PLoS ONE: Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R) Udtryk og overlevelse i operativ pladecellehistologi-Cell Laryngeal Cancer

Abstrakt

Introduktion

Prognose for patienter med operabel larynxcancer er meget varierende og derfor potente prognostiske biomarkører er berettiget. Insulin-lignende vækstfaktor receptor (IGFR) signalvejen spiller en afgørende rolle i larynx carcinogenese og progression.

Patienter og metoder

Vi identificerede alle patienter med lokaliseret TNM stadium I-III larynxcancer forvaltet med potentiel kurativ kirurgi mellem 1985 og 2008. immunhistokemisk (IHC) udtryk for IGF1R-alpha, IGF1R-beta og IGF2R blev evalueret ved brug af immunoreaktive score (IRS) og mRNA-niveauer af vigtige effektorer af IGFR vej blev vurderet, herunder IGF1R, IGF-bindende protein 3 (IGFBP3), suppressor af cytokin signalering 2 (SOCS2) og medlemmer af MAP-kinase (MAP2K1, MAPK9) og phosphatidyl-inositol-3-kinase (PIK3CA, PIK3R1) familier. Cox-regressions modeller blev anvendt til at vurdere den prædiktive værdi af biomarkører på sygdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS).

Resultater

Blandt 289 egnede patienter, 95,2% var nuværende eller ex rygere, 75,4% var alkoholmisbrugere, 15,6% havde lymfeknude-positiv sygdom og 32,2% havde modtaget postoperativ bestråling. Efter en median opfølgning på 74,5 måneder, median DFS var 94,5 måneder, og median OS var 106.3 måneder. Brug af median IRS som den foruddefinerede cut-off, havde patienter, hvis tumorer øget IGF1R-alpha cytoplasma eller membran udtryk oplevede marginalt kortere DFS og betydeligt kortere OS i forhold til dem, hvis tumorer havde lav IGF1R-alfa-ekspression (91,1 vs 106.2 måneder, p = 0,0538 og 100,3 vs 118,6 måneder, p = 0,0157, henholdsvis). Øget mRNA niveauer af MAPK9 var forbundet med forlænget DFS (p = 0,0655) og OS (p = 0,0344). I multivariat analyse blev IGF1R-alfa overekspression associeret med en stigning 46,6% i sandsynligheden for tilbagefald (p = 0,0374). Uafhængige prædiktorer for dårlig OS inkluderet lymfeknude-positiv sygdom (HR = 2,569, p 0,0001)., Subglottic /transglottic lokalisering (HR = 1,756, p = 0,0438) og IGF1R-alpha protein overekspression (HR = 1,475, p = 0,0504)

Konklusion

IGF1R-alpha protein overekspression kan fungere som en uafhængig prædiktor for tilbagefald og overlevelse i operabel larynxcancer. Fremadrettet evaluering af IGF1R-alpha prognostisk nytte er berettiget

Henvisning:. Mountzios G, Kostopoulos I, Kotoula V, Sfakianaki I, Fountzilas E, Markou K, et al. (2013) Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R) Ekspression og overlevelse i operabel Pladecellekræft-Cell larynxcancer. PLoS ONE 8 (1): e54048. doi: 10,1371 /journal.pone.0054048

Redaktør: Rodrigo Alexandre Panepucci, Hemocentro de Ribeirão Preto, HC-FMRP-USP, Brasilien

Modtaget: 30 juli, 2012; Accepteret: December 5, 2012; Udgivet: januar 24, 2013 |

Copyright: © 2013 Mountzios et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist finansieret af den græske Cooperative Oncology Group (HE R_5G forskningsbevilling). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

larynxcancer repræsenterer den mest almindelige form for pladecellekræft i hoved og hals (SCCHN) i populationer med høj forekomst af rygning. Regnskab for ca. 160.000 nye tilfælde om året, og for 2,5% af alle tumorer i hanner, larynx cancer fortsat en stor sygdomsbyrde verdensplan [1]. Trods nylige fremskridt i tværfaglige forvaltning af de tidlige stadier af sygdommen, herunder kirurgiske udryddelse eller larynx-konservering protokoller til gennemførelse kemostråleterapi, vil en væsentlig andel af patienter med lokaliseret eller lokalt avanceret sygdom i sidste ende tilbagefald og dø [2]. Selv for patienter, der gennemgår den mutilating processen med total laryngektomi, prognose er meget variable og unpredictible, hvilket gør behovet for at identificere potente prognostiske markører en medicinsk prioritet. Nøjagtig og reproducerbar estimering af prognose hos patienter med tidlig larynxcancer ville muliggøre aggressiv behandling af dem med høj risiko for tilbagefald og ville undgå potentielt farlige overbehandling i gruppen med en formodet positivt resultat.

