Abstrakt
transskription faktor Sox9 spiller en afgørende rolle i normal prostata udvikling og er blevet foreslået at drive prostata carcinogenese i koncert med PTEN inaktivering. For at evaluere den kliniske effekt af Sox9 og dets forhold til centrale genomiske forandringer i prostatakræft, blev Sox9 udtryk analyseret ved immunhistokemi på et væv microarray indeholder 11,152 prostatakræft. Data om ERG status og sletninger af
PTEN
, 3p13, 5q21 og 6q15 var tilgængelige fra tidligere undersøgelser. Sox9 ekspressionsniveauer var sammenlignelige i luminale celler fra normale prostata kirtler (50% Sox9 positiv) og 3.671 cancere mangler TMPRSS2: ERG fusion (55% Sox9 positive), men blev markant forøget i 3116 ERG-fusion positive kræftformer (81% Sox9 positiv, p 0,0001). Selv om der ikke entydige ændringer i Sox9 ekspressionsniveauerne blev fundet i forskellige stadier af ERG-negative kræftformer, en gradvis nedsættelse af Sox9 parallel progression til fremskreden fase, høj Gleason kvalitet, metastatisk vækst, og tilstedeværelse af PTEN sletninger i ERG-positive kræftformer (p Accepteret: April 29, 2015; Udgivet: 1 juni 2015
Copyright: © 2015 Burdelski et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Prostatakræft er den mest udbredte cancer hos mænd i vestlige samfund [1]. Mens de fleste tumorer har en temmelig indolent klinisk forløb, prostatacancer repræsenterer stadig den tredje mest almindelige årsag til cancerrelaterede dødsfald hos mænd. Etablerede prognostiske parametre er Gleason kvalitet, tumorudbredelse på biopsier, præoperativ prostataspecifikt antigen (PSA), og klinisk udvikling. Selvom statistisk stærke, de er ikke tilstrækkelige til optimale individuelle beslutninger behandling. Det er håbet, at en bedre forståelse af sygdommens biologi i sidste ende vil føre til identifikation af klinisk relevante molekylære markører, der muliggør en mere pålidelig forudsigelse af prostatakræft aggressivitet i individuelle patienter.
Sox9 hører til SOX (SRY-relaterede HMG box) familie af udviklingsmæssige transkriptionsfaktorer (revideret i [2]). Det er afgørende for udviklingsmæssige processer, der involverer kønsbestemmelse (revideret i [3]), brusk udvikling [4], gliogenesis [5], cardiogenese [6], indre øre dannelse [7], dannelsen af hår stamceller ved [8] , progenitorcelle pool vedligeholdelse i bugspytkirtlen [9] og organogenese af prostata [10]. Her Sox9 er en af de tidligste transkriptionsfaktorer udtrykt i den oprindelige prostata [10]. I den voksne prostata, er Sox9 udtryk stærkt til udtryk i de basale celler [11,12], hvor det har en vigtig rolle for opretholdelse af normal prostata funktion [11,13]. Adskillige rækker af beviser findes, der Sox9 også kan bidrage til prostatakræft initiering og progression, herunder opregulering i de tidlige stadier af prostata neoplasi i musemodeller [14], samt i humane prostata-intraepitelialneoplasi (PIN) [10] og prostata cancere [10,11] [14-17]. Nogle af disse undersøgelser af 98-387 patienter har også knyttet Sox9 overekspression til high-grade og avancerede tumorer [10,14,15,17], hormon-refraktær sygdom tilstand [15] eller dårlig patient prognose [14,15,17] .
de lovende resultater af disse undersøgelser opnået i begrænsede sæt patient fik os til at yderligere at evaluere mulige kliniske konsekvenser af Sox9 i prostatakræft. Til dette formål, tog vi fordel af vores allerede eksisterende væv microarray indeholder 11.000 prostatakræft prøver med klinisk opfølgning og vedhæftet molekylær database. Resultaterne af vores undersøgelse viser, at faldet, og ikke forhøjet, er Sox9 proteinekspression knyttet til dårlig prognose, og at denne effekt er strengt begrænset til den delmængde af prostatakræft huser PTEN sletninger.
