PLoS ONE: Perifer Immun Cell Gene Expression Forudsiger Overlevelse af patienter med ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Forudsigelse af kræft tilbagefald hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) i øjeblikket er afhængig af vurderingen af kliniske karakteristika, herunder alder, tumor stadie, og rygevaner. En bedre forudsigelse af patienter stadie kræft tidligt med dårligere overlevelse og sene stadie patienter med bedre overlevelse er nødvendig for at designe patient-skræddersyet behandling protokoller. Vi analyserede genekspression i RNA fra perifere mononukleære blodceller (PBMC) i NSCLC-patienter til at identificere signaturer prædiktive af gennemsnitlige patientoverlevelse. Vi finder, at PBMC genekspression mønstre fra NSCLC patienter, ligesom mønstre fra tumorer, har oplysninger forudsigende af patientresultater. Vi identificerer og validere en 26 gen prognostisk panel, der er uafhængig af klinisk fase. Mange yderligere prognostiske gener er specifikke for myeloide celler og er mere stærkt udtrykt i patienter med kortere overlevelse. Vi observerer også, at et betydeligt antal prognostiske gener ændrer ekspressionsniveauer i PBMC opsamlet efter tumor resektion. Disse post-kirurgi genekspression profiler kan være et middel til at revurdere prognose over tid. Disse undersøgelser antyder endvidere, at patientresultater ikke udelukkende bestemt af tumor genekspression profiler, men kan også være påvirket af immunresponset, som afspejles i perifere immunceller

Henvisning:. Kossenkov AV, Dawany N, Evans TL, Kucharczuk JC, Albelda SM, Showe LC et al. (2012) Perifere Immune Cell Gene Expression Forudsiger Overlevelse af patienter med ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (3): e34392. doi: 10,1371 /journal.pone.0034392

Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal

Modtaget: 16. december 2011; Accepteret: 27 februar 2012; Udgivet: Marts 29, 2012 |

Copyright: © 2012 Kossenkov et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Pennsylvania Department of Health Tobacco Settlement tilskud (SAP 4100020718); Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement Program; Wistar Cancer Center Support Grant (P30 CA010815); National Institutes of Health (K07 CA111952) til A.V. og (T32 CA 09.171) til A.V.K. Projektet brugte Wistar Institute Genomics og bioinformatik faciliteter understøttes af Wistar Cancer Center Support Grant (P30 CA010815). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige årsag til dødelighed af kræft på verdensplan, der tegner sig for 157,300 kræftdødsfald i USA alene i 2010 [1]. Den samlede fem-års overlevelse for lungekræft er 16%, og prognosen er stærkt forbundet med sygdommen scenen på diagnose [2]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for 80% af alle tilfælde af lungekræft.

behandlingsprotokoller og prognostiske vurderinger af patienter med NSCLC er primært baseret på TNM stadie. Kirurgisk resektion for tidligt stadie sygdom (fase I, II, og nogle trin III) forbliver standarden for pleje. Desværre vil 30-60% af patienterne (afhængigt af scenen) udvikle en gentagelse og dø af deres sygdom, der fører til en 5-års overlevelse på 35-70% for patienter efter resektion. Der er klart et udækket behov for yderligere prognostiske faktorer for en mere informeret proces med behandling.

Der er betydelig heterogenitet i kliniske resultater for patienter med tidlig fase NSCLC og grundlaget er ukendt. Adskillige tidligere studier fokuserede på genekspression i kirurgisk udskårne tumorer at identificere prognostiske underskrifter blev for nylig revideret [3], [4]. Ingen er endnu godkendt til klinisk anvendelse.

Vi har tidligere vist, at patienter med NSCLC har betydelige genekspression ændringer i deres PBMC som giver nyttige diagnostiske markører (5), og denne PBMC kræft signatur formindskes eller elimineres i en undergruppe af patienter gentestet efter tumorresektion [5]. Da ændringerne i PBMC-genekspression er en afspejling af interaktionerne mellem tumoren og immunsystemet, har vi nu analyseret vores genekspression data og demonstrere en signatur forbundet med den samlede overlevelse. Vi viser også, at nogle PBMC gener forbundet med overlevelse ændre deres udtryk i prøver udtaget efter tumor resektion og kan give en ekstra indikator for tilbagefald.

