PLoS ONE: Anti-cancer effekt af Thiacremonone gennem nedregulering af Peroxiredoxin 6

Abstrakt

Thiacremonone (2, 4-dihydroxy-2, 5-dimethyl-thiophen-3-on) er en antioxidant stof som en ny svovlforbindelse genereret fra High-Temperature-High-Pressure-behandlede hvidløg. Peroxiredoxin 6 (PRDX6) er medlem af peroxidaser, og har glutathionperoxidase og calcium-uafhængig phospholipase A2 (iPLA2) aktiviteter. Flere undersøgelser har vist, at PRDX6 stimulerer lungekræft cellevækst via en forhøjelse af glutathionperoxidaseaktivitet. En docking model studie og træk ned assay viste, at thiacremonone helt passer på det aktive site (cys-47) af glutathion peroxidase af PRDX6 og interagerer med PRDX6. Undersøgte vi således om thiacremonone hæmmer cellevækst ved at blokere glutathionperoxidase af PRDX6 i de menneskelige lunge kræftceller, A549 og NCI-H460. Thiacremonone (0-50 ug /ml) inhiberede lungekræft cellevækst i en koncentrationsafhængig måde gennem induktion af apoptotisk celledød ledsaget af induktion af spaltet caspase-3, -8, -9, Bax, p21 og p53, men formindskelse af XIAP , CIAP og Bcl2 ekspression. Thiacremonone yderligere hæmmet glutathion peroxidase aktivitet i lunge kræftceller. Imidlertid blev cellevæksten inhibitoriske virkning af thiacremonone ikke observeret i de lungecancerceller transficeret med mutant PRDX6 (C47S) og i nærvær af dithiothreitol og glutathion. I en allograft in vivo-model, thiacremonone (30 mg /kg) også inhiberede tumorvækst ledsaget med reduktionen af ​​PRDX6 ekspression og glutathionperoxidase aktivitet, men forøget ekspression af spaltet caspase-3, -8, -9, Bax, p21 og p53 . Disse data indikerer, at thiacremonone hæmmer tumorvækst via hæmning af glutathion-peroxidase aktivitet af PRDX6 gennem interaktion. Disse data antyder, at thiacremonone kan have potentielt fordelagtige virkninger i lungekræft

Henvisning:. Jo M, Yun H-M, Park K-R, Park MH, Lee DH, Cho SH, et al. (2014) Anti-Cancer Effekt af Thiacremonone gennem nedregulering af Peroxiredoxin 6. PLoS ONE 9 (3): e91508. doi: 10,1371 /journal.pone.0091508

Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, USA

Modtaget: 16. december 2013; Accepteret: 13 februar 2014; Udgivet: marts 11, 2014

Copyright: © 2014 Jo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Grundforskningsfonden Korea (NRF) finansieret af den koreanske regering (MSIP) (nr MRC, 2008 til 0.062.275). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Peroxiredoxins (PRDXs) er en familie af peroxidaser som antioxidant enzymer [1] – [2]. Den PRDX familien omfatter seks medlemmer. De er opdelt i to klasser [3]. Det 2-Cys gruppe omfatter PRDX1-5, hvorimod PRDX6 er kun et medlem af 1-Cys-gruppe. PRDXs er en familie af peroxidaser, der ødelægger peroxider under anvendelse konserverede cysteinrester i det katalytiske center [4]. Blandt de seks pattedyr medlemmer af denne familie, PRDX6 er det eneste medlem, der har glutathionperoxidase og calcium-uafhængig phospholipase A2 (iPLA2) aktiviteter [5]. Mens andre PRDXs udnytte thioredoxin som en fysiologisk reduktionsmiddel, PRDX6 udnytter glutathion [6]. PRDX6 beskytter celler fra membranen, DNA, protein skader, og lipidperoxidation [7]. Antioxidanten responselement (ARE) i prdx6 promotorregionen, en

cis

virkende regulator element, aktiveres ved oxidativ stress [8]. Transkription af PRDX6 genet reguleres af nuklear faktor erythroide 2-relaterede faktorer 1, 2, og 3 (Nrf1, Nrf2, og Nrf3) som transkriptionsfaktorer via binding til ARE [9]. Blandt Nrfs, Nrf2 positivt regulerer transskription af PRDX6 genet [10].

