PLoS ONE: Generation of Small 32P-mærkede peptider som en potentiel tilgang til Kolorektal Cancer Therapy

Abstrakt

Kræft er blevet afsløret at være yderst heterogent med hensyn til frekvens og typer af mutationer, der er til stede i celler fra forskellige maligne tumorer. Det er således sandsynligt, at ensartede kliniske behandling ikke er optimal for alle patienter, og at udviklingen af ​​individualiserede terapeutiske regimener kan være gavnligt. Vi beskriver genereringen af ​​flere, unikke små peptider ni til fireogtredive aminosyrer i længde, som, når de er mærket med radioisotopen

32p, binder med meget forskellige effektiviteter til cellelinier afledt fra forskellige kolon adenokarcinomer. Desuden er den mest effektive af disse peptider permanent overfører

32P radioisotop til kolorektal cancer cellulære proteiner inden for to timer med en hastighed, der er mere end 150 gange højere end i cellelinjer afledt fra andre kræftformer eller fra de testede normale væv. I øjeblikket er de eneste to FDA-godkendte radioimmunotherapeutic midler i brug både anvender antistoffer rettet mod B-celle-markør CD20 til behandling af non-Hodgkins lymfom. Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet heri, kan et stort antal forskellige

32P-mærkede peptider let fremstilles og analyseres mod et bredt spektrum af cancertyper. Denne rapport foreslår udvikling og anvendelse af

32P-mærkede peptider som potentielle individualiserede peptid-bindende terapier til behandling af kolon adenocarcinom patienter

Henvisning:. Abraham JM, Cheng Y, Hamilton JP, Paun B, Jin Z, Agarwal R, et al. (2008) Generation af Small

32P-mærkede peptider som en potentiel tilgang til Colorectal Cancer Therapy. PLoS ONE 3 (6): e2508. doi: 10,1371 /journal.pone.0002508

Redaktør: Edathara Abraham, University of Arkansas, USA

Modtaget: April 24, 2008; Accepteret: 6 maj 2008; Udgivet: 25 Jun 2008

Copyright: © 2008 Abraham et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 og 7R21 /R33CA106763 fra National Cancer Institute

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de seneste skelsættende opdagelser har overbevisende dokumenteret den omfattende genetiske heterogenitet blandt menneskelige kræftformer, især kolorektale tumorer, ved, om der foreligger et mindre antal ofte muterede gen “bjerge”, og en langt højere antal gen “hills” muteret ved meget lavere frekvenser [1], [2]. Denne høje grad af mangfoldighed blandt humane kolorektal kræft tyder på, at individualiserede behandlingsstrategier lover godt i vellykket klinisk intervention. Flere anticancer immunterapier er i brug i øjeblikket, herunder Herceptin, Rituxin til behandlingen, og Avastin, et monoklonalt antistof rettet mod VEGF (vaskulær endotel vækstfaktor), der er godkendt til tarmkræft behandling [3] -. [9]

radioimmunterapi (RIT) er en ny teknologi med indtil nu kun to FDA-godkendte protokoller, både rettet mod non-Hodgkins lymfom (NHL). Hver protokol anvender et monoklonalt antistof rettet mod CD20 B-cellemarkør og kan levere

90Y (Zevalin) eller

131I (Bexxar), som hver især frembringer elektroner (beta partikler) at skader DNA, hvilket resulterer i celledød [10], [11]. I øjeblikket er der ikke RIT endnu blevet godkendt til behandling af colorektal cancer [12].

Vi har for nylig rapporteret en række ni forskellige decapeptider, hver varierende fra de andre ved kun en til tre aminosyrer, som, når mærket med beta-emitter

32P, bundet til og permanent leveret, i varierende grad, denne radioisotop til cellelinier afledt fra et panel af forskellige colorektale adenocarcinomer [13]. Den mest effektive

32P-mærket decapeptid resulterede i permanent inkorporering af radioisotop i colon adenocarcinom cellulære proteiner ved en hastighed over 100 gange større end i cellelinjer afledt fra en række andre cancere eller fra normal colon, nyre eller spiserøret.