Materialer og metoder

studiepopulation

i alt 137 patienter med nyligt diagnosticeret, histopatologisk bekræftet, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) blev rekrutteret fra University of Pennsylvania Medical center i perioden 2003 til 2007. skriftlig informeret samtykke blev modtaget fra alle deltagere, der er involveret i undersøgelsen og prøver blev indsamlet med godkendelse af både University of Pennsylvania IRB og Wistar IRB. Til denne analyse blev kun emner med trin I-IIIA NSCLC, som gennemgik kirurgisk resektion med helbredende hensigt inkluderet. Eksklusionskriterier inkluderet sub-lobar resektion, positive resektionsmarginer og død inden for 30 dage kirurgi. Dette resulterede i inddragelsen af ​​108 emner i denne analyse (tabel S1). Alle deltagere havde blodopsamling før kirurgi og 15 af de 108 patienter havde også blod opsamlet efter operationen. Tabel 1 opsummerer de vigtigste prognostiske parametre som identificeret af National Cancer Comprehensive Network (NCCN) for vores undersøgelse befolkning. Klinisk resultat og overlevelse oplysninger blev indhentet via diagram review, telefonkontakt, eller fra Social Security Død Index (SSDI).

PBMC Indsamling og behandling

Blodprøver blev trukket på University of Pennsylvania Medical center i to “CPT” rør (Becton Dickinson). Perifere mononukleære blodceller (PBMC) blev isoleret inden for 90 minutter blodudtagning, vasket i PBS, overført til RNAlater (Ambion), og derefter opbevaret ved 4 ° C natten over før overførsel til -80 ° C. RNA oprensning blev udført ved hjælp af TriReagent (Molecular Research), som anbefalet, og kontrolleret for kvalitet ved hjælp af Bioanalyzer. Kun prøver med 28S /16S forhold mellem 0,75 blev anvendt til yderligere undersøgelser. En konstant mængde (400 ng) af total RNA blev forstærket, som anbefalet af Illumina, for genekspression analyse.

Microarray forbehandlingsfasen

Prøverne blev behandlet og hybridiseret til Illumina WG-6v2 menneskelige helhed genom perle arrays. Alle arrays blev forarbejdet på Wistar Institute Genomics faciliteten som beskrevet tidligere [6] og derefter genekspression værdier var log

2 transformeres til yderligere analyse. Array data, der anvendes til disse undersøgelser er offentligt tilgængelige i GEO-databasen gennem tiltrædelsen nummer GSE13255. Tabel S1 viser de 108 forsøgspersoner, der anvendes til analyse.

statistiske metoder

Risk faktoranalyse.

univariate Cox regressionsanalyse blev udført for at teste sammenslutning af risikofaktorer og individuelle kliniske genekspression med samlede overlevelse. Multivariat Cox regression blev anvendt til at teste sammenslutning af en kombination af faktorer. Statistisk signifikans blev defineret som

P

0,05. Falsk opdagelse sats for gen sammenhæng med den samlede overlevelse blev bestemt i henhold til Storey et. al. [7]. Foreningen af ​​samlede overlevelse med tumor fase blev udført både ved at behandle etape som en kontinuerlig variabel og som to grupper: trin I og en kombineret fase II plus III. Resultaterne var signifikant for begge tilgange med univariate og multivariate regressionsanalyser. Da antallet af fase II tumorer var lille (14 patienter) og endnu mindre, når data blev opdelt i uddannelse og uafhængige validering sæt, besluttede vi at kombinere fase II og III til at have en større gruppe størrelse i valideringen trin. Vi brugte en kombination af fase II og III i hele manuskriptet til konsistens.

Kaplan-Meier kurver.