insulin og insulin-lignende vækstfaktor receptor (IGFR) – medierede molekylære veje har for nylig dukket op som vigtige effektorer af neoplastisk transformation i forskellige maligniteter af den aerodigestive tarmkanalen, herunder ikke småcellet lungecancer [3], [4], kræft i skjoldbruskkirtlen [5], [6 ], esophageal cancer [7] og SCCHN [8]. Den IGFR pathway omfatter to ligander (IGF1 og IGF2), deres bindingsproteiner (den mest udbredte bliver IGFBP-3) og to receptorer (IGF1R og IGF2R), [2]. I modsætning insulin, der virker som en typisk hormon, IGF1 og IGF2 har legitimationsoplysninger både som cirkulerende hormoner med autokrine egenskaber og som vævsvækstfaktorer; IGF1R har evnen til signaltransduktion gennem intracellulære tyrosinkinasedomæne forbundet med RAS /RAF /mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) -Akt pathways [9]. Præcursorpolypeptid spaltning fører til tilstedeværelsen af ​​to IGF1R isoformer: isoform alpha (IGF1R-alpha), som fortrinsvis udtrykkes i mange cancertyper og er i stand til at binde til insulin, IGF1 og IGF2, og isoform-beta (IGF1R-beta), der binder udelukkende insulin [10]. IGF2R, på den anden side, kun binder til IGF2, er strukturelt forskellige i den forstand, at det mangler et intracellulært tyrosinkinasedomæne, og fratages således fra evnen til at transducere mitogene signaler, der optræder hovedsageligt som en “buffer” for IGF2 bioaktivitet [ ,,,0],10]. Undertrykkeren af ​​cytokin signalering (SOCS) familien af ​​proteiner er inhibitorer af signalveje gennem en negativ feedback loop hovedsagelig involverer inhibering af Janus-kinase aktivitet [11], [12]. Nyere data, dog tyder på, at SOCS proteiner og især SOCS2 kan også modulere IGF1R-medieret signalering [13], [14]. Vigtigere, prækliniske og translationelle undersøgelser viser, at komponenter af IGFR-medieret vej er impliceret i SCCHN risiko [15], angiogenese [16], farmakogenetik [17], [18], kemosensitivitet [19], immunterapi [20] og stråling respons [21].

i en nylig skelsættende arbejde i marken [22] en multigenfamilie indikator for tilbagefald i begyndelsen larynxcancer blev udviklet og valideret. I denne undersøgelse, et panel af gener, der koder for medlemmer af IGFR vej opstået som en potent prognostisk redskab i stand til at skelne patienter med dårlig og gunstig prognose (p 0,0001 i sættet træning og p = 0,0001 i første validering sæt) [22 ]. Disse resultater genereret den hypotese, at proteinekspression og mRNA-niveauer af de vigtigste effektorer af IGFR pathway kan være forbundet med kliniske resultat hos patienter med tidlig larynx cancer og kan således tjene som prædiktive biologiske markører for tilbagefald og overlevelse i denne indstilling. For at teste denne hypotese, vi efterfølgende undersøgt tumoral gen transskription af vigtige elementer i IGFR vej og vi evaluerede proteinekspression af de samme molekyler i tumorceller fra patienter med kirurgisk resektion larynxcancer.

Patient Karakteristika og metoder

Patient kohorte

undersøgelsen blev gennemført med tilbagevirkende kraft i en kohorte af patienter med lokaliseret stadium i-III larynxcancer (TNM 6th klassificering, findes på: https://www.uicc.org/node/7735), der forvaltes mellem maj 1985 og juni 2008 ENT Department of “AHEPA” Hospital i Thessaloniki, Grækenland, med potentiel kurativ resektion med eller uden ekstern bestråling. Den foreliggende undersøgelse blev godkendt af bioetiske komité ved Aristoteles-universitetet i Thessaloniki, School of Medicine. Ophævelse af samtykke blev opnået fra dette udvalg for alle patienter inkluderet i studiet før 2003. Alle patienter inkluderet i studiet efter 2003, forudsat at deres informeret skriftligt samtykke til levering af biologisk materiale til fremtidige undersøgelser. Undersøgelsen opfyldte bemærkningen anbefalinger til tumor markør prognostiske undersøgelser ved hjælp af biologisk materiale (findes på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2361579).

