PLoS ONE: Kombination af Selen og grøn te Forbedrer Effekt af Chemoprevention i en rotte Kolorektal Cancer Model ved at modulere Genetisk og Epigenetisk Biomarkers

Abstrakt

Kosttilskud af selen og grøn te lover i forebyggelse af kræft. I denne undersøgelse evaluerede vi virkningsfuldheden af ​​selen og grøn te administreret enkeltvis og i kombination imod colorektal cancer i en azoxymethan (AOM) -induceret rotte colon carcinogenese model og bestemmes de underliggende mekanismer for beskyttelse. Fire uger gamle Sprague-Dawley hanrotter blev fodret med foder indeholdende 0,5% grøn te-ekstrakt, 1 ppm selen som selen-beriget mælkeprotein, eller en kombination af 1 ppm selen og 0,5% grøn te-ekstrakt. Dyrene modtog 2 AOM (15 mg /kg) behandlinger til at inducere colon onkogenese. Rotter blev dræbt 8 eller 30 uger senere efter den sidste AOM at undersøge effekten af ​​kosten intervention afvigende krypt foci (ACF) dannelse eller tumor udvikling. På offer blev koloner undersøgt for ACF og tumorer, mRNA niveauerne af

SFRP5

cyclin D1

, og proteinerne niveauer af ß-catenin, COX-2, Ki-67, DNMT1 og acetyl histon H3. Kombinationen af ​​selen og grøn te resulterede i en signifikant additiv inhibering af store ACF-dannelse, denne effekt var større end både selen eller grøn te alene,

P

0,01; kombinationen havde også en signifikant additiv inhibering virkning på alle tumor endpoints, virkningen af ​​kombinationen kost på tumorincidensen, multiplicitet og størrelse var større end selen eller grøn te alene,

P

0,01. Rotter fodret kombinationen diæt viste markant reduktion af DNMT1 udtryk og induktion af histon H3 acetylering, der var ledsaget af restaurering af

SFRP5

mRNA i normale forekommende colon krypter. Kombinationen kost også væsentligt reduceret ß-catenin nuklear translokation,

cyclin D1

udtryk og celleproliferation. Disse data viser for første gang, at kombinationen af ​​selen og grøn te er mere effektive til at undertrykke colorektal onkogenese end alene enten agent. Den forebyggende effekt er forbundet med regulering af genetiske og epigenetiske biomarkører impliceret i colon carcinogenese

Henvisning:. Hu Y, McIntosh GH, Le Leu RK, Nyskohus LS, Woodman RJ, Young GP (2013) Kombination af selen og Grøn te Forbedrer Effekt af Chemoprevention i en rotte Kolorektal Cancer Model ved at modulere Genetiske og Epigenetisk Biomarkører. PLoS ONE 8 (5): e64362. doi: 10,1371 /journal.pone.0064362

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: December 5, 2012; Accepteret: April 12, 2013; Udgivet: 23. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte blev leveret af National Health og Medical Research Council tilskud og Kræft Råd South Australia (projektnummer 1.007.501 og 525.925). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende årsager til kræft død på verdensplan; anderledes end andre kræftformer, er betydningen af ​​miljømæssig eksponering (især kost) i ætiologien af ​​CRC fremhævet af, at 50% af årsagssammenhæng kan tilskrives familiære faktorer, hvorimod kostfaktorer bidrage med op til 70% [1] . Specifikke kosten strategier kan vise sig værdifulde i at beskytte mod kræft [2]. I denne henseende er der etableret associationer mellem kost og livsstil for CRC forebyggelse, og det er blevet anslået, at 30-50% af CRC kunne være potentielt forebygges ved at indtage en sund kost [3].