Kaplan-Meier kurver blev plottet ved hjælp af Matlab v7.2 baseret på censurerede overlevelsesdata. Patienterne blev stratificeret efter faktor median medmindre andet er angivet. Udvælgelse

Gene panel.

For at identificere et sæt af gener, der er forbundet med den samlede overlevelse vi delt 108 prøve datasæt i uddannelse og afprøvning sæt af samme størrelse (54 stikprøver i hver). Sættet træning blev først analyseret for at identificere en resultatorienteret informativ gen panel ved at identificere prober med det laveste gennemsnitlige univariate Cox regression p-værdi på tværs 50 tests af 40 stikprøver (75% af træningssættet). De 100 gener blev derefter anvendt til multivariate Cox regression med L1 og L2 straffes skøn [8]. Den endelige λ1 og λ2 hyperparameter valgte par gav den bedste ydelse med 10-fold krydsvalidering på træningssættet. Denne metode resulterer i en model bestående af N-gener, der har ikke-nul regressionskoefficienter c

1 … c

N. Disse koefficienter sammen med tilsvarende genekspression data for enhver patient

i

(X

1i … X

Ni) blev anvendt til at beregne et gen prognostisk score (GPS) for patienten som følger: GPS = c

1X

1j + … + c

NX

Nj.

Uafhængig validering af prædiktive gen panel.

de 54 patienter udtagning og ikke anvendes til prædiktiv gen selektion blev anvendt som en uafhængig test sæt til evaluering af modellen udviklet på træningssættet. Betydningen af ​​de GPS som en prognostisk faktor på den eksterne validering sæt blev estimeret ved univariate Cox regression. Uafhængighed af GPS og Stage faktorer blev testet af multivariat Cox regression.

Test robusthed udvælgelse genet panel.

For at vise, at betydningen af ​​uafhængig validering (ydeevne) af GPS model på test sæt ikke afhænge af den særlige uddannelse-test data split, vi udførte 100 tilfældige splittelser og viste kvaliteten af ​​adskillelsen mellem patienter med lav og høj risiko i test sæt er uafhængig af nogen bestemt data split. (Figur S1)

Test effekten af ​​prognostiske indikatorer.

Effekten af ​​de prognostiske indikatorer blev testet ved at sammenligne hazard ratio og konkordanser. Hazard ratio blev beregnet mellem høj og lav risikogrupper. Overensstemmelse blev estimeret ved hjælp af R-pakken

clinfun

[9].

Gene berigelse analyse.

Test for biologiske funktioner og veje overrepræsenterede i et gen Listen blev gjort ved hjælp DAVID software [10] med tærskler på falsk opdagelse sats (FDR) FDR 20% og berigelse 2 gange. For et gen liste med høj falsk opdagelse sats (52% for 1704 gener forbundet med samlet overlevelse) vi rapporterer kun resultater, der passerer en tærskel på FDR 1% og også vise betydelig berigelse af GSEA algoritme [11], [12] med FDR . 25% cutoff

Berigelse af immuncelle-type specifikke gener

Vi opnåede en liste af gener specifikt udtrykkes i 8 kategorier af immune celletyper, herunder T-celler, B-celler, NK. celler, dendritiske celler, monocytter, neutrofiler, Lymfeceller og myeloide celler, fra immunrespons i Silico (IRIS) database [13], [14]. Vi testede hvis disse gener blev overrepræsenteret i vores liste over 1704 gener væsentligt forbundet med samlede overlevelse. Vi brugte Fisher Exact test for hver celletype i 3 forskellige grupper af gener separat: 1) alle signifikant associeret med samlet overlevelse, 2) gener med betydelig HR 1 og 3) gener med betydelig HR 1. Samlet set blev 24 tests (8 celletyper × 3 gen grupper) udføres, og vi rapporterer p-værdier korrigeret for flere test med Bonferroni korrektion.

Gene overlapper.

Betydningen af ​​overlapning mellem to grupper af gener (med A og B antal gener) udvalgt fra samme pulje af C = 20,341 udtrykte gener blev testet under anvendelse af hypergeometric test. Det forventede antal overlappende gener blev beregnet som (A × B) /C.

