PLoS ONE: Ekspression af CCAAT /Enhancer Bindende Protein Beta i Muscle Satellit Celler Hæmmer myogenesen i Cancer Kakeksi

Abstrakt

Kræft kakeksi er et paraneoplastisk syndrom, der forårsager dybe vægttab og muskelmasse atrofi og skønnes at være årsag til op til 30% af kræftdødsfald. Selvom den præcise årsag er ukendt, har patienter med kræft kakeksi øget muskel protein katabolisme. Hos raske muskler, skade aktiverer skelet muskel stamceller, kaldet satellit celler, at differentiere og fremme regenerering. Her giver vi tegn på, at denne mekanisme hæmmes i kræft kakeksi grund af vedvarende udtryk for CCAAT /Enhancer Bindende Protein beta (C /EBPβ) i muskel myoblaster. C /EBPβ er en bzip transkriptionsfaktor, som udtrykkes i muskel satellit celler og er normalt nedreguleres efter differentiering. Men i myoblaster udsat for en kakektisk miljø, C /EBPβ ekspression forbliver forhøjet på trods af aktivering til at differentiere, hvilket resulterer i inhibering af myogeningenet ekspression og myogenese.

In vivo

, cancer kakeksi resulterer i forøget antal Pax7 + celler, som også udtrykker C /EBPβ og hæmningen af ​​normale reparationsmekanismer. Tab af C /EBPβ udtryk i primære myoblaster redder differentiering under kakektiske betingelser uden at gendanne myotube størrelse, hvilket indikerer, at C /EBPβ er en vigtig hæmmer af myogenese i kræft kakeksi

Henvisning:. Marchildon F, Lamarche É, Lala- Tabbert N, St-Louis C, Wiper-Bergeron N (2015) Ekspression af CCAAT /Enhancer Bindende Protein Beta i Muscle Satellit Celler Hæmmer myogenesen i Cancer Kakeksi. PLoS ONE 10 (12): e0145583. doi: 10,1371 /journal.pone.0145583

Redaktør: Atsushi Asakura, University of Minnesota Medical School, USA

Modtaget: 14. september 2015; Accepteret: December 4, 2015; Udgivet: December 28, 2015

Copyright: © 2015 Marchildon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud til NWB fra den canadiske Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca) og Cancer Research Society (https://www.crs-src.ca/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret ikke konkurrerende interesser

Introduktion

Kakeksi forårsager dybe vægttab og muskelmasse atrofi, og forekommer samtidig med forskellige sygdomme, herunder sepsis, aIDS, narkotikamisbrug, og kræft [1, 2]. Selvom ofte kombineret med anoreksi, kan vægttab og muskel protein katabolisme set i kakektiske patienter ikke vendes af kosttilskud og derfor ikke kan tilskrives dårlig ernæringsmæssige indtag alene [3]. Op til 80% af alle kræftpatienter vil have kakeksi i fremskredne stadier af deres sygdom [4-6], og dette korrelerer med skrøbelighed, øget sygelighed og dårlige resultater. Yderligere er ca. 30% af kræftdødsfald tilskrives kakeksi snarere end af tumorbelastning, hvilket gør cancer kakeksi en vigtig årsag til dødelighed i Nordamerika [1]. Som sådan, oprettelse af behandlings- og forebyggelsesstrategier er af allerstørste betydning, da kakeksi er omvendt korreleret med succes af anti-cancer behandlinger, og med patientens overlevelse [3, 7-9]. Årsagen til kræft kakeksi menes at stamme fra en kombination af fordøjelsessystemet (dysfagi og smagsforstyrrelser), humorale (systemisk inflammation), endokrine og tumor-afledte faktorer [10-13]. Begge kakektiske cancerpatienter og dyremodeller for kakeksi har forhøjet proinflammatorisk cytokin (f.eks TNFa, IL-1, IL-6) ekspression i blodbanen, hvilket tyder på, at disse faktorer spiller en rolle i udviklingen af ​​kakeksi [14-18].