Materialer og metoder
patienter
radikal prostatektomi prøver var tilgængelige fra 11,152 patienter, der gennemgår kirurgi mellem 1992 og 2011 ved Institut for urologi og Martini klinikker på University Medical center Hamburg-Eppendorf. Opfølgende data var tilgængelige for alt 9.695 patienter med en median opfølgning på 31,2 måneder (spændvidde: 0,3 til 228 måneder, tabel 1). Gleason sortering blev udført i overensstemmelse med kriterier, der er sammenfattet i 2004 World Health Organization (WHO) klassifikation af urogenitale kræftformer [18]. Prostataspecifikt antigen (PSA) blev målt efter kirurgi og PSA recidiv blev defineret som den tid punkt, når postoperativ PSA var mindst 0,2 ng /ml og stigende på efterfølgende målinger. Alle prostata prøver blev analyseret i henhold til en standard procedure, herunder en fuldstændig indlejring af hele prostata til histologisk analyse [19]. TMA produktionsproces beskrevet tidligere i detaljer [20]. Kort sagt blev en 0,6 mm kerne taget fra et repræsentativt væv blok fra hver patient. Vævene blev fordelt mellem 24 TMA blokke, der hver indeholder 144 til 522 tumorprøver. For interne kontroller, hver TMA blok indeholdt også forskellige kontrol væv, herunder normal prostata væv. Den molekylære database knyttet til denne TMA indeholdt resultater på ERG udtryk i 9619 [21],
ERG
bryde ud FISH-analyse i 6106 (udvidet fra [21]) og sletning status 5q21 (
CHD1)
i 7222 (udvidet fra [22]), 6q15 (
MAP3K7)
i 3523 (udvidet fra [23]),
PTEN
(10q23) i 6109 (udvidet fra [24] ) og 3p13 (
FOXP1)
i 6410 (udvidet fra [25]) kræftformer.
Etik erklæring
brugen af arkiverede diagnostiske venstre-over væv til fremstilling af væv microarrays og deres analyse for forskningsformål samt patient dataanalyse er blevet godkendt af de lokale love (HmbKHG, §12,1) og af den lokale etiske komité (etik kommission Ärztekammer Hamburg, WF-049/09 og PV3652) . Ifølge lokale love, blev informeret samtykke ikke påkrævet til denne undersøgelse. Patientjournaler /oplysninger blev anonymiseret og de-identificeret før analyse. Alt arbejde er udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.
Immunhistokemi
nyslået TMA sektioner blev immunofarvet på én dag, og i et eksperiment. Objektglas blev afvokset og udsat for varme-induceret antigen-genvinding i 5 minutter i en autoklave ved 121 ° C i pH 9 Dako Target Retrieval Solution. Primært antistof specifikt for Sox9 (monoklonalt muse-antistof (klon 3C10), Abnova, Taipei City, Taiwan; cat # H00006662-M02; fortynding 1: 700) blev påført ved 37 ° C i 60 minutter. Bundet antistof blev derefter visualiseret under anvendelse af EnVision Kit (Dako, Glostrup, Danmark) i overensstemmelse med producentgaranti retninger. Hvis tilstede, Sox9 farvning var typisk homogen i kernerne i alle cancerceller af vævet pletter. Procentdelen af positive tumorceller (typisk 100%) blev således ikke registreres separat. Svag cytoplasmatisk farvning, som ledsagede nuklear farvning i de fleste væv pletter, blev tilskrevet uspecifik farvning og ikke i betragtning til analysen. Nuklear farvningsintensitet af alle tilfælde blev semikvantitativt vurderet i fire kategorier:. Negative, svage, moderate og stærke
Statistik
Statistiske beregninger blev udført med JMP 9 software (SAS Institute Inc., NC, USA). Kontingenstabeller og chi
2-test blev anvendt til at søge efter sammenhænge mellem molekylære parametre og tumor fænotype. Overlevelse kurver blev beregnet ifølge Kaplan-Meier. The Log-Rank-test blev anvendt til påvisning af signifikante forskelle mellem grupperne. Cox proportionel risiko regressions analyse blev udført for at teste den statistiske uafhængighed og betydning mellem patologiske, molekylære og kliniske variable.