I de senere år , naturligt forekommende stoffer til stede i det, vi spiser eller drikker har trukket stor opmærksomhed med deres potentielle evne til forebyggelse og /eller behandling kræft på grund af deres forskellige sundhedsmæssige fordele og bred sikkerhedsmargin [2], [4]. Selen (Se), et væsentligt spor mikronæringsstoffer, og grøn te, den mest almindelige drik forbruges på verdensplan, er blevet identificeret som kemoforebyggende midler for forskellige cancerformer. Epidemiologiske, kliniske og prækliniske studier antyder et omvendt forhold mellem Se indtag, grøn te forbrug og risikoen for visse kræftformer [5] – [7]. Undersøgelser med dyremodeller har også vist, at Se og grøn te har en bred vifte af præventiv aktivitet mod CRC [8] – [10]. Trods lovende resultater i prækliniske indstillinger, aktuelle kliniske forsøg data vedrørende Se og grøn te tilskud er ikke overbevisende nok til, at en generel anbefaling for brug Se eller grøn te som et effektivt middel til chemoprevention af kræft hos mennesker [11] – [13] . Begrænsningen af ​​en enkelt kosten middel til effektiv forebyggelse kan skyldes lavere styrke af diætetiske midler, hvorimod naturlige forbindelser har vist større aktivitet, når de er til stede i en blanding [14]. Det kan være muligt at opnå additive eller synergistiske forebyggende virkninger ved at kombinere kosten agenter, der udøver supplerende mekanismer i deres anti-kræftfremkaldende handlinger [2], [15], [16]. Betydelige data fra dyr og mennesker undersøgelser viser, at kombinationer af kosten agenter er mere effektive end en enkelt agent [17], [18]. For eksempel har grøn te blevet vist at synergistisk eller additivt øge effektiviteten af ​​andre lægemidler eller diætetiske midler

in vitro

in vivo

[19] – [22].

på trods af den stigende interesse på kemoforebyggende rolle af Se eller grøn te, er det uvist, om kombinationen af ​​Se og grøn te har en gavnlig kemoforebyggende effekt på CRC. Selvom prækliniske og kliniske rapporter for at kombinere Se og grøn te mangler, kombination tilgange med Se eller grøn te er blevet undersøgt i tyktarmskræft og andre kræft-modeller [23]. For eksempel er en kombination af Se og genistein vist sig at hæmme brystkræft i en rottemodel [24]; en kombination af Se og E-vitamin har givet større beskyttelse mod esophageal carcinogenese hos rotter [22]. Kombinationen af ​​grøn te og curcumin eller kombinationen af ​​grøn te og sulindac har resulteret i synergistisk kemoforebyggende effekt i en AOM CRC model [25], [26].

Se og grøn te er særligt interessante som en kombination ikke kun fordi de let kan co-administreres i kosten, men også fordi de har potentielt komplementære virkningsmekanismer. Apoptotisk fjernelse og DNA-reparation enzym O

6-alkylguanin DNA alkyltransferase (MGMT) -medieret DNA-reparation er to vigtige medfødte cellulære reaktioner på miljømæssige kræftfremkaldende-induceret onkogen DNA-læsioner. Grøn te er blevet vist at opregulere MGMT aktivitet i rotte-kolon i vores tidligere undersøgelse (upublicerede data) ved en epigenetisk mekanisme, der ville forventes at reparere den type addukt induceret af azoxymethan (AOM) [27]. Dietary Se har vist af vores team til at aktivere apoptotisk sletning af AOM-ramte celler [28]. Vi hypotese, at risikoen for at udvikle CRC vil blive reduceret ved at kombinere midler, som er målrettet mod forskellige aspekter af medfødte cellulære responser til onkogen DNA-læsioner. Dette begrundes med, at CRC har en lang indledende latenstid, involverer flere trin og veje, og en multikombinerbare fremgangsmåde kan samtidig regulere flere molekylære og cellulære mål er involveret i processen med CRC [29].

Vores øget forståelse af CRC på epigenetiske /genetiske niveauer åbner også op for muligheder for at afbryde og vende initiering og progression af CRC og giver mange mål for kosten foranstaltninger [30]. Den AOM-inducerede CRC model er flittigt brugt i både mekanistiske og chemepreventive undersøgelser [31], fordi, opsummerer mange af de kliniske, patologiske, og molekylære egenskaber af menneskelig CRC, såsom præneoplastiske læsioner, afvigende krypt foci (ACF), mutationer i