Resultater

Foreningen af ​​samlede overlevelse med kliniske risikofaktorer

Forskellige faktorer blev testet for association med overlevelse af univariate Cox regression, herunder tumor stadie, alder, køn, race, tilstedeværelse af KOL, tumor histologi, rygning og adjuverende kemoterapi (tabel 1). Vi fandt, at to faktorer, fremskreden alder og tumor stadie, var signifikant forbundet med overlevelse med hazard ratio på 1,04 pr år stigning og 2,49 for tumor fase henholdsvis. Figur 1 viser Kaplan-Meier-kurver for de to faktorer. Når disse to variabler blev testet sammen i en multivariat Cox regressionsmodellen, begge forblev statistisk signifikant (tabel 1) indikerer, at de uafhængigt forbundet med overlevelse i vores undersøgelse befolkningen, og at vores datasæt overensstemmelse med forudsagte markører for klinisk prognose.

Forudsigelse af den samlede overlevelse af et panel af PBMC gener

for at identificere og uafhængigt validere en kompakt gen panel, der kunne bruges til at forudsige den samlede overlevelse, vi delte vores 108 prøver i 2 tilfældigt udvalgte grupper af 54 prøver. Vi brugte en uddannelse sæt af 54 prøver at vælge den prognostiske gen panel, og derefter bekræftet sin nytte på de resterende 54 prøver forbeholdes som en test sæt. Vi anvendte multivariate Cox regression med L1 og L2 straffes skøn [8] til træningssættet, og identificeret 26 gener (tabel 2), hvis ekspression mønstre, når kombineret i en lineær model, bedst forudsagde de observerede overlevelsesdata. For hvert emne, denne model giver en Gene Prognostisk Score (GPS), der beregnes som en lineær kombination af udtrykket værdierne af de 26 prognostiske gener. GPS tildelt hver patient viste sig at være signifikant associeret med hans overlevelse for de 54 emner i uddannelsen sæt med

P

= 3 × 10

-5. Forestillingen blev bekræftet på validering sæt (

P

= 0,009), viser, at PBMC afledt GPS er en statistisk signifikant prædiktor for samlet overlevelse på nye patienter. Kaplan-Meier-kurver for patienter fra validering sæt og deres opgaver i enten en høj risiko eller lav risiko kategori baseret på medianen GPS er vist i figur 2A. Disse undersøgelser viser, at PBMC ekspressionsniveauerne for de 26 genprober udviklet på vores træningssæt også med held kunne forudsige overlevelse i valideringen sæt og dermed, om eventuelle nye patienter.

A. Kaplan-Meier-kurver for patienter fra testen sæt stratificeret af medianen af ​​GPS beregnet ud fra udtryk for 26 gener. p-værdi for univariate Cox regression er vist. B. Kaplan-Meier kurver sammenligner overlevelsessandsynligheder for patienter fra test sæt stratificeret af Stage alene og kombinationen af ​​Stage og GPS med 35 patienter i den nederste gruppe risiko (antal trin I patienter) og 19 større gruppe risiko (antal fase II /III-patienter).

genekspression og tumor stage data er uafhængige prædiktorer for overlevelse

vi yderligere vurderet, om de GPS leveres ekstra værdi til de faktorer, kliniske risikofaktorer for overlevelse vi havde testet. Af disse blev kun alder og tumor stadie sig at have betydelige prognostiske værdier for vores datasæt. Selvom alder var signifikant associeret med overlevelse i analyse ved hjælp af alle 108 patienternes oplysninger (Tabel 1), det ikke har væsentlig prognostisk værdi, når den anvendes på prøve sæt af 54 prøver (

P

= 0,34). Derfor har vi ikke inkluderer alder variabel i de følgende analyser.