I et sundt individ, er muskelmasse homøostase opnås ved at afbalancere muskel protein katabolisme med proteinsyntese. Skeletmuskelatrofi, som det ses i cancer kakeksi, medieres i det mindste delvist af opregulering af ATP-afhængig ubiquitin E3-ligaser (Murf, MAFbx /atrogin-1), der stimulerer nedbrydningen af ​​muskelvæv strukturelle proteiner ved 26S proteasomet og gælder inhibere den translationelle maskineri [19, 20]. Pro-kakektiske cytokiner stimulerer udtryk for disse ligaser og dermed fremme øget muskel protein omsætning [18, 21-23].

Satellit celler er den primære kilde til regenerativ evne til skeletmuskulatur og findes mellem sarcolemma og basalmembranen af ​​differentierede muskelfibre [24]. Disse celler kan aktiveres til både formering og differentiering som reaktion på ydre stimuli, vigtigst muskelskader og motion [25]. Satellit celler er defineret ved deres udtryk for CD34

+ og Pax7 blandt andre [26, 27]. Som satellit celler differentiere, de gradvist mister udtryk for Pax7 og udtrykke koordineret den myogene bHLH faktorer MyoD, myogenin og MRF-4, som er ansvarlige for induktion af myocyt-specifikke gener [28]. I muskelsvind betingelser, er der en reduktion af MyoD ekspression, således at der ud over hyperkatabolisme, er faldet regenerering blevet impliceret i patogenesen af ​​kakeksi, der forbinder inhibering af MyoD ekspression og reduceret differentiering kapacitet til udviklingen af ​​kakeksi

in vivo

[29-31].

CCAAT /Enhancer Bindende Protein beta (C /EBPβ) er en bzip transskription faktor involveret i mange lovgivningsmæssige og differentiering processer som både en aktivator og en repressor. For eksempel er det nødvendigt for leverregenerering, virker som en potent engagement faktor for adipocytdifferentiering, og regulerer akutfaserespons af immunsystemet [32-36]. Desuden har vi vist, at C /EBPβ er også en vigtig regulator af mesenchymal stamcelle skæbne i vævskultur modeller, hvor den fungerer som en aktivator af adipogenese og en repressor af osteoblastogenesis [37-39]. Hos raske muskler, er C /EBPβ udtryk begrænset til Pax7

+ satellit celler og dens udtryk falder efter aktivering [40-42]. Ektopisk C /EBPβ ekspression inhiberer myogenese gennem hæmning af MyoD proteinekspression fører til reduceret myogenin og MyHC-ekspression og nedsat fusogene aktivitet [41].

In vivo

, sepsis, cancer og glukokortikoider kan opregulere ekspression af C /EBPβ i muskler, samt udløse kakeksi [43, 44]. Faktisk kan kakeksi stimulere C /EBPβ udtryk i muskelfibrene, der fører til ekspression af atrogin-1 og fiber atrofi [45]. Podning af Lewis lungecancer (LLC) tumor i C /EBPβ null dyr forhindrede stimulering af atrogin-1 i muskelfibre og muskelatrofi [45], tyder på, at tabet af C /EBPβ kan hæmme muskelatrofi i kræft kakeksi. Men den nullizygous C /EBPβ dyr er nedsat immunforsvar, og dermed er usandsynligt, at have normale reaktioner på tumor podning herunder cytokinproduktion nødvendige for udviklingen af ​​kakeksi [46, 47], hvilket tyder på, at betingede modeller ville give større dybde af forståelse. Endvidere kan nullizygous model ikke skelne rollen som C /EBPβ i muskelfibrene versus potentielle virkninger i satellitten cellepopulation kørsel regenerering.

række af beviser indikerer, at inhiberingen af ​​skeletmuskulaturen regenerering, enten gennem tab af myogene forstadier, inhibering af MyoD eller gennem activin type 2 receptoraktivering, deltager i udviklingen af ​​cancer kakeksi [31, 48-50]. Heri viser vi, ved hjælp af modeller for kræft kakeksi, at stimulering af C /EBPβ udtryk i satellit celler og myoblaster af kakektiske miljø forhindrer den myogene regenerative respons.