K-ras

onkogen, og deregulering af signalveje i WNT /ß-catenin og inflammation [31], [32]. Selvom de roller, Wnt-antagonister (såsom udskilte frizzlede relaterede proteiner (SFRPs)), DNA-methyltransferaser (DNMT) og histondeacetylering i human colon carcinogenese er veldokumenteret, ekspressionen af ​​DNMT1, SFRR5 og acetylering af histon H3 i denne model er stort set ukendt; der spiller afgørende roller i udviklingen og progressionen af ​​humane coloncancerformer [33] – [35]. Den foreliggende undersøgelse blev designet til at evaluere kemoforebyggende virkning af at kombinere diætetiske midler ifølge SE og grøn te mod colon carcinogenese, under anvendelse ACF og tyktarmstumorer som endepunkter. Virkningerne af denne kombination af genetiske /epigenetisk biomarkører blev også undersøgt.

Metoder

Reagenser

AOM og grøn te-ekstrakt blev købt fra Sigma-Aldrich Pty. Ltd. Green teekstrakt (P1204) indeholder 65% catechin herunder 34,5% epigallocatechingallat (EGCG). Mælkeprotein (0.34ppm Se) og Se-beriget mælkeprotein (5 ppm Se) blev leveret af Tatura Milk Industries (VIC, Australien) [28]. Se-beriget mælk protein indeholder 83% selenomethionin, 5% selenocystein og 4% ukendte komponenter [36].

Dyr

I alt 160 Sprague-Dawley rotter blev opnået fra Animal Resource Centre, Adelaide University, Australien. Undersøgelsen blev godkendt af Animal Welfare Udvalg på Flinders University (# 651/07). blev udført to eksperimenter, 60 rotter i en ACF eksperiment og 100 for en langsigtet tumor eksperiment.

I hvert forsøg blev rotter opdelt tilfældigt i 4 lige forsøgsgrupper (med sammenlignelige indledende kropsvægt), anbragt i plastbure (fire i hvert bur) og vedligeholdes med en temperatur og fugtighed kontrolleret dyr facilitet med en 12 timers lys /mørke-cyklus ved 22 ± 2 ° C temperatur og 80 ± 10% fugtighed. Rotter fik fri adgang til vand, vejet ugentligt og blev overvåget nøje for kliniske tegn på dårligt helbred i hele undersøgelsen. Rotter optræder syge blev aflivet straks.

Diæter

De eksperimentelle diæter var baseret på en modificeret AIN-76A kost og indeholdt 19% solsikkeolie vægt, således at “menneskeliggøre” bidrag fedt energiindtag til ~35% [28]. Mælkeprotein blev anvendt som proteinkilde til kontrol og grøn te kost; SE-beriget mælkeprotein blev anvendt som protein såvel som en supplerende SE kilde for den høje SE kost og kombinationen kost; kontrol kost indeholdt hverken Se eller grøn te. Valg af 0,5% grøn te var baseret på vores tidligere undersøgelse, at dette indtag markant øget MGMT udtryk (mRNA og aktivitet) i rotte koloner (upublicerede data). Denne dosis indeholder 172,5 mg EGCG /100 g diæt og give 25,9 mg EGCG /rotte /dag, som, når beregnet pr kropsvægten ville give den tilsvarende indtag i et voksent menneske på 3-4 kopper grøn te om dagen. Denne fodring regime var veltolereret af dyr [37]. 1 ppm Se blev valgt, fordi vores tidligere undersøgelser viste, at Se-beriget mælkeprotein på 1 ppm signifikant beskyttet mod tyktarmskræft hos mus [28]. Diæterne blev fremstillet frisk ved 4-ugers intervaller, pelleteret og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Nærmere oplysninger om diæter er tilvejebragt i tabel 1.