På baggrund af data fra validering sæt, scenen prædiktor alene genererede en hazard ratio på 3,0 (

P

= 0,0095, 95% CI på 1,3 til 6.9). Når det bruges i multivariat Cox regressionsmodellen, både Stage og GPS var signifikant (

P

= 0,004 for scenen og

P

= 0,003 for GPS), hvilket indikerer, at de to variable er uafhængige prædiktorer for samlet overlevelse og at bruge dem sammen skulle øge prognostisk effekt. For at vurdere denne stigning, vi så sammenlignet hazard ratio for scenen alene var hazard ratio for de kombinerede Stage + GPS faktorer. Stage alene opdelt patienter i 19 patienter med højere risiko (antallet af fase II /III-sager) og 35 patienter med lavere risiko (antallet af trin I tilfælde).

.Den kombineret Stage + GPS prædiktor resulterede i en signifikant hazard ratio på 4,9 (

P

= 0,0003, 95% CI på 2,1-11,4) mellem høj og lav risikogrupper, en stigning i forhold til hazard ratio vist ved Stage prædiktor alene (HR = 3,0) eller GPS prædiktor alene (HR = 1,9). Dette illustreres af Kaplan-Meier-kurver (figur 2B).

Alternative kvantificering af evnen af ​​genekspression score for at forbedre prognosen for overlevelse blev udført ved at bestemme konkordans indekset for Cox regression model for scenen alene : 0,63 (0,56 til 7,0), GPS alene: 0,57 (0,51-0,62), og scene + GPS: 0,69 (0,62 til 0,76). Stigningen i konkordans indeks sammen med dokumentation for uafhængigheden af ​​de to faktorer støtter nytten af ​​at anvende både de scores scenen og genekspression at bestemme sandsynligheden for overlevelse sammenlignet med kun at bruge scenen. Dette resultat viser, at en genekspression score kan føje prognostisk information til den traditionelle tumor fase variabel.

Tilføjelse GPS faktor til klassificeringen af ​​scenen resulterede i omfordeling af 6 patienter mellem høje og lave risikogrupper. Tre af de seks med trin I NSCLC (en IA og to IB patienter) blev omfordelt til risikogruppe høj. To af disse patienter faktisk døde inden for 18 måneder (p1240, scene IB) og 43 måneder (p1183, stadie IA) af prøvetagningen. Den ekstra 1B patient (p1246) forblev i live i mindst 65 måneder. Denne person var en af ​​de yngste patienter i vores kohorte (kun 47 i forhold til 45 år minimumsalder). Inddragelse af alder faktor i modellen kunne have ændret opgave til risikogruppe høj. De 3 andre patienter havde stadium II NSCLC. De blev klassificeret af scenen som høj risiko og derefter overført til gruppen lav risiko, når du tilføjer GPS faktor. Alle tre af patienterne (p1589, p1561 og p1445) var i live på tidspunktet for status vurdering (44, 46 og 56 måneder tilsvarende). Disse resultater understøtter anvendeligheden af ​​en kombineret GPS + scene model for mere præcis estimering af prognose.

PBMC gen funktioner i forbindelse med den samlede overlevelse

For at afgøre, om bestemte funktioner eller veje var repræsenteret i PBMC genekspressionsmønstre forbundet med overlevelse, anvendte vi univariate Cox regression for at identificere de gener, der var signifikant associeret med resultatet ved hjælp af alle 108 patientprøver. Vi fandt 1704 sonder, der viste signifikans på

P

0,05 og screenet disse sonder for beriget funktioner og veje ved hjælp af både DAVID og GSEA software. Denne analyse afslørede flere højt signifikante funktionelle kategorier med berigelse af 2 gange eller mere (Tabel S2). Især en liste over 32 ribosomale struktur og funktion-relaterede gener (berigelse på 2,3) havde højere udtryk hos patienter med bedre overlevelse, mens cellecyklus gener i almindelighed (berigelse på 2,3) og specifikt M fase gener (berigelse på 2,2) var overvejende udtrykt på lavere niveauer i patienter med bedre overlevelse.