Patienterne blev evalueret klinisk ved regelmæssige månedlige besøg i det første år efter operationen og hver anden måned derefter og iscenesat med røntgen af ​​thorax, livmoderhalskræft, bryst og øvre abdominal CT-scanner hver sjette måned i de første to år efter operationen og årligt derefter eller tidligere, hvis klinisk indiceret. Andre diagnostiske eller mellemstationer procedurer blev udført på kliniske indikationer eller symptom alarm. Behandling effekt evaluering blev udført i overensstemmelse med kriterierne RECIST for solide tumorer (www.eortc.be/recist/documents/RECISTGuidelines.pdf~~number=plural).

Histologisk evaluering

En erfaren patolog revideret hæmatoxylin-eosin (H 50% tumorceller i 64,2% af tilfældene og 30-50% i de resterende. Rutediagrammet af undersøgelsen, herunder de tilsvarende prøvenumre er præsenteret i figur 1 (BEMÆRK diagram).

RNA ekstraktion og RT-qPCR metode

I alt 230 tumor-holdige paraffinblokke var tilgængelige for molekylære undersøgelser (figur 1). Macrodissection blev udført i tilfælde med 50% tumorceller for at øge tumor celleindholdet i molekylære prøver. Efter afparaffinering og overnatning vævsfragment lysis med proteinase K ved 56 ° C, blev RNA ekstraheret med TRIzol® LS Reagent og revers transkriberet med vilkårlige primere (kat. Nr 48.190-011) og SuperScript® III revers transkriptase (alle reagenser fra Invitrogen /Life Technologies, Paisley, UK) ifølge producentens instruktioner. Ved UV-målinger blev 0,5-3 ug totalt RNA revers transkriberet, cDNA’er blev normaliseret ved 25 ng skabelon /ul og holdt ved -20 ° C indtil anvendelse. Relativ mRNA-ekspression blev vurderet med qPCR og hydrolyse sonder ved hjælp af færdiglavede enkelt rør TaqMan® genekspression Analyser (Applied Biosystems /Life Technologies) i et ABI7900HT system under standard betingelser for følgende mål (i parentes: assay ID, Genbank reference amplicon placering ; størrelse): IGF1R (Hs00609566_m1, NM_000875.3, exon 10-11, 64 bp), IGFBP3 (Hs00426289_m1, NM_000598.4, NM_001013398.1, exon 4-5; 84 bp), MAP2K1 (Hs00983247_g1; NM_002755.3; exon 10-11, 68 bp), MAPK9 (Hs00177102_m1, NM_001135044.1, NM_002752.4, NM_139068.2, NM_139069.2, NM_139070.2, exoner 2-3, 102 bp), PIK3CA (Hs00180679_m1; M_006218.2; exoner 6-7, 104 bp), PIK3R1 (Hs00933163_m1, NM_001242466.1, NM_181504.3, NM_181523.2, NM_181524.1; exon 8-9, 9-10, 15-16, 82 bp), og, SOCS2 ( Hs00919620_m1; NM_003877.3; exoner 2-3; 91 bp). Prøver blev testet i 10 ul reaktioner (50 ng skabelon /reaktion) med TaqMan® Universal PCR Master Mix og blev kørt i dubletter i 384-brønds plader. Et kommercielt tilgængeligt henvisning RNA (TaqMan® Kontrol Total RNA, kat. Nr 4.307.281, Applied Biosystems /Life Technologies) blev anvendt som en positiv kontrol i hvert forsøg. Som en endogen kontrol og til en normalisering af Cq (kvantificering cyklus, der er synonymt med CT [tærskel cyklus]) værdier, en analyse målrettet GUSB mRNA (beta-glucuronidase [# 4333767F]) blev anvendt. GUSB blev foretrukket frem normalt anvendte endogene kontrol, fordi (a) ingen pseudogener er endnu blevet rapporteret for dette gen, og (b) den er blevet identificeret som en blandt de bedst bevarede mRNA mål i FFPE væv [23]. Relativ kvantificering (RQ) blev vurderet i en lineær tilstand som (40 – DCT) [24], hvorved DCT = (gns CT target) – (avg CT GUSB). PCR assay stabilitet blev evalueret blandt kørsler med reference-RNA (inter-run deltaRQs: IGF1R 0,78; IGFBP3 0,72, MAP2K1 0,39, MAPK9 0,92, PIK3CA 0,62; PIK3R1 0,59; SOCS2 0,92). Eksklusionskriterier for prøve RQ analyse var GUSB CT værdier højere end 36 for hver to eksemplarer; og, deltaRQ værdier højere end 0,85 per dublerede par. Med ovennævnte kriterier, blev informative resultater opnået i 191 (83%) ud af 230 FFPE RNA-prøver. Imidlertid er antallet af informative prøver lå mellem 175 (75%) for IGF1R til 138 (59%) for SOCS2 resulterer i kun 118 (51%) informative prøver til alle mål. Således ophobning af RQ-værdier for vurderingen af ​​de tilsvarende genekspressionsprofiler kunne ikke vurderes.

