celler havde også højere ekspression af MDR1 (B) og SIRT1 (C) sammenlignet med A2780-celler. MDR1 genekspression var ikke påviselig (ND) i A2780 celler. Virkninger af 15d-PGJ

2, ciglitazon og BAY-11-7082 om MDR1 udtryk blev bestemt kun A2780 celler (B), mens effekten på SIRT1 udtryk blev målt på begge celletyper (C). Data repræsenterer gennemsnit ± SEM i mindst 3 eksperimenter. Statistiske forskelle versus de respektive kontroller vises som *

s

0,05 og **

s

. 0,01

Desuden fandt vi, at der var en opregulering af multiresistens (MDR1) og klasse-III HDAC sirtuin-2 homolog (SIRT1) mRNA-ekspression i doxorubicin-resistente A2780 /AD-celler sammenlignet med vild-type A2780-celler (fig. 3B og 3C). MDR1-niveauer i A2780 celler var under detektionsniveauet. Interessant, behandling med 15d-PGJ

2 hæmmede markant MDR1 udtryk i de resistente celler, og disse effekter blev sandsynligvis tilskrives dens NF-KB hæmmende effekter som BAY-11-7082 hæmmede også udtrykket, hvorimod ciglitazon havde nogen effekt (fig. 3B). 15d-PGJ

2 hæmmede også SIRT1 udtryk i begge celletyper, men disse hæmmende effekter blev ikke set med BAY-11-7082 (fig. 3C). På den anden side, ciglitazon reducerede SIRT1 ekspression kun i A2780 /AD hvor SIRT1 niveauer blev forhøjet.

15d-PGJ

2 inhiberer sårheling proces

Da kemoterapeutiske resistente celler kan har forskellig adfærd migration end sin vildtype-version, vi desuden undersøgt effekten af ​​induceret resistens på disse parametre ved hjælp af

in vitro

sårheling assay. Assayet måler typisk migration af celler ved måling af lukning af et standard ridse i tid. Vi fandt, at A2780 /AD-celler havde signifikant langsommere migration end A2780 celler (Fig. 4A og 4B). 15d-PGJ

2 reducerede migration af begge celletyper i en dosisafhængig måde (fig. 4C). Selvom 15d-PGJ

2 reducerede cellelevedygtigheden i A2780 /AD-celler ved 2,5 uM koncentration (Fig. 1C), vi ikke se celledød i disse forsøg, som kan være på grund af sammenflydende cellelag anvendt i disse eksperimenter. Vi fandt tidligere, at i konfluent cellelag 15d-PGJ

2 havde ingen virkning på cellelevedygtigheden af ​​A2780 /AD (data ikke vist). Fravær af celledød i disse forsøg fremgår også i de repræsenterede billeder (Fig. 4A). De hæmmende effekt på sårheling blev også set med BAY-11-7082, men ikke med ciglitazon angiver effekten af ​​15d-PGJ2 kan skyldes dets NF-KB hæmmende effekter.

For at bestemme virkningerne af 15d- PGJ

2 på cellemigration blev et sårhelende assay udført på A2780 og A2780 /AD-celler som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. (A) Repræsentative billeder, der viser bunden (sår) ved t = 0 timer og t = 48 h med /uden forskellige behandlinger. Et mærke (visualiseret i billederne på den øvre eller nedre side) anbringes til at lokalisere det samme område på bunden, billeder blev fremstillet under anvendelse af et omvendt mikroskop og det åbne areal blev beregnet til de angivne tidspunkter. Forstørrelse, 40 ×. (B) Grafen viser% sårheling i A2780 og A2780 /AD-celler uden behandlinger. A2780 celler havde højere migration sats sammenlignet med A2780 /AD-celler. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM for 3 forskellige eksperimenter. **

s

0,01 versus A2780 /AD. (C) Behandling med 15d-PGJ

2 og BAY-11-7082 hæmmede sårheling respons efter 48 h inkubation mens ciglitazon ikke viste nogen hæmmende effekt. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM for 3 forskellige eksperimenter. *

s

0,05 og **

s

. 0,01 versus værdier ved t = 0 h

Effekt af 15d-PGJ

2 på cellemorfologi

i inkubationer med 15d-PGJ

2, bemærkede vi, at cellerne blev omdannet til udvidet og aflange celler. Denne fænotypiske ændring var mest fremtrædende synlige i DOX-resistente A2780 /AD-celler. Disse celler blev oprindeligt afrundet og skrumpet, men efter transformation de opnået mere cytoplasma med distinkte cellulære grænser og viste et skin af epitelial-lignende struktur (fig. 5A). Behandling med ciglitazon eller BAY-11-7082 inducerede ingen ændring i cellemorfologi ikke indikerede rolle PPARy og NF-KB pathways. Da det blev rapporteret i litteraturen, at HDAC inhibitor Trichostatin A kunne transformere ovariekarcinomceller [13], behandlede vi cellerne med trichostatin A og fandt, at cellerne fik transformeret på samme måde som med 15dPGJ

2 (fig. 5A ). Selv A2780 celler også set mere strakt med 15d-PGJ

2 og trichostatin A, forskelle versus kontrol celler var ikke store (fig. 5B).