Resultater

Konditioneret medium fra menneske cancere inducerer C /EBPβ ekspression i myoblaster

Da C /EBPβ er en vigtig regulator af immunsystemet og er nedstrøms for talrige cytokin signalveje, vi forudså, at konditioneret medium fra humane cancere ville stimulere C /EBPβ ekspression i myoblaster. C2C12 myoblaster blev dyrket med konditionerede medier (CM) fra forskellige humane cancercellelinier i 2 dage og C /EBPβ ekspression blev vurderet ved Western blotting. Inkubation af C2C12 celler med CM fra alle de testede tumorer stimuleret C /EBPβ udtryk i varierende grad, med PC-3, MCF7 og A549 linjer producerer de mest robuste stigning i udtryk (figur 1A). I modsætning hertil ovariecancer cellelinien SKOV3 og den humane coloncancer HCT116 stimulerede C /EBPβ ekspression mindst. Inkubation med PC-3 CM stimuleret også

Cebpb

mRNA-ekspression med næsten 2-fold (Fig 1B). Interessant PC-3-celler udtrykker TNFa, IL-1β og PIF-mRNA, og C /EBPβ ekspression er blevet vist at være positivt reguleret af IL-6, et cytokin, hvis ekspression opreguleres af IL-1 og TNFa signalering [15, 51 -53]. Faktisk mens PC-3 celler udtrykker

Il1b

, referatet var målbart i SKOV3 celler, hvilket tyder på en mekanisme til at forklare forskellen stimulering af C /EBPβ udtryk i myoblaster ved disse to kræft cellelinier (figur 1C).

(A) C2C12 myoblaster blev inkuberet med konditioneret medium fra angivne humane cancere eller ubetingede medium (UM) blandet 1: 1 med frisk myoblast medium i 48 timer. C /EBPβ ekspression blev vurderet ved Western blot. β-actin er en loading kontrol. (B)

Cebpb

mRNA-ekspression i myoblaster behandlet med PC-3 medium eller ubetinget medium i 48 timer. * P 0,05, n = 5. (C)

Il1b

udtryk i SKOV3 og PC-3 cancerceller. * P 0,05, n = 5.

Tumor medium hæmmer myogenese

For at undersøge betydningen af ​​C /EBPβ i muskel stamceller under kræft kakeksi, vi brugte en valideret væv dyrkningsmodel [53], hvori subkonfluente C2C12 myoblaster blev inkuberet med konditioneret medium (CM) fra den humane prostatakræft PC-3 og DU 145, eller med ubetinget medier (UM) i 2 dage inden induktion til at differentiere (fig 2A). I overensstemmelse med tidligere rapporter, inkubation med CM fra begge kræftformer ophævet myogenese, som det fremgår af en reduktion i antallet og størrelsen af ​​myosin tung kæde (MyHC) positive myorør (Fig 2B) [53]. Fusionsproteinet indeks (# kerner i MyHC + celler /# myocytter) blev reduceret ~ 60% af PC-3 medium og ~ 30% af DU145 medium sammenlignet med kontroller (Fig 2C), Differentieringen indeks (#nuclei i MyHC + celler /total kerner) blev reduceret ca. 40% i celler forbehandlet med PC-3 medium, og ~ 30% for patienter behandlet med DU145 medium, sammenlignet med kontroller (fig 2C), hvilket antyder, at både antallet og modenhed myorør blev påvirket af en kort udsættelse for tumor-konditioneret medium. I prolifererende myoblaster, udsættelse for CM fra begge tumorer stimulerede C /EBPβ ekspression efter to dage, uden at det påvirker Pax7 ekspression (Fig 2D). Ekspressionen af ​​MyoD blev reduceret i celler behandlet med DU145 CM, men ikke i celler behandlet med PC-3-medium (Fig 2D). Efter differentiering (dag 7), forbehandling med PC-3 konditioneret medium inhiberet myogenin og MyHC-ekspression, i overensstemmelse med nedsat differentiering, uden at påvirke MyoD ekspression (fig 2E). Endvidere mRNA ekspressionen af ​​

MYOD1

,

Myog

og neonatale

Myh

isoformer (

Myh1

,

Myh2

,

Myh8

Myh13

) blev hæmmet af udsættelse for PC-3 medium i forhold til celler udsat for ubetingede medium (fig 2F). DU145 medium tilsvarende reduceret

Myog

og neonatal

Myh

isoform udtryk, uden at påvirke

MYOD1

udtryk.