Da PRDXs er antioxidanter, de støtter overlevelse og tumor vedligeholdelse ved at beskytte celler fra oxidativ stress-induceret apoptose [11]. I en nylig undersøgelse, overekspression af PRDX 6 dæmper cisplatin-induceret apoptose i humane ovariecancerceller [12]. I modsætning hertil reduktion af PRDX6 ekspression øget peroxid-induceret celledød i lever cancerceller [13]. Invasion og metastase fremme handlinger PRDX6 er blevet fundet i lungecancerceller gennem aktivering af Akt via aktivering af phosphoinositiede 3-kinase (PI3K) og p38-kinase [4], [14]. Aktiviteten af ​​PRDX6 bidrager til metastatisk evne lungekræft celler ved at stimulere invasion komponenter herunder PI3K, Akt, og uPA [4]. Det blev også rapporteret, at PRDX6 ekspression i lungecancerceller var signifikant associeret med tumorudvikling [15].

hvidløg har været anvendt i traditionel medicin som en fødevarebestanddel at forhindre udviklingen af ​​cancer [16]. Thiacremonone (2,4-dihydroxy-2,5-dimethyl-thiophen-3-on) er en antioxidant stof, som en ny svovlforbindelse, genereret fra High-Temperature-High-Pressure (HTHP) -behandlet hvidløg [17]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi anticancervirkning af thiacremonone gennem hæmning af glutathion-peroxidase aktivitet via interaktion i lungecancerceller.

Materialer og metoder Salg

Ekstraktion og karakterisering af thiacremonone

strukturen af ​​en svovlforbindelse isoleret fra hvidløg (opkaldt thiacremonone) er vist i resultaterne (fig. 1A). Hvidløg (Allium sativum L) blev opvarmet til temperaturer på 130 ° C i 2 timer. De opvarmede prøver blev Juiced og derefter filtreret på en Buchner-tragt under et vakuum. Opvarmet hvidløg saft blev delt konsekutivt i en skilletragt ved hjælp af ethylacetat. Isolering af forbindelserne fra ethylacetatlaget af opvarmet hvidløg saft blev underkastet søjlekromatografi på silicagel. Denne fraktion indeholdende thiacremonone blev oprenset ved præparativ RP-HPLC på en Younglin SP930D Instrument [17]. Thiacremonone blev løst i 0,01% dimethylsulfoxid, og behandles ved koncentrationer på 10, 20 og 50 ug /ml i dyrkede celler.

(A) Struktur af thiacremonone, en sulfurcompound isoleret fra hvidløg. (B) Rekombinant protein ifølge PRDX6 blev inkuberet med thiacremonone-konjugeret Sepharose 4B. (C) Hele cellelysater af NCI-H460 blev inkuberet med thiacremonone-konjugeret Sepharose 4B. Efter fældning var niveauerne af bundet PRDX6 overvåget ved Western blot analyse. (D) Efter fældning med thiacremonone-konjugeret Sepharose 4B var niveauerne af bundet PRDX6 eller mutante PRDX6 C47S overvåget ved Western blot analyse. (E) Ribbon repræsentation docking model af thiacremonone med PRDX6 (F) Molekylær overflade repræsentation docking model af thiacremonone med PRDX6.

Cell Culture

A549 og NCI-H460 lungecancer celle linjer blev fremskaffet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). CCD-18Co kolon normal cellelinje og LL24 lunge normal cellelinje blev købt fra den koreanske cellelinje bank (Seoul, Korea). NCI-H460 og LL24 normale celler blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (100 U /ml). A549 og CCD-18Co normale celler blev dyrket i et DMEM-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (100 U /ml). Cellekulturer blev derefter holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2.

Cell Levedygtighed Assay

For at bestemme celle numre, A549 og NCI-H460 lungecancerceller eller CCD- 18Co colon normal cellelinje og LL24 lunge normal cellelinje blev udpladet i 24-brønds plader (5 × 10

4 celler /brønd). Subkonfluente celler blev efterfølgende behandlet med thiacremonone (10, 20, og 50 ug /ml) i 72 timer. Efter behandling blev cellerne trypsiniseret og pelleteret ved centrifugering i 5 minutter ved 1.500 rpm, genopslæmmet i 5 ml phosphatpufret saltvand (PBS), og 0,1 ml 0,2% trypanblåt blev tilsat til cancercellen suspension i hver af opløsningerne (0,9 ml hver). Efterfølgende blev en dråbe suspension anbragtes i en Neubauer kammer og de levende cancerceller blev talt. Celler, der viste tegn på farvning blev anset for at være døde, mens de, der udelukkede trypanblå blev anset levedygtig. Hvert assay blev udført in triplo.