TMA konstruktion, immunhistokemi og pointsystemet

TMA byggeriet blev udført som tidligere beskrevet [25] . Kort fortalt serielle 3 mm tykke sektioner danner de oprindelige blokke eller TMA blokke, monteret på vedhæftning objektglas, blev skåret i Laboratoriet for Molekylær onkologi Den Hellenske Foundation of Cancer Research, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki School of Medicine. Den immunhistokemiske (IHC) mærkning blev udført under anvendelse af Bond Max ™ (Leica Microsystems, Wezlar, Tyskland) og i6000 (Biogenex, San Ramon, CA) autostainers. Snittene blev farvet med anti-IGF1R-alpha (klon 24-31, Lab Vision, Fremont, CA, ved 1:50 fortynding i 1 time), anti IGF1R-beta (C-20, SC-713, polyklonalt antistof, rettet mod et peptid mapping ved C-terminalen af ​​IGF-ia-molekyle, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, ved 1:250 fortynding i 1 time) og IGF-2R (C-15, SC-14410, ged polyklonale antistof, Santa Cruz, ved 1:250 fortynding i 1 time). Antigen-antistof-kompleks blev visualiseret ved anvendelse af diaminobenzidin (DAB) som et chromogen. Objektglas blev modfarvet med Mayers hematoxylin, vasket i ferskvand, dehydreret, og monteret. Som eksterne kontroller, vi anvendte kerner (12 i alt for hver TMA) fra forskellige ikke-neoplastiske og neoplastiske væv, herunder placenda, endometrium, nyre, tonsil, brystkirtel, lymfeknude, prostatacancer og pladecellekræft i hoved og hals. Som interne kontroller, brugte vi den nærliggende epitel af slimhinder kirtler og den normale, hyperplastiske og dysplastiske søjleformet epitel.

Til vurdering af IGF1R-alpha, IGF-1R-beta og IGF2R brugte vi en semikvantitativ tilgang baseret på farvningsintensitet (SI) og procentdelen af ​​positive celler (PP), for at skabe det immunoreaktive score (IRS) som følger: IRS = SIxPP, for hver prøve, som tidligere beskrevet [26], [27]. Intensitet blev scoret som følger: 0 = ingen farvning, 1 = svagt positiv, 2 = moderat positiv, og 3 = stærkt positiv. Scoring af farvningsmønstret var baseret på procentdelen af ​​positive tumorceller: 0 = 0-5%, 1 = 6-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-100%). IRS score således varierede fra 0 til 9. lokalisering af farvning for hvert protein blev også indikeret enten som cytoplasmatisk eller cytoplasmatisk /membranøs eller membranøs.