Resultater
Tekniske aspekter
I alt 3587 af 11.152 ( 32%) vævsprøver var ikke-informativ. Tre TMA sektioner omfatter 1.271 prøver blev udelukket fra analysen på grund af utilstrækkelig farvning kvalitet. Disse tre sektioner er ikke blevet re-farvet for at undgå en farvningsintensitet forhold, der kunne opstå, når IHC eksperimenter gentages på forskellige dage. I en anden 2.316 væv spots, blev der ikke IHC opnåede resultat på grund af den fuldstændige mangel på væv eller fravær af utvetydige kræftceller.
Sox9 i prostatakræft
Nuklear Sox9 udtryk var typisk stærk i basale celler af normale prostata kirtler. I normale luminale celler, moderat til stærk farvning blev fundet i ca. 50% af analyserede tilfælde. I prostatakræft, blev nukleare Sox9 udtryk observeret i 67% af 7,565 fortolkelige sager. Påviselig Sox9 farvning blev i 15% anses for svag, moderat i 39% og stærk i 13% af tilfældene. Eksempler på væv pletter med varierende niveauer af Sox9 immunfarvning er vist i fig 1.
(a) negativ, (b) svag, (c) moderat, (d) stærk.
Association med ERG status
data om både fortolkelige Sox9 farvning og ERG status var tilgængelig fra 7,565 tumorer hvis ERG status blev bestemt ved IHC analyser og fra 4.454 tumorer hvis ERG omlejring blev analyseret ved FISH. Sox9 farvning blev stærkt knyttet til ERG-positive kræftformer, uanset om ERG status blev analyseret ved IHC eller FISH: Sox9 udtryk blev fundet i 82% af ERG IHC-positive og 83% af ERG FISH-omarrangeret kræftformer, men kun i 55% af ERG IHC-negative og 62% af ERG FISH-normal kræftformer (p 0,0001 hver, figur 2).
IHC = immunhistokemi; FISH = fluorescens in situ hybridisering.
Association med andre centrale genomiske forandringer
Tidligere undersøgelser har fremlagt beviser for forskellige og klinisk relevante molekylære undergrupper af prostatakræft er defineret af gen omlejringer og flere genomiske sletninger. Andre og os beskrev en stærk forbindelse mellem PTEN, 3p13 sletninger og ERG positivitet, og mellem 5q21, 6q15 sletninger og ERG negativitet [22-24,26-28]. For at undersøge, om Sox9 udtryk kan være knyttet til nogen af disse ændringer blev Sox9 data sammenlignet med allerede eksisterende fund på sletninger af PTEN, 3p13, 6q15 og 5q21. I analysen af alle tumorer, blev Sox9 farvning positivt associeret med deletioner af PTEN (p lt; 0,0001) og 3p13 (p = 0,001) og negativt forbundet med deletioner af 6q15 (p = 0,0002) og 5q21 (p 0,0001, fig 3A) . Dette forventedes fordi alle disse deletioner-som ligesom Sox9-vides at være tæt knyttet til ERG status. Faktisk, når stratificeret for delmængder af ERG-fusion positive og negative kræft, de fleste af foreningen forsvundet. Men for PTEN, den særskilt analyse af ERG-positive og ERG-negative kræft afslørede en slående bimodal forhold med Sox9 udtryk. PTEN sletninger var positivt associeret med Sox9 udtryk i ERG-negativ (p 0,0001, figur 3B), men omvendt er knyttet til Sox9 udtryk i ERG-positive kræftformer (p 0,0001, figur 3C).
(a) alle kræftformer, (b) i ERG-negativ, c) ERG-positive delmængde.