Eksperiment 1 (ACF undersøgelse)

Begyndende ved 5 wk alder, rotter (15 /gruppe) blev fodret til hver af fire diæter . Efter 2 wk på kost, rotter modtog 2 AOM injektioner (15 mg /kg legemsvægt) én wk hinanden. Rotter blev på samme diæt under hele undersøgelsen indtil dræbt af CO

2-kvælning 8 uger efter den sidste AOM-injektion (figur 1A). Kolon blev åbnet fladt natten på Hibond C papir til ACF analyse. Efter analyse blev et distalt segment af normalt udseende kolon (2 cm) skåret og farvet med Ki-67, COX-2 og β-catenin antistoffer (12 /gruppe)

ACF undersøgelse (A).: grupper af rotter (n = 15) var fodret kontrol, Se, grøn te eller kost, der indeholder Se og grønt i en alder af 5 uger. 2 wk senere blev rotterne givet 15 (mg /kg /legemsvægt) AOM, en gang om ugen i 2 uger. 8 uger efter sidste AOM behandling blev rotterne aflivet, og koloner blev bedømt for ACF; normalt udseende krypter blev også undersøgt for β-catenin, COX-2 og Ki-67-ekspression. Tumor undersøgelse (B): grupper af rotter (n = 25) blev fodret kontrol, Se, grøn te eller diæt indeholdende Se og grøn i en alder af 5 uger. Rotter blev givet to ugentlige AOM behandlinger svarende til ACF undersøgelse. 30 wk efter AOM behandling blev rotterne aflivet og koloner blev historisk evalueret for tumor resultater; normalt udseende krypter blev også undersøgt for β-catenin, DNMT1, Ac-H3 samt

SFRP5

cyclin D1

udtryk.

Eksperiment 2 ( tumor undersøgelse)

5 uger gamle rotter (25 /gruppe) blev fodret til hver af fire diæter, der ligner ACF undersøgelse. Rotter modtog 2 ugentlige AOM injektioner (15 mg /kg), men blev dræbt 30 wk efter den sidste AOM (figur 1B). Kolon blev undersøgt for tumor endpoints og viderebehandles til histopatologisk vurdering. En distal del af normalt udseende kolon (2 cm) fri for neoplasmer blev dissekeret for immunhistokemi af β-catenin, DNMT1 og acetyleret histon H3 (Ac-H3) (12 /gruppe) eller frosset i flydende nitrogen i Western blot-analyse (6 /gruppe) eller placeres i RNAlater (Ambion) til kvantitativ RT-PCR-analyse (6 /gruppe).

Kvantificering af ACF

Kolon blev farvet med 0,1% opløsning af methylenblåt og evalueres på × 40 forstørrelse ved hjælp af en dissektionsmikroskop i en blind scoring procedure. Samlet antal ACF i hele tyktarmen blev scoret den distale til den proximale ende af tyktarmen. ACF blev adskilt fra de omgivende normale krypter af deres forøgede størrelse, høj udseende og slidsen lignende form af den luminale åbning. Crypt mangfoldighed blev defineret som antallet af krypter i hvert fokus, og kategoriseres som små (1-3 krypter /fokus) og store ACF (4 eller flere krypter /fokus).

Histopatologi af tumorer

antallet, placeringen og størrelsen af ​​hver tumor blev bedømt af en uafhængig observatør ubekendt med diætbehandling. Tumorerne blev kategoriseret som adenomer og adenocarcinomer som tidligere beskrevet af os [28]. Endepunkt var colontumor forekomst (dvs. andelen af ​​rotter med tumorer, med adenomer eller adenocarcinomer), tumor mangfoldigheden (antal tumorer /rotte) og tumorstørrelse (tumorstørrelse /rotte). Tumor størrelse blev beregnet ved formlen:. Log

10 [Σ (π (diameter1 + diameter 2))

2/2] [38]

immunhistokemisk analyse

primære antistoffer mod Ki-67 (MIB-5, # M7248) blev købt hos Dako, Australien; COX-2 (M-19-R, # SC-1747-R), β-catenin (E5, # SC-7963) og DNMT1 (H-300 # SC-2701) fra Santa Cruz Biotechnology, Australien og Ac-H3 (Lys9 /Lys14, # 9677) fra cellesignalering, USA. De detaljerede procedurer for immunhistokemisk analyse blev rapporteret tidligere [28]. Kort fortalt blev antigen-genvinding udføres ved opvarmning sektioner i 0,1 M citratpuffer i trykkoger plast karbad i 1 time. Snit blev inkuberet med Ki-67-antistof (1:1000), COX-2-antistof (1:500), β-catenin antistof (1:1,000), DNMT1 antistof (1:2,000), og Ac-H3-antistof (1: 5000) natten efter inkubation i 3% H