(A) Skematisk af proceduren for behandling vævskulturmodel af kakeksi. Konditionerede medier fra PC-3-celler blev blandet 1: 1 med frisk medium, og blev tilføjet på prolifererende C2C12 myoblaster i 48 timer, hvorefter cellerne blev induceret til at differentiere i frisk DMEM indeholdende 2% hesteserum i 5 dage. (B) Immuncytokemi farvning for myosin-tung kæde-ekspression i C2C12 kulturer behandlet med konditionerede medier fra PC-3 eller DU145 prostatakræft eller ubetingede medier (UM) som i (A). DAPI pletter kerner blå. (C) C2C12 kulturer blev induceret til at differentiere som i (A) og fusion index (# myonuclei /myotube) og differentiering index (# myonuclei /# Total kerner) blev beregnet og vist i forhold til UM. Faktiske værdier er vist i søjlerne. * P 0,05, n = 7. (D) Western blot-analyse af C /EBPβ, Pax7, og MyoD ekspression i prolifererende C2C12 celler på dag 2 efter inkubering med konditioneret medium. Actin er et loading kontrol. (E) Western blot-analyse af myogene markør ekspression i differentierede C2C12 celler på dag 7. Actin er en loading kontrol. (F) QRT-PCR-analyse af

MYOD1

,

Myog

og neonatal myosin tung kæde (

Myh1

,

Myh2

,

Myh8

,

Myh13

) udtryk, vist i forhold til celler behandlet med ubetinget medium (UM) på dag 7. * p 0,05, n = 4.

Hæmning af myogenese ved tumor-konditioneret medium varierer med evne til at inducere C /EBPβ i C2C12 og primære myoblaster Salg

Da konditioneret medium ville forventes at indeholde en blanding af vækstfaktorer og cytokiner, der kan påvirke ikrafttræden myogenese, gentog vi det i kultur cachexia model ved hjælp konditioneret medium fra SKOV3-celler, der kun svagt stimulerer C /EBPβ ekspression. Mens forbehandling med SKOV3 medium tilladt for robust differentiering, forbehandling med PC-3-medium inhiberede dannelsen af ​​myorør, begrænse den differentiering indekset med ca. 50% og fusionsproteinet indekset med ~ 40% (fig 3A og 3B). Yderligere i overensstemmelse med forskellene i C /EBPβ induktion af SKOV3 og PC-3 CM blev myogenin ekspression og MyHC-ekspression reduceres i celler udsat for PC-3-medium sammenlignet med SKOV3 kontroller (Fig 3C).

(A) Immuncytokemi farvning af myosin tung kæde-ekspression i C2C12 myoblaster forbehandlet med konditionerede medier fra SKOV3 eller PC-3-celler blandet 1: 1 med frisk medium, i 48 timer, og induceres til at differentiere i yderligere 5 dage. DAPI pletter kerner blå. (B) C2C12 kulturer blev induceret til at differentiere som i (A) og differentiering og fusion indeks blev beregnet som i forhold til SKOV3-behandlede celler. Aktuelle værdier er vist i de respektive søjler. * P 0,05, n = 5. (C) C /EBPβ, og myogene markør proteinekspression i C2C12 myoblaster behandlet som i (A). Cyclophilin B (CyPB) er vist som en loading kontrol. (D) Immuncytokemi farvning af myosin tung kæde (MYH) ekspression i primære myoblaster forbehandlet med konditionerede medier fra SKOV3 eller PC-3-celler blandet 1: 1 med frisk medium, for 48hrs, og induceres til at differentiere i yderligere 48 timer i DMEM indeholdende 10% hesteserum. DAPI pletter kerner blå. (E) Primære myoblast kulturer blev induceret til at differentiere som i (D) og differentiering og fusion indeks blev beregnet som i forhold til SKOV3-behandlede celler. Aktuelle værdier er vist i de respektive søjler. ** P 0,01, n = 4. (F) Procentdel af Pax7 + -celler i forhold til samlede resterende i C2C12 celler dyrket i konditioneret medium og differentierede som i (D) kerner som bestemt ved immunocytokemi. * P 0,05, n = 4. (G) C /EBPβ, og myogene markørprotein ekspression i primære myoblaster behandlet som i (D). Cyclophilin B (CyPB) vises som en belastning kontrol.