Forholdet til tumor fænotype
Reduceret Sox9 udtryk var knyttet til en ugunstig tumor fænotype, herunder sent tidspunkt , høj Gleason kvalitet, og forhøjede præoperative PSA niveauer (p 0,0001 hver, tabel 2) i alle kræftformer. Men separate analyser af ERG-positive og ERG-negative kræftformer afslørede, at denne forening udelukkende var drevet af den delmængde af ERG-positive kræftformer. Her blev reduceret Sox9 udtryk stærkt knyttet til avanceret tumor stadie, høj Gleason kvalitet, høje præoperative PSA niveauer, tilstedeværelse af nodal metastaser (p 0,0001 hver) og positiv kirurgisk margin (p = 0,001) (tabel 3). I modsætning hertil blev der ikke fundet entydige forskelle mellem Sox9 niveauer og tumor fænotype i ERG-negativ kræft, selv om signifikante p-værdier stadig blev opnået på grund af det meget høje antal prøver i vores undersøgelse (S1 tabel).
Forholdet til PSA recidiv
den prognostiske værdi af Sox9 udtryk afhang ERG status. Fraværende eller reduceret Sox9 ekspression blev stærkt knyttet til biokemisk (PSA) tilbagefald i delmængden af ERG-positive kræftformer (P lt; 0,0001, figur 4A), men ikke i ERG-negative cancere (p = 0,80, Fig 4B). Fordi Sox9 udtryk var knyttet til PTEN status, vi sammenlignet også den prognostiske betydning af Sox9 i kræft med og uden PTEN sletninger. Denne analyse viste, at et tab af Sox9 udtryk var stærkt knyttet til PSA recidiv i PTEN-slettede kræftformer (p = 0,008, Fig 4C), men kun svagt i kræft med normal PTEN kopiere numre (p = 0,02, figur 4D). Den stærkeste sammenhæng mellem tab af Sox9 og dårligt resultat blev fundet i den delmængde af cancere, der huser både ERG-fusion og PTEN deletion (p = 0,001, Fig 4E), mens Sox9 var relateret til prognose i ERG-positive og ERG-negative cancere med normal PTEN status (p = 0,56 og p = 0,73, fig 4G og 4F) eller i ERG-negativ kræft med PTEN sletning (p = 0,27, fig 4H).
(a) ERG-positive (ERG
+) kræft (n = 2906), (b) ERG-negativ (ERG
-) kræft (n = 3407), (c)
PTEN
slettet (PTEN
del) kræft (n = 771), (d)
PTEN
ikke slettes (PTEN
norm) kræftformer (n = 3367), (e) ERG-positive og
PTEN
slettede kræftformer ( n = 512), (f) ERG-negativ og
PTEN
ikke-slettede kræftformer (n = 1859), (g) ERG-positive og
PTEN
ikke-slettede kræftformer (1.391) , (h) ERG-negativ og
PTEN
slettede cancere (n = 238). En detaljeret liste over antallet af patienter med risiko gives for (a) og (b) i S3 tabel.
multivariat analyse
For at vurdere, om den kliniske effekt af Sox9 udtryk i ERG-positive kræftformer huser PTEN sletninger var uafhængig af etablerede prognostiske parametre, vi udførte fire forskellige typer af multivariat analyser Scenarie 1 evalueret alle postoperativt tilgængelige parametre, herunder patologisk tumor stadie, patologisk lymfeknude status (pN), status kirurgisk margen, præoperativ PSA værdi og patologiske Gleason grad opnået efter den morfologiske evaluering af hele resekteret prostata. I scenario 2 blev alle postoperativt tilgængelige parametre med undtagelse af nodal status inkluderet. Den rationelle for denne fremgangsmåde var, at indikationen og omfanget af lymfeknude dissektion ikke er standardiseret i den kirurgiske behandling af prostatakræft, og at udelukke pN i multivariat analyse kan markant øge sagsnumre. To yderligere scenarier havde til formål at modellere den præoperative situation, så meget som muligt. Scenarie 3 omfattede Sox9 udtryk, præoperativ PSA, klinisk tumor stadie (CT etape) og Gleason kvalitet opnået på prostatektomi prøven. Da postoperative bestemmelse af en tumor Gleason klasse er “bedre” end den præoperativt bestemt Gleason bedømmelse (udsat for stikprøvefejl og dermed under-grading i mere end en tredjedel af tilfældene [29]), blev der tilføjet en anden multivariat analyse. I scenario 4, blev den præoperative Gleason kvalitet opnået på den oprindelige biopsi kombineret med præoperativ PSA, CT scenen og Sox9 udtryk. Denne analyse, der var begrænset til den delmængde af ERG-positive og PTEN-slettede kræftformer hvor Sox9 haft stærkest prognostisk effekt i univariat analyse afslørede, at den prognostiske værdi af Sox9 ikke var uafhængig af de etablerede prognosticators (S2 tabel).