Immune celletyper forbundet med overlevelse

Da genekspression blev analyseret på PBMC mRNA, vi fastslået, om de gener, signifikant associeret med overlevelse var også specifikke for en bestemt immun celletype som defineret af immunresponset in silico (IRIS) database [13], [14]. Af de 669 immune cellespecifikke gener i vores datasæt, blev 79 fundet at være associeret med samlet overlevelse (tabel 3). Vi fandt en signifikant berigelse af T-celle specifikke gener (23 helt, 8 fold overrepræsentation,

P

= 2 × 10

-8), med 15 af de 23 gener med HR 1 indikerer en signifikant sammenhæng mellem lavere niveauer af udtryk og forbedret overlevelse. Vi fandt også, at lavere udtryk for 21 myeloide specifikke gener (berigelse af 2 gange,

P

= 0,048) var forbundet med forbedret samlet overlevelse. Detaljerede lister over gener forbundet med hver celletype og tilsvarende berigelser og p-værdier er anført i tabel S3.

Tumor fjernelse ændrer udtryk for overlevelse-associerede gener

Vi har tidligere vist, at PBMC genekspression i nærværelse af en NSCLC ændres væsentligt i post-kirurgi PBMC prøver [5], [6]. Vi fandt, at ekspressionen af ​​mere end 20% (383) af de 1704 “overlevelse” gener screenet i denne undersøgelse også signifikant ændret af kirurgisk fjernelse af lungetumor (3485 gener med p-værdi 0,05 ved parret t-test , FDR 20%). Dette er en statistisk signifikant antal sammenlignet med 292-genet overlapning forventes tilfældigt (

P

= 10

-9 ved hypergeometric test). Vi identificerede 4 klasser af outcome-associerede gener (figur 3), der ændrer ekspressionsniveauer efter kirurgi. To af de grupper af gener (A og D) var signifikant overrepræsenteret og vi beskrive disse 2 klasser. Den største gruppe (gruppe A) på 236 gener har HR 1 (bedre overlevelse for højere udtryk) og nedreguleres i PBMC efter tumor fjernelse. Den anden gruppe (gruppe D) indeholder 92 gener med HR 1 (dårligere overlevelse med højere udtryk) blev opreguleret i PBMC efter tumor fjernelse. Disse prognostiske gener, der også ændrer udtryk, efter at svulsten er fjernet, kunne give en ny metode til bestemmelse af tilbagefald.

# obs. = Observerede antal gener; # Exp. = Forventede antal gener tilfældigt; Pre = udtryk i pre-kirurgi prøve; Post = udtryk i post-kirurgi prøve; HR = Hazard Ratio for høj vs lav ekspression af genet.

Funktionel berigelse analyse af gruppe A-gener viser stærk overrepræsentation af proteiner forbundet med ribosomer, proteinsyntese, mitokondrie-funktion, translationelle faktor aktiviteter og zink finger proteiner, karakteristika i overensstemmelse med PBMC være mere aktiv som svar på tilstedeværelse af tumor og tilsyneladende bedre for overlevelse. Gruppe D viser funktionel berigelse kun for gener associeret med røde cellefunktion muligvis indikerer lavere antal af cirkulerende Erytroblaster i nærvær af en tumor, men dårligere overlevelse med højere ekspression.

Diskussion

Evnen til præcist at identificere patienter med lungekræft, der har en dårlig prognose er især vigtigt for patienter med stadium i sygdom, der er kendt for at variere betydeligt i sandsynlighed for fornyet. Forudsigelse hvilke tumorer er mest sandsynligvis igen er afgørende for at designe behandling efter kirurgi, især til fase IA patienter, som ikke normalt får adjuverende kemoterapi. I øjeblikket er de mest effektive prognostiske indikatorer er demografiske karakteristika (patientens alder, køn, rygevaner) og kliniske parametre (tumorstørrelse fase og lymfekirtelinvolvering). En række genekspression undersøgelser af lungetumorer der præsenterer prognostiske algoritmer blev for nylig revideret [4]. En analyse [15] uddannet og godkendt på offentligt tilgængelige data beskriver en 5-gen prognostisk signatur for alle faser, herunder fase I adenocarcinom (men ikke planocellulært karcinom). Et spørgsmål med tumor studier har været manglen på reproducerbarhed, muligvis på grund af forskelle i prøven kvalitet og tumorceller repræsentation i prøverne. Metoder, der anvender blod eller serum for at identificere prognostiske indikatorer undgå nogle af problemerne forbundet med tumor variabilitet og microRNA udtryk profiler i serum eller plasma er blevet anvendt til både NSCLC diagnostisk [16], [17] og prognostiske undersøgelser med to grupper [18], [19]. Hu et al [19] ved hjælp af serum fra 243 patienter, fundet et prognostisk sæt af 4 miRNA som, når uddannet på halvdelen af ​​patienterne kunne forudsige overlevelse på den resterende halvdel. Begge grupper tyder på, at deres resultater vil tillade adskillelse af lav fra højrisikopatienter, forbedre prognosen ved alene fase.