Heri rapporterer vi en klasse af lidt større peptider (op til 34 aminosyrer lange), som indeholder vidt forskellige peptidsekvenser, hvilket resulterer i en bred vifte af cellulære bindende og radioisotop optagelsesegenskaber. Hver 34 aminosyre peptid indeholder en ni aminosyre kerne i dets amino- ende for at muliggøre

32p mærkning af proteinkinase A, en otte aminosyre kerne ved sin carboxyende, og op til 17 yderligere aminosyrer der dramatisk ændrer både dets binding til celler og dets faste inkorporering af radioisotop i tyktarmskræft cellulære proteiner. Disse resultater understøtter yderligere udforskning af denne strategi til at udvikle nye potentielle individualiserede terapeutiske regimer mod tyktarmskræft.

Resultater

Produktion af

32P-mærkede peptider og bindende til tyktarmen adenokarcinomceller

Tidligere rapporterede vi opdagelsen af ​​ni forskellige

32P-mærkede decapeptider, hver varierende fra hinanden ved kun et til tre aminosyrer, som udviste vidt forskellige evner til at binde til og overførsel radioisotop permanent til proteiner i cellelinier etableret fra et panel af kolon adenokarcinomer. Den mest effektive af disse

32P-mærkede decapeptider permanent leveret radioisotop til colon cancerceller mere end 100 gange mere effektivt end til cellelinier afledt fra andre kræftformer eller de testede normale væv. Heri rapporterer vi produktion og identifikation af en ny serie af peptider, op til 34 aminosyrer i længden, hvis aminosyresekvenser dramatisk ændre deres evne til at binde til og permanent lette

32P-inkorporering i celler. Figur 1 er en skematisk fremstilling af det eksperimentelle design, der illustrerer kloningen af ​​et DNA-fragment indeholdende 17 tilfældigt genererede kodoner i BamHI restriktionsenzymsted af pGEX-2TK. Efter bakteriel transformation blev individuelle kloner selekteres og ekspanderes for at fremstille et bredt sæt af

32P-mærkede peptider. Hvis der ikke stopkodoner var til stede i den vilkårlige DNA-sekvens, derefter en 34-rest peptid blev genereret, flankeret i dets amino- enden af ​​den 9-rest proteinkinase A mærkning motiv og ved sin carboxyterminale ende af en 8-rest sekvens. Som forventet i adskillige kloner, blev en stopkodon indsat, hvilket resulterer i afkortede peptider; Men alle disse trunkerede peptider indeholdt proteinkinase A substrat-del. Disse forskellige peptider blev inkuberet med flere forskellige cellelinjer i to timer, adhærente celler blev vasket tre gange, og radioaktivitet forbliver bundet til celler blev analyseret enten umiddelbart eller efter inkubation natten over i komplet medium.

Et PCR-produkt indeholdende 17 vilkårlige kodoner blev indsat i BamHI-stedet af pGEX-2TK producerer forskellige glutathion-S-transferase fusionsproteiner der var bundet til glutathion-sepharose, og mærket med

32P anvendelse af protein kinase A. Efter vask og thrombin fordøjelse, det mærkede peptider blev inkuberet med flere forskellige cellelinjer og analyseret.

Figur 2 viser den dramatiske variation i niveauer af permanent

32P-inkorporering i colon adenocarcinom linje Caco2 efter vask og natten over medium inkubation. Vi har tidligere vist, at celler med succes bindende decapeptider efter to timers inkubation frigivet op til 88% af deres oprindeligt bundet

32P i medier efter inkubation natten over, men stadig permanent indarbejdet høje niveauer af radioisotop i deres proteiner. De nitten forskellige peptider i figur 2 er betegnet MA (Modified adjuvans) 10 gennem 28. Elleve af disse 19 indeholder komplette indsatse 17-rester, med MA18 permanent overførsel

32P til Caco2 celler over 37 gange mere effektivt end MA26. Den mest effektive permanent radioisotop inkorporering i Caco2-celler forekom efter inkubation med MA27, som kun indeholder ét tilfældigt indsat aminosyre opstrøms for et stopkodon. Peptider MA16 og MA17 blev kodet af den oprindelige rekombinante ekspressionsvektor, hvilket fører til lave niveauer af radioisotop inkorporering.