diskussion
resultaterne af vores undersøgelse viser, at en klinisk relevans af Sox9 ekspressionsniveauerne eksisterer i prostatakræft, der i høj grad afhænger af den molekylære kontekst af tumorcellerne. Især vores data viser, at den prognostiske relevans Sox9 udtryk er strengt begrænset til den delmængde af ERG-positive tumorer huser PTEN sletninger.
brøkdel af kræft med påviselig Sox9 udtryk i denne undersøgelse var 67%, herunder 51% med moderat til stærk farvning. Disse tal er i den øvre del af tidligere immunhistokemi undersøgelser rapportering 41-55% Sox9 positive kræftformer ved konventionel stor del analyse, der involverer op til 36 tumorer [11,16], eller af TMA undersøgelser rapporterer 46-100% Sox9 positivitet i op til 387 prostatakræft [10,14,17]. Det er mest sandsynligt, at disse forskelle er først og fremmest relateret til tekniske spørgsmål, herunder brug af forskellige antistoffer og scoring kriterier. At sammenlignelige fraktioner af Sox9 positive kræftformer kan findes med både store sektion og TMA tilgange tyder på, at vores analyse forudsat repræsentative data, som ikke mærkbart påvirket af prøveudtagning fejl spørgsmål, der potentielt kan opstå i studier, der evaluerer små væv kerner måler kun 0,6 mm i diameter per patient.
Den vellykkede analyse af mere end 7.500 prostatakræft ikke-i en generel undersøgelse af alle tumorer-afsløre relevante sammenslutninger af en øget Sox9 udtryk med ugunstige tumor fænotype eller dårlig patient prognose som foreslået af tidligere værker [10,14,15,17]. Flere undersøgelser med 98-387 kræftformer havde tidligere foreslået en sammenhæng mellem Sox9 udtryk og dårlige tumor funktioner, såsom høj Gleason kvalitet [10,14,15,17] og endda forkortet samlet patient overlevelse [14]. I modsætning hertil afslørede vore data en bedre patient udfald i tilfælde af høje Sox9 ekspressionsniveauer i undergrupper. I tråd med vores resultater, Zhong et al. demonstrere en prolongued gentagelse interval for tumorer med forhøjede Sox9 niveauer i en kohorte af 147 patienter [15].
Den molekylære database knyttet til vores prostatakræft TMA aktiveret en evaluering af forholdet mellem Sox9 udtryk og andre centrale molekylære træk ved prostatacancer. Ca. 50% af prostatacancere er kendetegnet ved TMPRSS2: ERG fusion, hvilket resulterer i overekspression af ERG transkriptionsfaktoren og massive transkriptionelle forandringer [30]. Da ERG regulerer androgen-receptor (AR) lydhør Sox9 indirekte ved at fungere som en pioner faktor til at åbne en kryptisk AR-reguleret forstærker i Sox9 genet (24.985.976) [31], var det ikke overraskende at finde en stærk forbindelse mellem ERG -fusion positive genotype og stærk Sox9 udtryk. Medtagelsen af deletion data fra flere kromosomale loci afslørede endvidere, at forholdet af Sox9 og ERG ekspression i høj grad afhang af, hvorvidt en PTEN deletion var til stede i en tumor. Desuden viste data en påfaldende dårlig sygdom resultat i en undergruppe af 101 patienter med ERG positive, PTEN slettede kræftformer med fraværende Sox9 udtryk. Disse resultater tyder stærke og klinisk relevante interaktioner mellem disse proteiner. Et funktionelt forhold af PTEN og Sox9 er faktisk understøttet af to undersøgelser under anvendelse af prostatacancer musemodeller [14,16]. Disse undersøgelser har antydet en kooperativ rolle Sox9 og PTEN tab for prostata tumor dannelse [14] af Sox9 hæmning af retinoblastoma (RB1) tumor suppressor [16] med henblik på at omgå cellulær ældning induceret af PTEN tab [32]. En sådan samarbejdsrolle passer godt til vores observation, at Sox9 ekspression blev knyttet til PTEN deletion i det mindste i den delmængde af cancere mangler ERG fusion.