Alle uharmoniske sager blev løst inden for konsensus møder. For at undgå falske positive resultater skyldes flere cut-off beregninger, vi brugte medianværdien af ​​IRS som den foruddefinerede cut-off for hver markør, som tidligere foreslået [25]. En tumor prøve blev betragtet som “high-udtryk”, hvis skattemyndighederne var over eller lig med medianen og “lav-” på anden måde.

statistiske overvejelser

Med hensyn IHC udtryk for IGF1R og IGF2R den median IRS var på forhånd defineret som kandidat cut-off for at vurdere den prognostiske rolle IGFR om sygdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS). Med hensyn biomarkører, hvis ekspression blev målt på mRNA niveau deres fordeling blev undersøgt for naturlige cut-offs. I tilfælde af nogen identifikation af en naturlig afskæring, blev de første, anden og tredje kvartiler undersøgt ved hjælp af univariate Cox regressionsanalyse som mulige tærskelværdier. Hvis en afskæring viste prognostisk betydning det blev brugt til dichotomize prøverne i lave og høje udtrykkende tumorer. Yderligere kandidat cut-offs blev undersøgt med brug af receiveren opererer karakteristiske kurver (ROC) med 3-års observerede DFS sats som binær resultat valideret med bootstrap analyse. I det tilfælde, at ingen afskæring blev identificeret medianen blev anvendt. I multivariat analyse signifikans blev bestemt på niveau med 15%, og i univariate på 5% (to-sidet).

DFS blev målt fra tidspunktet for diagnosen, indtil verificerede sygdomsprogression, død eller sidste kontakt og OS fra diagnose indtil død uanset årsag eller dato for sidste kontakt. Time-to-begivenhed fordelinger blev estimeret ved hjælp af Kaplan-Meier kurver. Associationer mellem biomarkører og med basiske patient- og tumor egenskaber blev undersøgt under anvendelse af Fishers eksakte test for kategoriske variabler og Mann-Whitney eller Kruskall-Wallis test, hvor hensigtsmæssigt for kontinuerte variable. Til kontinuerlig mRNA-ekspression korrelationerne blev beregnet under anvendelse af Pearsons korrelation test. Den statistiske analyse overholdt de rapporterende anbefalinger til tumor markør prognostiske undersøgelser [28].

Resultater

klinisk-patologisk karakteristika og resultatet

To hundrede og firs-ni patienter, for det meste mænd (95,8%), nuværende eller tidligere rygere (95,2%) og alkoholmisbrugere (75,4%), med en gennemsnitsalder på 63 år på diagnose, blev inkluderet i nærværende analyse. Som vist i tabel 1, diagnostisk oparbejdning førte til diagnose af pladecellekræft i strubehovedet overvejende supraglottisk (46,7%) eller glottiske (43,3% af tilfældene), for det meste iscenesætte T3-4 (77,8% af tilfældene) og oftere node ekskluderet på klinisk /radiologisk undersøgelse (84,1%). Indledende forvaltning bestod af kirurgisk resektion af tumoren ved hjælp af fuldstændig laryngektomi (84,1%) eller som konservativ procedurer (15,9%). En hals dissektion blev udført i 29,1% af tilfældene, mens postoperativ strålebehandling ved ekstern bestråling blev administreret i 32,2%.

Ved en median follow-up tid på 74,5 måneder, 135 (46,7%) patienter havde tilbagefald og 117 (40,5%) var død. Medianen og 5-års DFS var 94,5 måneder (95% CI: 80.9-108 måneder), og 60,8%, henholdsvis mens median og 5-års OS var 106.3 måneder (95% CI: 89.3-123.3 måneder), og 66,1% , henholdsvis. Som forventet median OS var signifikant kortere for patienter med lymfe-knude positive sygdom i forhold til dem med lymfe-knude negative (28,7 vs 106,5 måneden, s 0,001), for patienter over 63 år på diagnosetidspunktet sammenlignet med yngre dem (87,3 vs 139,1 måneder, p = 0,006) og for patienter, hvis tumorer havde en subglottic eller transglottic placering i forhold til dem, hvis tumorer blev placeret supraglottically (82,8 vs 117,5 måneder, p = 0,01). I forhold til patienter, der oprindeligt havde gennemgået total laryngektomi, patienter, der havde gennemgået mere konservativ kirurgi oplevede statistisk signifikant kortere median DFS (55,9 vs 106,2 måneder, p = 0,011), men ikke OS (124,8 vs 106.3 måneder, p = 0,671), sandsynligvis på grund til virkningen af ​​bjærgning laryngektomi.