Forskellige

32P-mærkede peptider blev inkuberet i to timer med 10.000 Caco2-celler, vasket tre gange, og inkuberet i komplet medium i 24 timer. Mængden af ​​

32P radioisotop, der forblev permanent inkorporeret i cellulære proteiner er vist som en procentdel af optagelse af mængden af ​​peptid tilsat til hver cellekultur brønd (middelværdi plus én standardafvigelse). Antallet af aminosyrer til stede i hver indsats er vist og varierede fra 0 til 17 aminosyrer. Aminosyresekvensen af ​​hver indsats er vist under niveauet for

32P inkorporering tilskrives hver indsats.

Visualisering af

32P inkorporering ved gel autoradiografi

Fire peptider viser gennemsnitlige niveauer af radioisotop inkorporering blev udvalgt til yderligere undersøgelse; triplikat brønde assays af disse peptider er vist i figur 3. Peptid MA11 s insert indeholdt tre rester opstrøms for et stopkodon, hvilket resulterer i et peptid kun 12 aminosyrer i længde. Trods sin relativt korte længde, dette trunkerede peptid overført

32P til Caco2-celler 215 gange mere effektivt end til den cervikale tumor afledt cellelinje HeLa på to timer. Efter vask og inkubering natten over i medium, radioaktivitet tilbageholdt af Caco2-celler var mere end 150 gange større end beholder HeLa-celler. Som vist i figur 3, mest

32P bundet til Caco2-celler var til stede i en lav-molekylvægt (LMW) bestanddel (

fed pil

) ved 2 timer, men ved 24 timer meste af denne radioaktivitet havde blevet inkorporeret i adskillige forskellige cellulære proteiner.

Fire af MA (ændret adjuvans)

32P-peptider vist i figur 2 blev inkuberet med tredobbelte brønde af Caco2 eller HeLa-celler i to timer. Efter vask blev 100 pi gelloadningspuffer tilsat, og indholdet blev kørt på SDS-polyacrylamidgeler (betegnet som “2 timer”). Identiske brønde havde komplet medium tilsat umiddelbart efter vasketrinnet og blev inkuberet i yderligere 24 timer, og brøndindholdet blev derefter kørt på geler (betegnet som “24 timer”). Film blev udviklet efter en overnatning eksponering viser den tilsyneladende permanente inkorporering af

32P i cellulære proteiner på 24 timer (markeret med * i MA11 panel). Peptid MA11 bundet 215 gange stærkere til Caco2-celler end til HeLa-celler ved to timer, og 150 gange mere ivrigt efter 24 timer. Peptid MA20 bundet godt til både Caco2 og HeLa-celler på to timer, men kun Caco2-celler syntes at besidde det cellulære maskineri, der skal til at optage

32P ind cellulære proteiner. Den tynde Pilen viser positionen af ​​

32P-mærket peptid, mens den fremhævede pil viser placeringen af ​​en relativt lav molekylvægt mærket mellemprodukt, der ikke var set i HeLa-cellerne.

Lignende resultater blev observeret for peptider MA15 og MA22, som begge indeholdt inserter 17-restkoncentrationer i en samlet længde på 34 aminosyrer, og som begge inkorporeres 23 gange mere

32P ind Caco2 celler end i HeLa-celler efter inkubation natten over (figur 3). Endnu en gang både MA15 og MA22 viste et intenst radioaktivt LMW bånd (

fed pil

) ved 2 timer, der var næsten helt forsvundet efter 24 timer, med inkorporering af den resterende

32P ind cellulære proteiner. Oprindeligt vi antog, at denne LMW bånd ses på 2 timer (

fed pil

) repræsenterede intakt bundet

32P-mærket peptid. Men de 34 aminosyre peptider MA15 og MA22 identificeret disse intakte 34-aa peptid forstadier til forskel fra den intense mindre MW-båndet (

fed pile

). Vi konkluderede derfor, at den mindre bandet var en hurtigt behandlet lille mellemliggende molekyle, som formindsket meget i de sikrer 24 timer, hvor

32P blev indarbejdet i de cellulære proteiner.