Transfektion

Lunge cancerceller (5 x 10

4 celler per brønd) blev udpladet i plader med 24 brønde og transient transficeret med PRDX6 siRNA ( Santa Cruz Biotechnology) eller pcDNA-PRDX6, (generøse gaver fra DR. Jhang Ho Pak, University of Ulsan College of Medicine med en blanding af Prdx6 siRNA eller pcDNA-Prdx6 og WelFect-EX PLUS reagens i Opti-MEN, i henhold til fabrikantens specifikationer (WelGENE, Seoul, Korea).

luciferaseaktivitet Assay

A549 og NCI-H460 humane lungecancerceller blev transficeret med prdx6 promotor-Luc plasmid under anvendelse af en blanding af plasmidet og WelFect EX PLUS reagens i Opti-MEN, ifølge producentens specifikationer (WelGENE, Seoul, Korea). efter 6 timer blev cellerne behandlet med thiacremonone. luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse af luciferase-assay kit (Promega, Wisconsin, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner (WinGlow, Bad Wildbad, Tyskland)

Western blot-analyse

membranen blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med specifikke antistoffer:. kanin polyklonale for PRDX6 og cIAP2 (1 :1,000 fortynding, Abcam, plc. Cambridge UK), XIAP, Bcl2, caspase-3, caspase-9 (1:1,000 fortynding, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), Bax (1:500 fortynding, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) og mus monoklonalt for p53, og caspase-8 (1:1,000 fortynding, Cell Signaling Technology, Inc.), p21 (1:500 fortynding, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Blottet blev derefter inkuberet med det tilsvarende konjugeret anti-kanin og anti-muse-immunoglobulin G-peberrodsperoxidase (1:2,000 fortynding, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Immunreaktive proteiner blev påvist med ECL Western blotting påvisning systemet.

glutathionperoxidaseaktivitet Assay

GPX co-substrat-blanding, herunder nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH), glutathion, og glutathion reduktase, blev anvendt at måle glutathionperoxidaseaktivitet in vitro. En GPX Assay Kit blev indkøbt fra Cayman Chemical (Michigan, USA) og procedurer blev udført ifølge producentens anvisninger. Efter behandling af cellerne blev de homogeniseret og udsat for assayet, og absorbansen værdi blev målt ved 340 nm og normaliseret til proteinkoncentrationen.

Molecular Modeling

krystalstruktur PRDX6 (PDB kode 1prx) blev anvendt til docking studier. Den thiacremonone blev bygget ved hjælp af en Maestro build panel. Forbindelsen blev minimeret ved hjælp af Impact modul af Maestro i Schrödinger Suite Program. Udgangspunktet koordinat for PRDX6 blev yderligere modificeret til bindende model forudsigelse. Proteinet struktur blev minimeret ved anvendelse af Protein Preparation Wizard ved at anvende en OPLS kraftfelt. For gitteret generation blev bindingsstedet defineret som det geometriske tyngdepunkt af Cys 47 i det katalytiske sted i PRDX6. Ligand docking ind det katalytiske sted i PRDX6 blev udført under anvendelse af Schrödinger docking program, Glide. Den minimerede kropsbygning af thiacremonone var forankret i den forberedte receptor nettet. De bedst forankret poses blev udvalgt som den første kovalent model af Cys 47 i det katalytiske sted i PRDX6 med thiacremonone. De kovalente komplekser blev yderligere minimeret ved anvendelse af stejleste nedstigning algoritme. Molekylære grafik til den kovalente binding model af thiacremonone blev genereret ved hjælp af en PyMOL pakke (https://www.pymol.org).