2O

2 til 20 minutter. Påvisning for Ki-67 og COX-2 blev biotinyleret sekundært kanin-anti-muse-antistof (1:200) (Dako) i 30 minutter og avidin /biotinyleret peroxidase-kompleks (Signet Laboratories) i 20 minutter. Påvisning for DNMT1 og β-catenin var af en HRP polymer link. Objektglas blev visualiseret ved at inkubere med 3′-diaminobenzamine substrat og modfarvet med hæmatoxylin. En positiv farvning blev identificeret ved en rødlig brunt bundfald i kernen i Ki-67, DNMT1 og Ac-H3, i cytoplasmaet for COX-2 og i membran /kerne i β-catenin. 20 intakte vinkelret godt orienterede normale forekommende krypter (der strækker sig fra den muskuløse slimhinde til colon lumen) blev undersøgt for hver kolon prøve. Indekset af colon kryptceller udtrykker Ki-67, COX-2, blev DNMT1 og Ac-H3 beregnet som antallet af positive celler pr krypt kolonne divideret med det totale antal celler og multipliceret med 100. Membran og nuklear farvede β-catenin celler blev optalt hver. Den abnorme ekspression af β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 blev også undersøgt i tumorvæv.

Western Blot-analyse

Prøver af normalt udseende colonvæv fra seks rotter per gruppe blev samlet og homogeniseret i iskold lysepuffer (50 mM Tris, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF og proteaseinhibitorer) og centrifugeret (14.000 x g i 25 minutter ved 4 ° C) . Koncentrationen af ​​protein i supernatanter blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad proteinassay. Lige store mængder proteiner (30 ug) blev separeret på 4-20% SDS-PAGE geler blev proteiner overført til en nitrocellulosemembran under anvendelse af halvtør overførsel, og membranen blev blokeret med 5% skummetmælk, probet med β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 antistoffer og farvet med sekundært antistof (et peberrodsperoxidase-mærket anti-kanin-IgG eller gede-anti-muse-IgG). Western blot blev gentaget tre gange for hver prøve. Immunreaktive proteiner blev påvist under anvendelse af forøget kemiluminescens lysdetekterende kit. Hver membran blev re-probet med anti-β-actin-antistof (Sigma) eller anti-histon H3-antistof (# 4499, Cell signalering). Båndintensiteter for β-catenin, DNMT1were kvantificeret af Image J og normaliseret med β-actin, hvorimod band intensitet Ac-H3 blev normaliseret med H3 histon. Resultater er udtrykt som forholdet til p-actin eller H3 histon.

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra rotte koloner ved hjælp af et Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland). Koncentrationen og renheden af ​​det totale RNA blev estimeret ved anvendelse af en NanoDrop® ND-1000 UV-Vis spektrofotometer ved måling af absorbansen ved 260 og 280 nm. Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret fra 0,3 ug totalt RNA for hver prøve ved anvendelse af et QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit.

SFRP5

cyclin D1

gener blev co-forstærket med

GAPDH

gen, der fungerede som en husholdning gen. Primere til

SFRP5

gen blev købt fra Qiagne, Rn_Sfrp5_1_SG QuantiTect Primer Analyser (NM_001107591, XM_001055342, XM_219887, XM_347305- Cat # QT01624056). Primere til

cyclin D1

gen (NM_171992) var 5′-ATGAGAACAAGCAGATCATCC-3 ‘(Forward Primer) og 5′-TAGCAGGAGAGGAAGTTGTTG-3’ (Reverse Primer). Primere til

GAPDH

gen (NM_017008) var 5′-AACATCATCCCTGCATCCAC-3 ‘(Forward Primer) og 5′-TTGAAGTCRCAGGAGACAAC-3’ (Reverse Primer). Real-time PCR blev udført med QuantiTect SYBR Green PCR-kittet på en Rotor Gene 3000 Cycler (Corbett, Australien). Cykliseringsbetingelserne af 40 cykler var 94 ° C /15 s, 55 ° C /30 s og 72 ° C /30 sek. Hver prøve blev kørt i triplet repeat og normaliseret ved