Efter aftale med C2C12 model, forbehandling af primære myoblaster med konditioneret medium fra PC-3 tumor føre til dannelsen af ​​færre og mindre myorør efter 2 dage i differentiering medium sammenlignet med celler behandlet med konditioneret medium fra SKOV3 tumor (fig 3D). Differentieringen indekset faldt ~ 30% med PC-3 forbehandling sammenlignet med celler behandlet med SKOV3, medens fusion indekset faldt ~ 50% i PC-3-behandlede myoblaster (Fig 3e). Desuden skal antallet af Pax7 + celler tilbage i kulturerne efter differentiering, som bestemt ved anvendelse immunocytokemi, blev signifikant forøget i kulturer forbehandlet med PC-3-medium med ca. 25% i sammenligning med SKOV3 kontroller (fig 3f). Som forudsagt blev C /EBPβ niveauer steg i PC-3-behandlede celler sammenlignet med kontroller, og ekspressionen af ​​myogenin og myosin tung kæde blev reduceret. Interessant nok i modsætning til vores observationer i C2C12 model, primære myoblaster behandlet med PC-3 CM også demonstreret et fald i MyoD proteinekspression, en konstatering i overensstemmelse med vores tidligere observationer i dette system (fig 3G) [41, 42].

C /EBPβ udtryk øges i primære myoblaster isoleret fra kakektiske mus

for at afgøre, om kræft miljø kunne stimulere C /EBPβ udtryk i myoblaster

in vivo

, isolerede vi muskel satellit celler fra raske og kakektiske LLC tumor-bærende dyr og differentieret dem

ex vivo

(fig 4A). Ud fra følgende betragtninger SCs oprenset fra sunde muskler differentierede effektivt, myoblaster isoleret fra kakektiske dyr produceret færre og mindre myorør (Fig 4B). Differentieringen indeks blev reduceret med 38% i kulturer fra kakektiske dyr og fusionsproteinet indekset blev reduceret 46% i sammenligning med raske kontroller (Fig 4C). Da disse celler blev ekspanderet i normalt medium i 5 dage før induktion til at differentiere, blev C /EBPβ niveauer kun mildt steg efter differentiering, hvilket resulterer i normaliseret MyoD ekspression (Fig 4D) og et mindre fald i myogenin ekspression. Primære myoblaster fjernet fra kakektiske mus viste også et fald i MyHC-ekspression sammenlignet med sham-kontroller, i overensstemmelse med differentiering defekt observeret (Fig 4D). Derfor ligner vores CM eksperimenter, satellit celler stammer fra LLC tumor-podede dyr har øget C /EBPβ udtryk og en defekt i differentiering, der varer ved

ex vivo

.

(A) 5×10

5 Lewis lungecarcinom (LLC) -celler eller PBS (Sham) blev injiceret i flanken af ​​C57BL /6-mus og fik lov at indpode i 3 uger for at inducere kakeksi. (B) Immuncytokemi for myosin-tung kæde-ekspression i primære myoblaster isoleret fra sham-injiceret og LLC-injicerede mus og differentierede i 2 dage. (C) Differentiering (DI) og fusion (FI) indekser fra kulturer isoleret og differentieret som i (B). * P 0,05, n = 5. (D) Western-analyse af C /EBPβ og myogene markør ekspression i celler isoleret fra sunde eller kakeksi mus som i (A) og efter dyrkning ekspansion i 5 dage, differentieret i 2 dage. Cyclophilin B (CyPB) er en belastning kontrol.