Peptide MA20 også indeholdt en 17-rest insert. Dette peptid var især bemærkelsesværdigt, da det var den eneste testede en, der var i stand til at binde sig til en cellelinje ikke hidrører fra kolon adenokarcinomer og forudsat nøgle tyder en mulig cellulær behandling mekanisme. Som vist i figur 3, MA20 bundet ved høje niveauer til både Caco2 og til HeLa-celler på to timer. Imidlertid LMW bånd (

fed pil

) set med de andre tre peptider i figur 3 var kun synlig med Caco2-celler, men ikke med HeLa-celler. Efter vask og inkubation natten over Caco2 celler syntes at have behandlet den LMW mellemliggende bånd (

fed pil

) i cellulære proteiner, mens HeLa-celler tilsyneladende manglede evne til at fuldføre denne næste trin (

dvs.

, ingen radioaktive cellulære proteiner ved disse MW blev synliggjort, og alle HeLa bundet radioaktivitet var stadig ved den samme molekylvægt som den oprindeligt bundet

32P-mærket peptid (

tynd pil

)). De to bånd (

tynde pile

, første bane af MA20 og MA22 geler) var resultatet af inkubation af

32P-mærkede peptid i medium indeholdende serum i to timer ved 37 ° C, og demonstrerede tilsyneladende delvise proteolyse af peptidet i løbet af denne tid.

Kun kolon adenokarcinomceller forarbejde bundet radioaktivitet i cellulære proteiner

Figur 4 viser resultaterne af inkubation peptider MA11, MA20 og MA22 med syv forskellige karcinom cellelinjer på 2 timer og efter inkubation natten over. Peptider MA11 og MA22 udstillet stærk binding og overførsel af

32P kun de tre colonadenocarcinom linjer (Caco2, HCT116 og HCT15) og ikke til livmoderhalskræft (HeLa), fibrosarkom (1080), pancreas eller lunge adenocarcinom celler. MA20 derimod bundet ivrigt til alle syv cellelinier, men dens radioaktivitet blev forarbejdet til LMW bånd (

fed pil

) og senere i cellulære proteiner kun af tre colonadenocarcinom linjer (Caco2, HCT116, og HCT15). HCT116 celler konsekvent bundet, samt forarbejdet til større MW bands, radioaktivitet fra alle tre

32P-mærkede peptider (MA11, MA20, og MA22) ved en meget lavere sats end Caco2 og HCT15 celler, men inkorporering i HCT116 cellulære proteiner blev til sidst synlige på længere eksponeringer (data ikke vist).

32P-mærkede peptider MA11, MA20 og MA22 blev inkuberet med syv forskellige cellelinjer, som beskrevet i figur 3. MA11 og MA22 bundet til og havde

32P radioisotop permanent indarbejdet ved de tre kolon adenocarcinom afledte cellelinjer. MA20 bindes signifikant til alle syv cellelinjer, herunder en afledt af en pancreas adenocarcinom og en afledt af en lunge adenocarcinom, men havde signifikante niveauer af

32P permanent inkorporeret i cellulære proteiner kun af de tre kolon adenokarcinomer.

tynd pil

viser positionen af ​​

32P-mærket peptid, medens

fed pil

angiver placeringen af ​​en relativt lav molekylvægt mærket mellemprodukt, som kun blev set i colonadenocarcinom celler.

Ikke-phosphorylerede peptid konkurrerer med

32P-mærket peptid til binding til Caco2 celler

12-aa peptid MA11 blev kemisk syntetiseret, mærket med

32P og anvendt i et kompetitivt bindingsassay med Caco2 celler mod varierende mængde kold, ikke-phosphoryleret MA11 peptid. Figur 5 illustrerer, at phosphorylering af dette peptid ikke var forpligtet til at konkurrere om binding til Caco2 celler, og at stigende mængder af kold konkurrent hurtigt hæmmede mængden af ​​

32P-mærket peptid, som er bundet til celler.

i hver brønd indeholdende Caco2-celler blev tilsat 0,005 ug

32P-mærket MA11 peptid og den angivne mængde af kulde, ikke-phosphoryleret MA11. Efter en times inkubation blev adhærerende celler vasket, og det bundne radioaktive tællinger bestemmes.