GAPDH

. For hver PCR-kørsel, blev en ikke-template-reaktion inkluderet som negative kontroller. Alle PCR-data blev analyseret med Q-Gene software som vi beskrev tidligere [36], [39].

statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 17,0 (SPSS Inc., Chicago , Illinois) og Stata-version 11.1 (StataCorp, Texas). Resultater udtrykkes som middelværdi ± standardfejl på middelværdien for normalfordelte data. Mellem-gruppe sammenligninger for vægt, Ki-67, COX-2, β-catenin, DNMT1, Ac-H3,

SFRP5

cyclin D1

blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA med korrektion for flere sammenligninger ved Tukey post hoc test, en

P

-værdi af 0,05 blev betragtet som statistisk mellem grupperne. Mellem-gruppe sammenligninger af ACF tæller og tumor foranstaltninger blev vurderet i henhold til de 2 × 2 faktorielle design med grøn te og Se som de to vigtigste faktorer. Binær logistisk og negative binomial regressionsmodeller blev ansat til at teste for de vigtigste virkninger af grøn te og Se og for mulige interaktion effekter mellem grøn te og Se. Post-hoc sammenligninger for hver af de 3 interventions- kost med kontrol kost som sammenligningsgruppen, samt sammenligning for kombinationen kost med alene Se eller grøn te alene blev også udført. En

P

-værdi af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant for hver vigtigste effekt og interaktion

Resultater

Generelt observation

Foderet blev godt modtaget. og forbruges af fire rotte grupper. Alle rotter uanset kosten interventionsgruppen udviste normal vægtøgning i løbet af de to eksperimenter (data ikke vist); der var ingen signifikant forskel i fødeindtagelse mellem de diætetiske grupper. Undersøgelse af tyndtarmen, lever og nyre afslørede ikke noget unormalt i nogen af ​​studierne, hvilket indikerer kosttilskud med 1 ppm Se eller 0,5% grøn te, eller en kombination af Se og grøn te forårsagede ikke nogen åbenlys toksicitet. Seks syge rotter blev dræbt, før afslutningen af ​​tumor undersøgelse; de blev fordelt på de tre behandlingsgrupper og tumor endpoints fra disse rotter ikke var i stand til at indgå.

Kombinationen kost effektivt hæmmer ACF dannelse i AOM model

AOM-induceret ACF blev observeret overvejende i den distale og midterste kolon. Virkningerne af Se, grøn te og kombinationen kost på ACF-dannelse er vist i tabel 2. Selv om det samlede antal ACF /rotte fra vores undersøgelse noget lavere blev sammenlignet med andre tidligere offentliggjorte undersøgelser [40], rotter fodret grøn te alene havde ingen effekt på den samlede ACF og små ACF /rotte, selv om det reducerede signifikant stor ACF /rotte,

P

0,05, sammenlignet med dem fodret kontrol kost. I modsætning hertil blev alle kategorier af ACF krypt mangfoldighed (i alt, små og store ACF /rotte) signifikant reduceret med Se alene (

P

0,05) og kombinationen kost (

P

0,05 for kombinationen kost versus hver grøn te og Se).

kombinationen kost effektivt hæmmer tumordannelse i AOM model

de signifikante fald i antallet af ACF er i overensstemmelse med de lavere tumor byrder observeret i de rotter, der modtog kombinationen kost (tabel 3). Der var en signifikant vekselvirkning mellem Se og grøn te,

P

0,05, med kombinationen kost viser additiv inhiberende virkning på alle tumor endepunkter i forhold til en enkelt kosten middel som grøn te eller Se,

P

0,01. Tumorincidens blev multiplicitet og tumorstørrelse reduceret med 73,9, 80,4%, 73,4% versus grøn te kost, og ved 65,2%, 72,7%, 63% versus Se kost hhv. Grøn te alene påvirkede ikke signifikant nogen tumor endpoint, mens Se alene var mindre effektivt end kombinationen kost. Analyse af effekten af ​​kosten intervention dannelse kræft blev specifikt udført efter histopatologisk undersøgelse af tumorer. Forekomsten af ​​adenom i kontrollen, grøn te, Se og kombinationen diæter var 26,1%, 20,8%, 16,7% og 4,3%, henholdsvis. Der var en signifikant reduktion i rotter fodret kombinationen kost, blev det reduceret med 79,3% versus grøn te kost, og med 74,2% versus Se kost,