Interaktioner mellem en tumor og immunsystemet har længe været genstand for interesse i kræft biologi [20]. Vi har tidligere fundet, at PBMC genekspression signaturer kunne skelne patienter med lungekræft fra patienter med ikke-maligne lungesygdomme. Undersøgelserne præsenteres her viser, at genekspression signaturer i de perifere immunceller af NSCLC patienter indeholder også oplysninger, der er korreleret med overlevelse og ligesom underskrifter opnået fra lunge tumorer, kan forbedre kliniske prædiktorer for udfaldet. I vores undersøgelse, vi identificerer et panel af 26 genprober hvis udtryk mønstre er signifikant associeret med overlevelse og denne information er uafhængig af oplysninger fra tumor fase. Vi viser også, at nogle gener korreleret med prognose er immune celle afstamning specifik. De mest iøjnefaldende ændringer var i de myeloide specifikke gener, som viser en omvendt korrelation mellem ekspression og overlevelse. Som vist i tabel S3, 29 af de 30 gener specifikt forbundet med monocytter, neutrofiler, eller “myeloide celler”, har stigninger i udtryk i patienter med nedsat overlevelsestid. Disse data er i overensstemmelse med observationer, at en stigning i umodne myeloide cellepopulationer i blod og i tumorer er forbundet med avancerede cancere og dårlig prognose, sandsynligvis på grund af disse cellers evne til at fremme angiogenese og til at undertrykke anti-tumor immunrespons [21] , [22], [23], [24]. Høje antal neutrofiler er blevet vist at være prædiktorer for dårlig prognose i melanom, ovariecancer og hoved- og halskræft [25]. Prognose-associeret T-celle gener har også overvejende højere hazard ratio, men den mekanisme, hvormed disse gener påvirker patientens overlevelse er endnu ikke klart.

Et betydeligt antal PBMC gener, der ændrer sig i udtryk efter fjernelse af en tumor er også forbundet med prognosen. Den største klasse (gruppe A, figur 3) indbefatter gener, som udtrykkes ved højere niveauer i nærvær af en tumor sammenlignet med prøver fra den samme patient taget efter fjernelsen tumor, og hvis højere ekspression indikerer bedre overlevelse. Den mest differentielt udtrykt gen i denne gruppe er immunresponset genet

CXCR4

, vigtig for lymfocyttrafik [26], [27]. Dens ligand,

SDF-1-service /

CXCL12

, er en nøglefaktor lede dendritiske celle migration er forbundet med en adaptiv immunrespons [27], [28] I modsætning hertil en anden stor gruppe af gener (gruppe D) viser den modsatte opførsel har høje hazard ratio om et ringe overlevelse funktion og lavere niveauer i nærvær af en tumor. DAVID analyse af dette gen klasse viser berigelse for gener væsentligt forbundet med funktioner af iltning, hypoxi og jern bindende (