Diskussion

Nitten forskellige små peptider op til 34 aminosyrer i længde er blevet fremstillet rekombinant, hver indeholdt et insert op til 17 rester lang, hvilket kan mærkes ved et konserveret ni aminosyresubstrat med

32p og proteinkinase A. Disse

32P-mærket peptider binder med unikke affiniteter til cellelinjer etableret fra forskellige kolon adenokarcinomer og permanent overdrage radioisotop til cellulære proteiner efter to timers inkubation. De mest effektivt bindende peptid resulterer i den permanente optagelse af

32P efter colon cancerceller over 150 gange højere end ved cellelinier afledt fra andre cancere eller normale væv. Desuden udviste et

32P-mærket peptid bundet til alle testede cellelinier, men

32P blev forarbejdet og permanent inkorporeret kun af cellelinjer afledt fra colon adenokarcinomer, hvilket indebærer, at kun denne type cancercelle besidder maskineriet nødvendig for dette behandlingstrin. De nitten forskellige peptider er vist i figur 2 blev udvalgt fra en indledende screening panel, der kun indeholder 25 peptider. Denne overraskende høj hastighed for at opnå vellykkede peptider øger sandsynligheden for, at denne strategi for individuel terapi udvikling vil være mulig. Endelig et kompetitivt bindingsassay under anvendelse af kold og

32P-mærket syntetisk MA11 peptid viste, at ikke-phosphoryleret peptid konkurrerer meget effektivt om binding til Caco2-celler.

Mest aktuelt godkendte cancer immunterapeutiske regimer anvender et antistof rettet mod et kendt cellulært molekyle og kan også kobles til et tumor-ablation middel, såsom en radioisotop eller et toksin [14] – [18]. Kun to radioimmunotherapeutic (RIT) behandlinger er i øjeblikket FDA-godkendt; begge er rettet mod ikke-Hodgkins lymfom udnytte

131I (Bexxar) eller

90Y (Zevalin) via celledræbende aktivitet udsendte elektroner.

32P radioisotop er en ren beta emitter, og som vist i tabel 1, det har mange egenskaber, der tåler sammenligning med

131I og

90Y, ud over at være let tilgængelig og relativt billig. En fordel ved at anvende beta-partikler til at dræbe tumorceller er, at deres vej rækkevidde på op til 5 resultater mm i et stort antal celler, der gennemtrænges af hver elektron, hvilket fører til en kumulativ “bystander-effekt” på grund af krydsild fra tilstødende mærkede celler.

Et meget aktivt område af biomedicinsk forskning fokuserer på koblingen af ​​radioisotop til peptider, såvel som dets anvendelse i diagnostiske og terapeutiske anvendelser [19] – [22]. Vores foreslåede anvendelse af

32P-mærkede små peptider i peptid binding terapi foreslår en række fordele i forhold til traditionel RIT baseret på monoklonale antistoffer. For eksempel er mindre terapeutiske molekyler forventes at medføre bedre tumor penetration, og den gennemsnitlige lille peptid molekylvægt på mindre end 4.000 Da, er mindre end 3% af størrelsen af ​​et antistofmolekyle [23]. Radioaktive halogener såsom

131I kan behandles og udgivet tidligt ved celler, mens

32P leveret af disse små peptider permanent inkorporeret i kræft celle proteiner [24]. En lille peptid er mindre tilbøjelige til at tilskynde den type vært anti-protein reaktion, der kan udvikle sig, når anvendelse af den meget større antistoffer, og fraværet af et Fc immunoglobulin fragment bør resultere i mindre ikke-specifik binding af leveren. Den radioaktive isotop