(A) Repræsentative billeder, der viser ændringen i celle morfologi A2780 /AD efter inkubation med 15d-PGJ

2 (2,5 uM) og trichostatin A (70 nM). I modsætning hertil andre behandlinger såsom ciglitazon og BAY-11-7082 ikke påvirke morfologi. Pile pege på de transformerede celler, der var mere cytoplasmaet og epitelceller struktur. Forstørrelse, 200 × (B) Repræsentative billeder af A2780 celler efter inkubation med forskellige behandlinger. Behandling med 15d-PGJ

2 (2,5 uM) og trichostatin A (70 nM) førte til en klar stigning i cytoplasmaet. Forstørrelse, 200 × (C) Forholdet mellem snegl til e-cadherin genekspression i A2780 og A2780 /AD-celler. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM for 3 eksperimenter.

Da omdannelsen af ​​celler kan være relateret til epitel-mesenkymale overgang (EMT) proces, vi undersøgte udtryk for sneglen og e-cadherin udskrifter og fandt, at forholdet mellem snegl til e-cadherin blev forøget i begge celletyper efter udsættelse af 2,5 uM 15d-PGJ

2 selvom forskellene ikke var statistisk signifikante. Disse data indikerer, at ændringer i cellemorfologi fremkaldt af 15d-PGJ

2 kan skyldes induktion af EMT-processen.

15d-PGJ

2 hæmmer HDAC 1, 2 og 3 mRNA udtryk

Da transformation celle virkninger af 15d-PGJ

2 blev også induceret af HDAC-hæmmer, vi undersøgte effekten af ​​15d-PGJ

2 på HDAC i begge celletyper. Først, sammenlignede vi mRNA-niveauer af HDAC1, 2 og 3 i A2780 og A2780 /AD-celler og fundet, at HDAC2 var signifikant nedreguleret i de resistente celler sammenlignet med vildtypeceller (fig. 6A). Behandling med 15d-PGJ

2 inhiberede HDAC1, 2 og 3 mRNA udtryk i begge celletyper dosisafhængigt (fig. 6B og 6C). Virkningerne var mest udtalt i resistente celler. Disse hæmninger blev ikke fundet med ciglitazon og BAY-11-7082, men der var en stigning i HDAC1 udtryk efter NF-KB-hæmning med BAY-117.082.

(A) Real-time qPCR data viser forskellene mellem de basale genekspressionsniveauer af HDAC 1, 2, og 3 i A2780 og A2780 /AD-celler. **

s

0,05 versus A2780 celler. Virkningen af ​​forskellige behandlinger på HDAC-gener blev bestemt i A2780 (B) og A2780 /AD-celler (C) efter 48 h inkubation. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM for 3 separate forsøg. Statistiske forskelle versus de respektive kontroller vises som *

s

0,05 og **

s

. 0,01

15d-PGJ

2 hæmmer SIRT1 og HDAC enzymer aktiviteter på grund af sine elektrofile kulstofatomer

Da vi fandt, at 15d-PGJ

2 kunne hæmme genekspressionen af ​​SIRT1 og andre HDAC’er, vi spekulerede på, om 15d-PGJ

2 var i stand til at hæmme disse enzymaktiviteter direkte. Vi anvendte en p53-sekvens-baserede substrat (Arg-His-Lys-Lys (e-acetyl) -AMC) assay til bestemmelse SIRT1 aktivitet og for HDAC1 vi anvendte en acetyleret lysin substrat-baseret assay. For at finde, om C9 elektrofile carbonatom er ansvarlig for aktiviteten, vi medtaget 15d-PGJ

2 analog CAY-10410, der mangler elektrofilicitet ved C9 (fig. 7A). Vi fandt, at 15d-PGJ

2 inhiberede SIRT1 aktivitet dosisafhængigt med op til 71% inhibering hvorimod CAY-10410 kun viste kun moderat inhibering af 23% mens ciglitazon viste ingen hæmning overhovedet (fig. 7B). I HDAC1 enzymassay, 15d-PGJ førte

2 til 40% inhibering, men CAY-10410 og ciglitazon viste ikke nogen inhibering (fig. 7C). Salg

(A) Kemiske strukturer af 15d-PGJ

2 (15-deoxy-Δ

12,14-Prostaglandin J

2) og dets analog CAY-10410 (9,10-dihydro-15-deoxy-Δ

12,14-Prostaglandin J

2). Asterisk angiver de elektrofile carbonatomer, der kan være involveret i Michael-additionsreaktion. Panel (A) og (B) viser koncentrations–afhængige effekter af 15d-PGJ

2, CAY-10410 og ciglitazon på deacetylase aktivitet SIRT1 og HDAC1 henholdsvis bruger

in vitro

enzymassays.

# P 0,01 versus ciglitazon,

† p 0,05 og

†† p 0,01 versus CAY-10410. (D) Effekt af CAY-10410 på cellelevedygtigheden af ​​A2780 og A2780 /AD-celler som målt med et Alamar Blue-assay. (E) Behandling med CAY-10410 (2,5 uM) inducerede ikke celletransformation efter 48 timers inkubation. Forstørrelse, 200 ×.

Vi derefter undersøgt, om virkningerne af 15d-PGJ

2 blev vist på grund af C9 elektrofile atom, vi testede effekten af ​​CAY-10410, mangler elektrofilicitet på C9 carbonatom, på cellernes levedygtighed og transformation. Vi fandt, at CAY-10410 gjorde hverken fremkalde nogen celledød eller transformation af cellerne (fig. 7d og 7e).

Discussion

I den foreliggende undersøgelse, vi har vist virkningerne af 15d -PGJ

2, et produkt fra cyclooxygenase-aktivitet og som en endogen PPARy agonist, på apoptose, lægemiddelresistens, cellevandring og transformation af cancerceller. Vi undersøgte virkningerne på vildtype såvel som doxorubicin-resistente ovariecancerceller.