P

0,01 hhv. Forekomsten af ​​adenocarcinomer blev reduceret i et lignende mønster; 17,4% i rotter fodret med en kontrol kost sammenlignet med 4,3% hos dem fodret kombinationen kost, mens i grøn te alene var forekomsten 12,5% og for Se var alene forekomsten 8,3%. Især kombinationen kost reducerede forekomsten af ​​adenocarcinomer med 65,6% versus grøn te kost, og med 48,2% versus Se kost, men tallene var små, og resultaterne ikke nåede signifikans.

Kombinationen kost forhindrer AOM-induceret ß-catenin nuklear translokation, COX-2-ekspression og celledeling

Virkninger af Se, grøn te og kombinationen kost på ß-catenin, COX-2 og Ki-67-ekspression blev undersøgt i histologisk normalt udseende krypter fra ACF undersøgelsen. Vi først sammenlignet farvningen mønster af ß-catenin mellem AOM-ubehandlet normale krypter og AOM-behandlede krypter. ß-catenin farvning i normale krypter af ubehandlede rotter viste et lavt niveau af ß-catenin farvning begrænset til cellemembranen, med begrænset nuklear farvning (figur 2A), hvorimod krypter fra AOM-behandlede rotter viste øget farvning af ß-catenin i kernen (Figur 2B). Sammenligning af ß-catenin membran og farvning af celler nukleare for de 4 diætetiske grupper er vist i figur 2B og 2C. SE alene, havde grøn te alene og kombinationen ikke påvirke procentdelen af ​​celler, der viser positive ß-catenin membranfarvning. Men Se alene (

P

0,05) og kombinationen kost (

P

0,01) reducerede signifikant andelen af ​​celler, der viser positive ß-catenin nuklear farvning, sammenlignet med kontrolgruppen, med ingen signifikant forskel mellem Se alene og kombinationen kost, mens grøn te alene ikke reducerer ß-catenin nukleare farvning. Procentdelen af ​​celler, der viser Ki-67 nukleare farvning blev reduceret i et lignende mønster af Se alene (

P

0,05) og kombinationen kost (

P

0,01), grøn te alene påvirkede ikke celleproliferation (figur 2B og 2D), med et lavt niveau af Ki-67-farvning i AOM-ubehandlet normale krypter (figur 2A). Vi sammenlignede også den farvningsmønster af COX-2 mellem AOM-ubehandlet normale krypter og AOM-behandlede normalt udseende krypter. AOM ubehandlede rotter viste et lavt niveau af cytoplasmatisk farvning for COX-2 i colon (figur 2A), hvorimod AOM-behandlede rotter viste øget farvning af COX-2 (figur 2B). Vi fandt, at alle tre kostvaner betydeligt hæmmet COX-2 cytoplasmatisk farvning (

P

0,05) sammenlignet med kontrol, var der ingen signifikant forskel mellem eksperiment diæter (figur 2B og 2D)

.

Et repræsentativt udsnit af immunhistokemisk farvning af β-catenin, Ki-67and COX-2 i AOM-ubehandlede normale krypter (A), AOM-behandlede normalt udseende krypter fra kontrol, grøn te, Se og kombinationen diæt (B ); indeks for β-catenin (membran og nukleare positive celler, beregnet som antallet af positive celler pr krypt kolonne divideret med det totale antal celler og multipliceret med mærkning 100 (n = 12) (C); mærkning indeks for COX-2 og Ki-67 (n = 12) (D). β-catenin og Ki-67 kernefarvning blev signifikant reduceret med kombinationen diæt og alene Se, men ikke grøn te. COX-2 cytoplasmatisk farvning blev signifikant nedsat ved grøn te, Se . og kombinationen kost Statistisk signifikans af kostintervention mellem grupperne blev analyseret ved ANOVA, værdier med forskellige hævet skrift i hver kolonne var statistisk forskellige (