32P har en lang tradition for klinisk brug dating til begyndelsen af ​​1930’erne, mens den i dag stadig anvendes til behandling af polycytæmi og væsentlige thrombocythemi [25]. Der er et klart behov for udvikling af effektive nye behandlinger for tarmkræft [26]. Vores arbejde tyder på, at et meget stort bibliotek af forskellige små peptider, hver med unikke bindende og

32P overførsel evner, kan let fremstilles enten kemisk eller biologisk, hvilket øger mulighederne for at udvikle individualiserede behandlingsregimer for forskellige patienter. Kræft har vist sig at være en yderst heterogen sygdom, dermed udviklingen af ​​disse unikke peptid bindende behandlinger kunne i høj grad lette individualiserede patient behandlinger.

Materialer og metoder

Produktion af den rekombinante

32P -mærkede peptider Salg

som beskrevet i figur 1, PCR-genereret produkter bestående af 17 vilkårlige kodoner flankeret af BamHI-stederne blev klonet i BamHI-stedet i pGEX-2TK (GE Healthcare). Efter transformation ind i DH5a-bakterier, blev isolerede kloner dyrket natten over i LB-amp-bouillon, fortyndet 1:10 i samme, dyrket i to timer, IPTG tilsat til 1 mM, og dyrket ved 37 ° C i fem timer. Ti ml kultur blev centrifugeret og resuspenderet i 1 ml 1 x TBS indeholdende 100 ug /ml lysozym. Efter to fryse-tø cykler blev lysatet centrifugeret og blandet med 100 pi Sepharose-Glutathion i en time, vasket tre gange med 1 × TBS, og de bundne rekombinante fusionsproteiner mærket under anvendelse

32P-γ-ATP og proteinkinasen A ifølge producentens instruktioner (Sigma, St. Louis, Mo.). Pelleten blev vasket tre gange med 1 × PBS og det mærkede peptid blev spaltet og frigives til supernatanten under anvendelse af thrombin (GE Healthcare). For hver rekombinant peptid fremstillet og analyseret, blev DNA-sekvensen af ​​insertet i ekspressionsplasmidet bestemt.

Assay af bindingen af ​​

32P-mærkede peptider til cellelinier

Cellelinjer blev dyrket i komplet medium indeholdende 10% varmeinaktiveret bovint føtalt serum. I hver brønd i en plade med 96 brønde blev 10.000 celler fra forskellige cellelinjer dyrket natten. Ti pi af

32P-mærket peptid i 1 × PBS og 90 pi komplet medium blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i to timer. Peptid-mediet fjernet og en pi tilsat til 100 pi gel loading buffer for scintillationstælling for sonden kvantificering eller kørt på en 10% -20% polyacrylamid-SDS-gel (Biorad). De adhærente celler blev kortvarigt og forsigtigt vasket med komplet medium tre gange og nogle brønde blev analyseret umiddelbart ved tilsætning af 100 pi gel loading buffer til hver brønd og kørt på en gel eller talt i en scintillationstæller. Andre identisk behandlede brønde havde 200 pi komplet medium tilsat og inkuberet ved 37 ° C i yderligere 24 timer. Mediet blev fjernet, og 100 pi gelloadningspuffer tilsat, og prøverne kørt på en gel eller talt som beskrevet ovenfor.

Produktion af syntetisk

32P-mærket peptid

12 aminosyrer peptid MA11 blev kemisk syntetiseret og 0,2 ug blev mærket som beskrevet ovenfor under anvendelse 300 uCi

32P-γ-ATP og 30 enheder af proteinkinase A. Efter en fem timers mærkning reaktion, blandingen blev mikrofugeret selvom en Microcon-10 enhed at fjerne enzymet fra efterfølgende bindingsanalyser. For konkurrerende bindingsassay, 0,005 ug

32P-mærket peptid MA11 blev tilsat til en brønd indeholdende 10.000 Caco2-celler og en udpeget mængde af kulde, ikke-phosphoryleret MA11. Efter inkubering i en time blev de adhærerende celler vaskes forsigtigt og brøndindholdet talt.