IHC Ekspression af IGFR og korrelation med resultaterne

Resultater af IHC-farvning blev opnået for 285 (98,6%) af tumorprøver for alle tre markører (IGF1R-alpha , IGF1R-beta og IGF2R). Mønsteret af immunfarvning for IGF1R-alpha var overvejende cytoplasmatisk og /eller membranøs og var moderat til stærk (IRS≥3) i 56,1% af tilfældene (figur 2A). Tværtimod IGF1R-beta immunofarvning var hovedsagelig cytoplasmisk (figur 2B). og var fraværende (IRS = 0) i 81,7% af tilfældene, på trods af positive interne kontroller (makrofager og stroma). IGF2R immunfarvning var overvejende cytoplasmatisk og var moderat til stærk (IRS≥2) i 53,6% af tilfældene, (Figur 2C). Notatet blev observeret en signifikant co-ekspression mellem IGF1R-alfa cytoplasmatisk og IGF1R-alpha membranøs immunfarvning (r = 0,28, p 0,0001), men ikke mellem IGF1R-alfa og IGF1R-beta (r = -0,02, p = 0,779) eller mellem IGF1R-alfa og IGF2R (r = 0,09, p = 0,133). Disse resultater opfordrede os til yderligere at udforske IGF1R-alpha cytoplasmatisk /membranøs IHC udtryk i forhold til klinisk-patologiske variabler.

A. IGF1R-alpha stærk membranagtige farvning i 100% af cancerceller (IRS = 9); B. IGF1R-beta stærk cytoplasmatisk farvning i 80% af cancerceller (IRS = 9); C. IGF2R stærk cytoplasmatiske og membranagtige farvning i 80% af cancerceller (IRS = 9). Alle billeder: forstørrelse X 40.

Som vist i tabel 2, blev høj ekspression af IGF1R-alpha (IRS≥3) signifikant associeret med træk af fremskreden sygdom, herunder TNM stadie III eller IV på diagnosetidspunktet (p = 0,011) og total laryngektomi som den første kirurgiske indgreb (p = 0,018). Tværtimod blev IGF1R-beta og IGF2R IHC udtryk ikke er forbundet med nogen af ​​de klinisk-patologiske undersøgte variable (data ikke vist). I univariat analyse, patienter, hvis tumorer overudtrykt cytoplasma /membran IGF1R-alfa oplevede marginalt kortere median DFS i forhold til dem, hvis tumorer ikke (91,1 vs 106,2 måneder, p = 0,0538), og statistisk signifikant kortere median OS (100,3 vs 118,6 måneder, p = 0,0157), (figur 3). Ingen af ​​de andre IHC markører viste nogen sammenhæng med overlevelse resultater, heller ikke kombinationen af ​​IGF1R-alpha IHC udtryk med enhver anden markør afkast yderligere oplysninger om patientens udfald.

mRNA-ekspression og korrelation med resultatet

Tilgængeligheden af ​​tumorprøver til vurdering af mRNA-ekspression for hver af de biomarkører er tilvejebragt i figur 1. for at vurdere mRNA ekspression af IGFR pathway-gener og at screene deres fordeling til naturlig cut -offs, frekvenshistogrammer RQ værdier for hver biomarkør blev plottet og de tilsvarende boxplots blev konstrueret (fig S1). Modtager operatør karakteristik (ROC) analyse ved hjælp af 3-års DFS som indikator og kvartil analyse af fordelinger identificeret som cut-offs medianen for IGF1R, IGFBP3, MAP2K1, MAPK9, PI3KR1 og SOCS2 og 61

st percentil for PIK3CA. Når markører forening blev vurderet i en kontinuerlig form blev IGF1R mRNA-ekspression signifikant associeret med mRNA ekspressionen af ​​IGFBP3 (r = 0,22, p = 0,0032), MAP2K1 (r = 0,50, p 0,0001), MAPK9 (r = 0,51, p 0,0001), PIK3R1 (r = 0,37, p 0,0001) og SOCS2 (r = 0,27, p = 0,0014), hvilket indikerer, at IGF1R mRNA co-udtrykkes med alle andre vigtige effektorer af den molekylære pathway IGF. Downstream molekyler af de to vigtigste signalleringskaskader udløst af IGFR aktivering (MAPK9 med MAP2K1 og PIK3CA med PIK3R1) blev også signifikant korreleret med hinanden i form af mRNA-ekspression. Endelig blev IGFBP3 mRNA-ekspression korrelerede med MAPK9, PIK3CA og SOCS2 mRNA-ekspression (tabel S1).