Kræft kakeksi hæmmer muskel regenerering in vivo

For at vurdere skeletmuskler regenerativ kapacitet i kakektiske dyr, vi såret venstre TA musklen med cardiotoxin (CTX) når kakeksi blev etableret og vurderet reparation en uge senere (fig 5A). Syv dage efter skaden, TA musklen fra sunde dyr repareres effektivt med talrige myofibre med centralt placerede kerner synlige, mens de sårede TA af kakektiske dyr havde omfattende fibrose og inflammatorisk celle infiltration med få tegn på regenerering (Fig 5B). Faktisk mens reparation restaureret fiber tværsnitsareal til ubeskadigede niveauer i raske kontrolmus, i kakektiske mus, regenererende muskel fiber tværsnitsareal blev yderligere reduceret med 28% efter skade, måling kun 59% af CTX-skadet ikke-kakektiske muskel (fig 5C). I overensstemmelse med disse observationer, havde TA vægten af ​​tilskadekomne sunde dyr ved obduktion vendt tilbage til denne kontrol, mens vægten af ​​de sårede TA i kakektiske dyr var kun 73% af skadede kakektiske kontrol (Fig 5D).

(A) Skematisk gengivelse af skaden model. Kakeksi blev induceret ved leverindføjede LLC cancerceller subkutant og tillade dem at vokse i 3 uger. Når kakeksi blev etableret, blev dyr såret ved at injicere cardiotoksin (CTX) ind i TA musklen. Sham skade blev opnået ved anvendelse PBS. Skade fik lov til at reparere en uge før analyse. (B) H 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 4. (D) TA masse i PBS og CTX-skadet sham og LLC-mus som i (B). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 5. (E) Procentdel af Pax7 + celler (i forhold til den samlede DAPI + kerner) i PBS og CTX-såret TA af fingeret og LLC dyr. ** P 0,01, *** p 0,001, n = 5. (F) Procentdel af C /EBPβ + /Pax7 + celler (i forhold til ubeskadigede fingeret dyr) i PBS og CTX-såret TA af fingeret og LLC dyr. * P 0,05, *** p 0,001, n = 3.

Vi næste scorede antallet af Pax7 + celler i TA tværsnit (fig 5E). Mens cirka 1,6% af kerner farvet positivt for Pax7 i skadede TA muskler falske dyr, dette tal nåede 3,5% i uskadte LLC-bærende dyr. Efter CTX skade, Pax7 + -celler steg i både sham og LLC dyr, med en 2-fold stigning for fingeret kontroldyr sammenlignet med skadede ben og et 4,5-fold stigning over skadede ben i tumorbærende dyr til næsten 20% af kerner. Endvidere mens skaden ikke påvirkede den procentdel af Pax7 + /C /EBPβ + satellit celler i raske dyr, i tumor-bærende kohorte, procentdelen af ​​dobbelt positive celler blev øget i både skadede og sårede muskler (Fig 5F), i overensstemmelse med

ex vivo

analyse af satellit celler (fig 4D). Tilsammen disse resultater tyder på, at kræft kakeksi øger Pax7 + rum størrelse og disse celler har forøget ekspression af C /EBPβ men reduceret regenerative evner.

Tab af C /EBPβ udtryk beskytter myoblaster fra kakeksi i kultur

for at bekræfte en rolle for C /EBPβ i udviklingen af ​​kræft kakeksi, isolerede vi

Cebpb

fl /fl

Pax7

+ /+ (WT) og

Cebpb

fl /fl

Pax7

Creer /+ (CKO) satellit celler og forbehandlet dem med CM fra PC-3 tumor eller SKOV3 tumor ( kontrol) inden induktion til at differentiere i lavt serum betingelser. Efter 2 dage i differentiering medium blev kulturerne immunfarvet for MyHC ekspression (Fig 6A). Mens forbehandling med PC-3 CM hæmmede differentiering i WT myoblaster, tab af C /EBPβ ekspression reddet differentiering under disse betingelser (Fig 6A og 6B), tyder på, at tabet af C /EBPβ ekspression beskytter myoblaster fra kakektiske miljø. Trods restaurering af differentiering indekset i CKO kulturer, har tabet af C /EBPβ udtryk ikke gendanne myotube størrelse (fusion indeks), som blev reduceret efter inkubation med PC-3 medium (Fig 6C). Mens behandling af WT celler med PC-3-medium øgede procentdelen af ​​Pax7 + -celler i kulturerne, konsistent med en reduktion i differentieringen indeks, kulturer mangler C /EBPβ havde signifikant færre reserveceller efter differentiering i både kontrol- og kakeksi betingelser (Fig 6D ). Mens der sås ingen forskelle i myogen markør udtryk, når man sammenligner WT og CKO celler i SKOV3 kontrol medium, afslørede western analyse, MyoD og myogeningenet udtryk blev reduceret inWT celler efter forbehandling med PC-3 medium (Fig 6E). Men i CKO celler blev MyoD ekspression forøget efter inkubation med PC-3-medium sammenlignet med WT og myogenin ekspression blev gendannet til kontrolniveauer (fig 6E). Således kan tab af C /EBPβ i muskel satellit celler redde myogenese i nærvær af konditioneret medium, uden at gendanne myotube størrelse.