Men omvendt sammenhæng mellem tab af Sox9 overekspression og PTEN deletion fundet i ERG -positive cancere tyder på, at meget høje Sox9 proteinniveauer-som induceret af ERG-fusion-måske ikke i sig selv giver en markering fordel PTEN-deleteret cancerceller. Da progression til high-grade sygdommen er parallelt med en reduktion af Sox9 ekspression i ERG-positive kræftformer, meget stærk Sox9 overekspression kan endda modvirke tumorvækst. Dette kan mekanistisk forklares gennem antagonistiske virkninger i veje er omfattet af både ERG og Sox9. For eksempel, mens ERG aktiverer kanoniske ß-catenin /WNT signalering [33,34], Sox9 bidrager til at skifte mellem vækstfremmende og differentiering-initierende konsekvenser af denne vej [35,36]. Det er således, fristende at spekulere, at stærke Sox9 overekspression hæmmer progression gennem tvungen differentiering, og at ERG-positive kræftceller derfor nødt til at gennemgå tilpasning skridt til at tilpasse Sox9 udtryk til et niveau, der er foreneligt med tumor progression. Da den værste prognose blev fundet for PTEN-slettet, og ERG-positive tumorer, der helt manglede enhver påviseligt Sox9 udtryk, måske Sox9 endda svække tumorvækst i dette specifikke molekylære baggrund. Sådan en afgørende rolle i den molekylære miljø på tumorfremmende eller tumor-suppressive aktivitet af Sox9 understøttes også af cellelinie og xenograft forsøg, der viser, at Sox9 overekspression kan føre til øget tumorvækst og invasion i nogle cellelinjer [13], men til reduceret tumorgenicitet i andre [37].
det er bemærkelsesværdigt, vores data tyder på, at Sox9 kan give betydelige yderligere prognostisk information ud over PTEN sletning-en af de stærkeste kendte enkelt prognosticators i prostatakræft, men samtidig også vise, at værdien af Sox9 som en formodet molekylær markør er begrænset til den lille delmængde af omkring 10-15% af prostatakræft huser både ERG-fusion og PTEN deletion. Sox9 er således et interessant eksempel for muligvis mange flere gener, der kan udøve enten en tumor fremme eller en tumor undertrykkende virkning afhængigt af den enkelte molekylære stillads som følge af specifikke kombinationer af genomiske forandringer i prostata kræftceller [33,34,38]. Sådanne observationer udfordrer begrebet generelt gældende multiparameter prognostiske tests, der genererer en simpel prognose score med en lignende indvirkning på alle kræftformer.
Sammenfattende resultaterne af vores undersøgelse viser, at Sox9 udtrykkes i en stor del af prostata cancere, men har en variabel prognostisk virkninger afhængigt af den molekylære miljø. Den slående begrænsning af den prognostiske betydning af Sox9 tab for delmængde af ERG-positive kræftformer med PTEN sletninger giver yderligere bevis for eksistensen af klinisk relevante molekylært distinkte undergrupper af prostatakræft.
Støtte Information
S1 Table . Klinisk-patologisk sammenslutning af Sox9 immunfarvning i ERG negative delmængde
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128525.s001
(DOC)
S2 Table. Multivariat analyse herunder Sox9 udtryk status i ERG-positive og PTEN slettet prostatakræft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128525.s002
(DOC)
S3 Table. Antallet af patienter med risiko for biokemisk tilbagefald i ERG-negative og ERG positive kræftformer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128525.s003
(XLS)
Tak
Vi takker Janett Lüttgens, Sünje Seekamp og Inge Brandt for fremragende teknisk bistand.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.