Ingen af ​​biomarkørens mRNA-ekspression, vurderet som kontinuerligt variabel, var forbundet med nogen af ​​de klinisk-patologiske undersøgte variable (data ikke vist). I univariate analyse og brug af de identificerede afskæringsværdier, patienter, hvis tumorer havde høj MAPK9 mRNA-ekspression oplevede marginalt længere median DFS (91,8 vs 81.0 måneder, p = 0,0665) og statistisk signifikant længere median OS (117,5 vs 87,3 måneder, p = 0,0344 ), sammenlignet med patienter, hvis tumorer havde lave MAPK9 mRNA-niveauer. Tilsvarende patienter, hvis tumorer havde høj PIK3CA mRNA-ekspression oplevet længere -albeit ikke significantly- median DFS (106,2 vs 80,5 måneder, p = 0,0723) og median OS (141,8 vs 94,5 måneder, p = 0,0726), sammenlignet med patienter, hvis tumorer havde lave PIK3CA mRNA-niveauer (tabel S2).

Korrelation af IGF1R IHC udtryk med mRNA niveauer

Vi observerede en ikke-signifikant tendens til co-ekspression af IGF1R-alpha membranøs eller cytoplasmatisk farvning og IGF1R -alfa mRNA-niveauer, som vurderet med Spearmans korrelation test (r = 0,14, p = 0,0621), (fig S2). Men der var ingen korrelation af IGF1R-alpha IHC udtryk med mRNA-niveauer af nogen af ​​de andre biomarkører evaluerede (data ikke vist)

Multivariat analyse

I multivariat analyse, uafhængige prædiktorer for DFS. var typen af ​​kirurgi (laryngektomi vs konservativ kirurgi), lymfeknude status (positiv vs negativ), køn (mand vs hun), alder ved diagnose (over eller under medianen af ​​63 år), tumor placering (subglottic /transglottic vs supraglottisk /glottiske) og IGF1R-alpha cytoplasmatiske eller membranøs IHC ekspression (høj vs lav), (figur 4A). Potente prædiktorer for DSF var hankøn, der var forbundet med en mere end fire ganges stigning i risikoen for tilbagefald (HR = 4,459, 95% konfidensinterval fra 1,079 til 18,436, p = 0,039) og tilstedeværelsen af ​​infiltrerede (positive) lymfeknuder , der var forbundet med en mere end to-fold stigning i den samme risiko (HR = 2,313, 95% CI 1,477-3,622, p = 0,0002). Vigtigt er det, patienter, hvis tumorer overudtrykt IGF1R-alfa havde en stigning i risikoen for tilbagefald 46,6%, når der korrigeres for alle de ovennævnte prædiktive faktorer (HR = 1466, 95% CI: 1,022-2,102, p = 0.0374).

Den endelige model for OS omfattede de samme klinisk-patologiske variabler plus T-stadie (T3 /T4 vs T1 /T2). De mest magtfulde negative prognostiske faktorer for OS var infiltreret lymfeknuder (HR = 2,569, 95% CI: 1,610-4,100, p 0,0001), alder mere end 63 år (HR = 1,785, 95% CI: 1,211-2,630, p = 0,0034) og subglottic /transglottic placering (HR = 1,756, 95% CI: 1,016-3,036, p = 0,0438). Som vist i figur 4B, øget cytoplasmatisk eller membranøs IGF1R-alpha-protein-ekspression, var forbundet med en absolut stigning 47,5% i risikoen for dødsfald efter justering for alle andre klinisk-patologiske parametre, og dette resultat var marginalt signifikant (HR = 1,475, 95% konfidensinterval : 1,000-2,178, p = 0,0504). Især inkorporeringen af ​​IGF1R IHC udtryk i multivariate model aktiveret lagdeling af patienter i tre grupper med særskilte prognose afhængigt af antallet af negative prognostiske faktorer (1-2, 3 og 4 eller flere negative faktorer for den gunstige, mellemliggende og ugunstige prognose gruppe henholdsvis). For eksempel, median OS var 70,7 måneder (95% CI: 35.4-100.3 måneder) for patienter i den ugunstige prognose gruppen og 106.3 måneder (95% CI: 84.8-130.4 måneder) i den mellemliggende prognose gruppen, mens det ikke blev nået i den gunstige prognose gruppen (figur 5).