HGBD

,

HGB1

,

HGB2

) og erythroide associeret faktor (

ERAF

). Disse er formentlig bestanddel Erytroblaster vides at co-oprenses med PBMC [29], [30]. Lavere ekspression af disse gener i tilstedeværelsen af ​​tumoren kan indikere, at erythroblast genekspression (eller erythroblast tal) undertrykkes i enighed med andre undersøgelser, som fattige iltning og anæmi er tidligere forbundet med lungekræft [31], [32]. Relativt højere ekspression af disse gener i patienter med dårligere overlevelse kan skyldes den øgede tilstedeværelse af Erytroblaster som reaktion på den forværrede oxygenering forbundet med mere alvorlig sygdom. Samlet, den betydelige overrepræsentation af gener fra gruppe A og D viser, at måling af ændringen af ​​disse gener mellem parret præ- vs post-kirurgi prøver fra den samme patient, kan afspejle immunsystemets evne til at reagere til tumoren, og kan tilføre information til resultatet forudsigelse ved at sammenligne prøver indsamlet før med prøver indsamlet efter tumor fjernelse. Desuden kan gener fra disse grupper være kandidater til at revurdere kræft gentagelse sandsynligheder i regelmæssige post-kirurgi blodprøver.

Brugen af ​​kombinerede prognostiske faktorer, herunder den kliniske fase, tumor genekspression underskrift og PBMC gen signaturer kunne give yderligere vejledning til ordination adjuverende kemoterapi for tidlige fase kræftformer, der i øjeblikket ellers ikke ville blive behandlet efter operationen. Vi finder, at genekspressionen fra patient PBMC er en uafhængig prædiktor for overlevelse, og at når PBMC genekspression er kombineret med oplysninger fra kræft fase er hazard ratio fra alene etape steget fra 3,0 til 4,9. Den begrænsede størrelse af datasættet har ikke tilladt testning for prognose inden for en enkelt kræft scene, men vi finder, at to fase I patienter er korrekt overført til risikoen gruppe på højt ved at kombinere GPS blod signatur med stadium baseret prognose.

udviklingen af ​​en malign tumor omfatter interaktioner mellem cancerceller og signalering med andre celler i tumormikromiljøet herunder immunceller. Vores undersøgelser tyder på, at disse interaktioner ikke kun lokaliseret til tumorstedet, men strækker sig også til den perifere immunsystem og at information relateret til prognose eller igen er til stede i genekspressionsprofilerne i randområderne immunceller. I modsætning til tumor-baserede prognostiske signaturer, der afspejler malignitet, PBMC baserede prognostiske signaturer afspejler typen og styrken af ​​immunreaktionen mod tumoren tilstedeværelse. Det er sandsynligt, at ved at kombinere kliniske karakteristika for overlevelse stammer fra tumorer på tidspunktet for kirurgi med gentagne vurderinger af PBMC afledt GPS-data, kan der udvikles en mere robust algoritme til at forudsige tilbagefald, der kan revurderes på forskellige intervaller efter operationen. Desuden kan generne af immune celler i forbindelse med patient resultater være mål for klinisk manipulation til at ændre nøglen genekspression for at potensere immunresponset anti-tumor og bidrage til at reducere forekomsten af ​​tilbagefald.

Mens yderligere studier med et større antal af racemæssigt forskellige patienter skal udføres, den foreliggende undersøgelse viser, at der kan påvises statistisk signifikant resultat oplysninger i genekspressionsmønstre af PBMC fra NSCLC-patienter. er igangværende bestræbelser på at indsamle de relevante prøver at løse disse problemer.

Støtte Information

Figur S1.

Fordeling af p-værdier for at anvende model fit på træningssæt til test sæt prøver. For at teste det generelle i vores tilgang, vi udførte 100 tilfældige valg af uddannelse /afprøvning indstiller at vurdere muligheden for, at vores resultat kan forklares ved en tilfældig udvælgelse af patienter. Baseret på fordelingen af ​​p-værdier, der viser betydningen af ​​præstationer på test sæt, så vi 39% af test sæt nåede en statistisk signifikans på

P

0,05. Dette er en berigelse på 7,8 gange over en tilfældig p-værdi distribution (

P

= 4 × 10

-9, Fisher eksakt test)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0034392. S001

(TIF)

tabel S1.