(A) Indirekte immunofluorescens af myosin tung kæde (MyHC) ekspression i primære myoblaster isoleret fra

Cebpb

fl /fl

Pax7

+ /+ (WT) og

Cebpb

fl /fl

Pax7

Creer /+ (CKO) mus og dyrket med SKOV3 eller PC-3 konditionerede medier i 2 dage, og induceres til at differentiere i yderligere 2 dage. (B) Differentiering indeks (# myonuclei /# kerner) af primære myoblaster kulturer i (A). * P 0,05, *** p 0,001, n = 6. (C) Fusion index (# myonuclei /myotube) for celler differentierede som i (A). * P 0,05, ** p 0,01, n = 6. (D) Procentdel af Pax7 + celler i forhold til de samlede kerner i kulturer fra (A) efter differentiering, benævnt reserveceller. * P 0,05, ** p 0,01, n = 6. (E) Western blot-analyse af C /EBPβ og myogene markør ekspression i primære myoblaster behandlet som i (A). Cyclophilin B (CyPB) er en belastning kontrol.

Diskussion

C /EBPβ er en transskription faktor impliceret i talrige biologiske processer, herunder celledifferentiering, celle cyklus regulering, immunsystemets funktion og celleoverlevelse [33, 54-59]. Som sådan er C /EBPβ ekspression påvirkes af mange forskellige veje, herunder cytokin signalering, vækstfaktorer, proteasom og cAMP signalering [42, 60, 61]. Heri, viser vi, at C /EBPβ ekspression kan stimuleres ved udsættelse for konditioneret medium fra humane cancere, med varierende effektivitet. Selv om dette konditionerede medium indeholder sandsynlige cytokin mediatorer, de nøjagtige faktorer i de konditionerede medier kørsel C /EBPβ ekspression forbliver ukendte og kan være forskellig for hver kræft. Ikke desto mindre, stimulering af C /EBPβ ekspression i myoblaster korreleret med inhibering af myogenese at kunne vendes med tab af C /EBPβ.

Forbehandling af prolifererende myoblaster med konditioneret medium var tilstrækkelig til at inhibere myogenese, selv selvom differentiering blev gennemført i medium uden pro-kakektiske signaler. Disse eksperimenter således adskille de anti-myogene virkninger af konditioneret medium fra myotube atrofi virkninger, også kan forekomme. Interessant nok blev den myogene defekt sammenfattet i primære myoblaster isoleret fra kakektiske mus, selv efter ekspansion i vækstmedium, der ikke indeholder mus serum eller konditioneret medium. Det er tænkeligt, at udsættelse for en kakektiske milieu driver vedvarende epigenetisk modifikation af loci involveret i myogenese at forringe korrekt ekspression af proteiner, der er nødvendige for differentiering. Udsættelse for TNFa, et cytokin ofte forbundet med kakeksi, er blevet vist at inducere methylering af CpG-øer i MyoD locus, og histon methylarginin transferaser PRMT5 og WDR77 /MEP50 kan inducere transkriptionel repression af C /EBPβ målgener ved at inducere symmetriske dimethylering af histon H4 arginin 3 [62, 63]. I betragtning af, at de primære myoblaster mangler C /EBPβ udtryk kan differentiere normalt efter udsættelse for kakeksi-fremkaldende miljø, er C /EBPβ sandsynligvis kræves til mønstret af disse foreslåede epigenetiske modifikationer. Differentiering efter behandling med PC-3 konditioneret medium genoprettes med tab af C /EBPβ, den myotube størrelse, målt som fusion indeks, ikke blev reddet. Disse resultater antyder, at forbehandling med en kakektiske medium før differentiering reducerer fusogene kapacitet af cellerne efter differentiering, selv i normalt medium. Som sådan, ud over direkte at drive atrofi af modne fibre og reducere deres differentiering, kakeksi kan også forringe fusion af held differentierede celler. Mens tumor resektion kan helbrede kakeksi, er det fortsat uvist, om regenerative reaktioner komme sig helt, eller om en defekt varer ved, når den kakektiske miljø løser, og bør undersøges nærmere.