P

0,05), Bars:. middelværdi ± SEM

Vi næste sammenlignet farvningsmønstret for β-catenin mellem AOM-behandlet normalt udseende krypter og AOM-inducerede tumorer. øget ß-catenin-farvning, især stærkere nuklear farvning var signifikant højere i colontumorer end i normal -appearing krypter overensstemmelse med translokation af ß-catenin (figur 3B). Ingen af ​​kostvaner påvirkes betydeligt membran farvning for β-catenin i normale forekommende krypter fra tumoren studiet, men Se diæt alene (

P 0,05

) og kombinationen kost (

P 0,01

) viste konsistente inhibitoriske virkninger på β-catenin kerneakkumulation (figur 3C). Effekten af ​​kostintervention på β-catenin-ekspression blev yderligere understøttet ved Western blot-analyse, der viser total β-catenin var signifikant lavere i normalt udseende krypter af rotter fodret kombinationen diæt eller Se alene (figur 3E og 3F).

Et repræsentativt udsnit af immunhistokemisk farvning β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 i AOM-ubehandlede normale krypter (A), AOM-behandlet normalt udseende krypter fra kontrolgruppen, grøn te, Se og kombinationen kost (B) og tumorer; indeks mærkning af β-catenin (membran og nukleare positive celler) (n = 12) (C) og mærkning indeks for DNMT1 og Ac-H3 (n = 12) (D). Western blot analyse af β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 for colon prøver (n = 6) (E), ekspression af β-catenin og DNMT1 blev normaliseret med den for β-actin og ekspression af Ac-H3 blev normaliseret til at af H3, blev data præsenteret som precent af kontrol (F). Øget stærk β-catenin nuklear farvning og DNMT1 overekspression blev vist i AOM-inducerede tumorer, mens svagere Ac-H3-ekspression blev bemærket i kolon tumorer. β-catenin nuklear farvning blev signifikant nedsat ved kombinationen diæt og Se alene, men ikke grøn te; DNMT1 blev signifikant reduceret ved kombinationen kost og grøn te alene, men ikke sådan; Ac-H3 nuklear farvning var signifikant forhøjet ved kombinationen kost og Se alene, men ikke grøn te. Statistisk signifikans af kostintervention mellem grupperne blev analyseret ved ANOVA, værdier med forskellige hævet skrift i hver kolonne var statistisk forskellige (

P

0,05), Bars:. Middelværdi ± SEM

kombinationen kost hæmmer DNMT1 udtryk og øget histon H3 acetylering

DNA methyltransferaser DNMT og histon ændringer spiller en vigtig rolle i DNA-methylering, med overekspression af DNMT1 og deacetylering af histon H3 eller H4 rapporteret i tyktarmskræft [33]. Med dette i tankerne undersøgte vi farvningen mønster af DNMT1 og Ac-H3 i AOM-inducerede colontumorer, sammenlignet med AOM-ubehandlet normale krypter samt AOM-behandlede normalt udseende krypter. Stærk nuklear farvning af DNMT1 og mindre intens nuklear farvning af Ac-H3 blev noteret i AOM-inducerede tumorer (figur 3B); i forhold til normal crypt (figur 3A) og normal-vises krypter (figur 3B), hvor DNMT1 og AC-H3 positive celler blev overvejende placeret i proliferativ rum (figur 3B).

For at bestemme om DNMT1 og Ac- H3 i normalt udseende krypter blev reguleret af Se alene, grøn te alene og kombinationen kostvaner, målte vi procentdelen af ​​DNMT1 og Ac-H3-positive celler for de 4 diætetiske grupper (figur 3D). Signifikant hæmning af DNMT1 blev observeret i rotter fodret kombinationen kost og grøn te alene,

P

0,05 versus kontrol, mens Se alene havde ingen signifikant effekt på DNMT1 udtryk. Når man sammenligner Ac-H3 mellem kosten grupper blev stærkeste induktion af Ac-H3 bemærkede i rotter fodret med kombinationen kost, Se alene også signifikant forøget Ac-H3,

P

0,05 sammenlignet med kontrol kost , men grøn te alene havde ingen virkning (figur 3D).