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, den eneste til vores viden udforske den prognostiske rolle IGF1R tidligt larynxcancer, vi har vist at øget IGF1R-alpha cytoplasmiske og /eller membranagtige ekspression, som vurderet ved immunohistokemi og kvantificeres med IRS-systemet, er en uafhængig negativ prognostisk faktor for tilbagefald og overlevelse i patienter med tidlig (kirurgisk resektion) pladecellekræft af strubehovedet. IGF1R-alfa udtryk forblev en væsentlig prognostisk faktor for både DFS og OS, selv efter justering for veldefinerede klinisk-patologiske variabler, såsom livmoderhalskræft lymfeknude involvering, alder og tumor placering. Disse resultater er i overensstemmelse med nyligt offentliggjorte vigtige beviser på gen arrays [22], der fremhæver betydningen af ​​IGFR-medierede molekylære vej i larynx carcinogenese og progression; Notatet nuværende behandlingsmodaliteter i tidlige stadier af larynx cancer omfatter kirurgisk resektion med eller uden adjuverende strålebehandling, som bruges i vores kohorte, hvilket gør dermed vores resultater rettidig og klinisk relevant. Desuden gennemførlighed og reproducerbarhed af IRS evaluering i selvstændige patologi laboratorier gør IGF1R-alpha proteinekspression en tiltalende biomarkør for rutinemæssig klinisk praksis, der kan tjene som en beslutning værktøj til mere aggressiv behandling i begyndelsen af ​​larynx cancer.

IGFR-medierede molekylær vej har konsekvent været impliceret i neoplastisk transformation og progression i et antal humane maligniteter, herunder den aerodigestive tarmkanalen og har således længe tiltrukket sig opmærksomhed både som en potentiel prognostisk biomarkør [9], [10] og som en potentiel mål for terapeutisk indgriben [11], [12]. Data om IGFR prognostisk værdi i NSCLC er snarere modstridende [3], [4], [29], selv om en nyere undersøgelse [5] viste, at IGF1R proteinekspression er højere i skællede-celle histologier og konkluderede, at IGF1R protein og genekspression var ikke forbundet med overlevelse, mens

IGF1R

genkopitallet nærede prognostisk værdi. I larynxcancer, betyder manglen på data ikke mulighed for sikre konklusioner: IGF1R og IGFBP3 serum blev ikke identificeret som væsentlige prædiktorer for kliniske resultater i den eneste store kohorte af 540 patienter med SCCHN, herunder 440 patienter med larynx cancer, hidtil offentliggjorte [9]; Denne undersøgelse bedømmes dog udelukkende serumniveauer af IGF1R og IGFBP3 og ikke tumoral mRNA niveauer eller IHC ekspression, som i vores kohorte. Interessant nok har IGFBP3 blevet rapporteret at virke som en undertrykker af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) i SCCHN angiogenese [16] og til at blive nedreguleret i de tidlige faser af hoved og hals carcinogenese [30]. I oral pladecellekræft, har IGFBP3 mRNA-ekspression er blevet korreleret med en gunstigere resultat, yderligere underbygger sin rolle som en IGF1 inaktivator [31]. I en nyligt offentliggjort undersøgelse [32], at kombinationen af ​​IGF1R og IGFBP3 IHC overekspression var prognostisk for dårlig overlevelse i en kohorte af 131 patienter med SCCHN. I vores kohorte, udelukkende bestod af patienter med larynx cancer, har inkorporeringen af ​​IGFBP3 IHC udtryk ikke forbedre den prognostiske kapacitet IGF1R alene. Endelig forbliver den rolle IGF2R i larynxcancer at blive belyst [33], selv om det forekommer sandsynligt, at manglen på en tyrosinkinasedomæne fratager receptoren fra evnen til at transducere proliferative signaler og dette kan forklare fraværet af prognostiske værdi af markør observeret i vores kohorte.

Et vigtigt element i udformningen af ​​vores undersøgelse var brugen af ​​separate monoklonale antistoffer rettet mod to forskellige isoformer af IGF1R protein (alfa og beta).