Differentieringen defekt efter behandling med PC-3 medium kan være tilskrives en manglende fremkalde myogenin fuldt, som kan vendes ved tab af C /EBPβ. I primære myoblaster blev MyoD proteinekspression også reduceret ved udsættelse for kakektiske miljø, men blev ikke observeret i C2C12 celler. Faktisk C /EBPβ ekspression er lavere i C2C12 sammenlignet med primære myoblaster, og dermed forskelle i C /EBPβ niveauer efter udsættelse for konditioneret medium kan i sig selv forklare forskellen følsomhed MyoD ekspression i de to systemer [41]. C /EBPβ kan inhibere MyoD evne til at transaktivere myogenin-promotoren og ekspressionen af ​​myogenin konsekvent nedreguleret i alle testede modeller, hvilket tyder på, at interferens med MyoD funktion som en mulig mekanisme for tabet af myogeningenet ekspression i myoblaster forbehandlet med konditioneret medium [ ,,,0],41].

MyoD proteinekspression er negativt reguleret af C /EBPβ uden samtidige ændringer i

MYOD1

mRNA-niveauer [41]. Endvidere kunne MyoD proteinet ikke reddes med inhibering af proteasomet [42]. Interessant nok tab af C /EBPβ ekspression ikke øge MyoD ekspression under kontrolbetingelser (SKOV3) sammenlignet med WT-celler selv i disse forsøg, differentiering effektivitet af kulturerne er ca. 80%, hvilket gør det mere udfordrende at se stigninger i myogene markørekspression . Men i mangel af C /EBPβ efter behandling med PC-3 medium, vi observerer en stigning i MyoD ekspression over det observerede i WT-kulturer, hvilket antyder, at tabet af C /EBPβ inhiberende mekanisme er på spil i dette system.

Mens tab af C /EBPβ udtryk kan forbedre differentiering efter konditioneret medium forbehandling, er det fortsat uklart, om hæmning af myogenese i kræft kakeksi bidrager til patogenesen af ​​syndromet. Da kakeksi også inducerer muskel skade [50], stimulering af den regenerative respons kunne forudsiges at være beskyttende, og faktisk har mange rapporter vist, at styrke regenerering forbedrer muskelatrofi set i kakeksi [49, 50, 64]. Desværre, vores resultater viser, at denne reaktion hæmmes af C /EBPβ ekspression, potentielt forværre muskeltab. Ikke desto mindre, at mekanismer stimulere myogenese do forbedre muskel histologi og levetid i dyremodeller tyder på, at fremme af regenerering er en vigtig terapeutisk vej til behandling af kakeksi.

Materialer og metoder

Cellelinjer

C2C12 myoblaster og Lewis lungecarcinoma (ATCC) blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco). PC-3 og DU145 prostataadenocarcinomceller (ATCC) blev dyrket i RPMI1640 tilsat 10% føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin (Sigma). SKOV3 ovarie adenocarcinom og HCT116 colorektalt carcinom blev dyrket i McCoy medier, MCF7 brystkirtel adenocarcinom blev dyrket i DMEM og A549 lunge epitel carcinom blev dyrket i F-12K medier, alle suppleret med 10% føtalt bovint serum.

Skeletal muskel primære myoblaster celler blev isoleret som beskrevet [65]. Lavere bagbenenes muskler C57BL /6-mus blev dissekeret og fordøjet med dispase og collagenase (Roche) ved 37 ° C i 1-2 timer, indtil muskler blev dissocieret.