Træk ned Assay

Thiacremonone blev konjugeret med cyanogenbromid ( CNBr) -aktiverede Sepharose 4B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kort fortalt blev thiacremonone (1 mg) opløst i 1 ml koblingsbuffer (0,1 M NaHCO3 og 0,5 M NaCl, pH 6,0). Den CNBr-aktiveret Sepharose 4B blev kvældet og vasket i 1 mM HCI gennem en sintret glasfilter, vaskes derefter med koblingen puffer. CNBr-aktiveret Sepharose 4B-perler blev tilsat til thiacremonone-holdige koblingspuffer og inkuberet ved 4 ° C i 24 timer. Den thiacremonone-konjugeret Sepharose 4B blev vasket med tre cyklusser af alternerende pH vaskebuffere (puffer 1, 0,1 M acetat og 0,5 M NaCl, pH 4,0; puffer 2, 0,1 M Tris-HCI og 0,5 M NaCl, pH 8,0). Thiacremonone-konjugerede perler blev derefter bragt i ligevægt med en bindende buffer (0,05 M Tris-HCI og 0,15 M NaCl, pH 7,5). Kontrolsekvenserne ukonjugerede CNBr-aktiveret Sepharose 4B-perler blev fremstillet som beskrevet ovenfor i fravær af thiacremonone. Cellelysatet eller PRDX6 rekombinant protein (Abnova, Taipei, Taiwan) blev blandet med thiacremonone-konjugeret Sepharose 4B eller Sepharose 4B ved 4 ° C i 24 timer. Perlerne blev derefter vasket tre gange med TBST. De bundne proteiner blev elueret med SDS loading buffer. Proteinerne blev derefter løst ved SDS-PAGE efterfulgt af immunblotting med antistoffer mod PRDX6 (1:1,000 fortynding Abcam, plc. Cambridge, UK).

Etik Statement

Alle forsøg blev godkendt og udføres i henhold til vejledningen for den pasning og anvendelse af dyr [Animal Care udvalg Chungbuk National University, Korea (CBNUA-436-12-02)].

dyreforsøg

12- uger gamle C57BL /6J-Tg (Prdx6) mus blev fremskaffet fra Jackson Lab (Maine, USA) og 12 uger gamle C57BL /6-mus blev indkøbt fra Koatech (Pyeongtaek, Korea). Musene blev inddelt i fire grupper. Lewis lungecarcinom (LLC) -celler blev injiceret s.c. (1,2 × 10

6 tumorceller /0,1 ml PBS /dyr) med en 27 gauge nål. Efter 10 dage, to grupper af mus (n = 10) var i.p. injiceret med thiacremonone (30 mg /kg i PBS og 0,01% DMSO) to gange om ugen i 3 uger. Kontrolgruppen af ​​mus (n = 20) blev behandlet med vehikel [PBS og 0,01% DMSO (i.p.)]) to gange om ugen i 3 uger. For subkutane tumorer den maksimalt tilladte størrelse er 20 mm i diameter for en mus, så vi ofrede alle mus, før de når maksimal størrelse Cervikal dislokation blev udført for eutanasi.

Immunhistokemi

Alle vævsprøver blev fastsat i formalin og paraffin-lukkede til undersøgelse. §§ 4 um tykke blev farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

Binding mellem thiacremonone og PRDX6

Samspillet blev vurderet i en pull-down assay under anvendelse thiacremonone-. Sepharose 4B-perler, og efter PRDX6 blev påvist ved immunoblotting med anti-PRDX6. Resultaterne indikerede, at thiacremonone bundet med rekombinant PRDX6 protein- eller cellelysater indeholdende PRDX6 protein fra humane NCI-H460 lungecancerceller. (Fig. 1B og C). Til identitet bindingssted thiacremonone til PRDX6, vi udførte en beregningsmæssige docking model af thiacremonone med PRDX6 under Schrödinger docking-programmet, Glide. Resultaterne fra docking studier antydet, at thiacremonone kovalent kan binde med Cys 47 rest i PRDX6 katalytiske site. Båndet repræsentation docking model af thiacremonone med PRDX6 angivet, at følgende interaktioner er mulige i det katalytiske site; sidekæden af ​​Thr 44, Met 127 og Val 46 i PRDX6 (fig. 1E). Vi har også fundet nedsat binding af thiacremonone med mutant PRDX6 C47S forhold til PRDX6 (fig. 1D). Som vist i fig. 1F, molekylær overflade repræsentation af en docking model, hvor den bindende lomme til thiacremonone dannes i PRDX6.

Effekt af Thiacremonone på PRDX6-Luciferase aktivitet og ekspression og aktivitet af PRDX6

For at teste, om interaktion mellem thiacremonone og pRDX6 kunne dæmpe prdx6-medieret promotoraktivitet og ekspression, blev cellerne behandlet med thiacremonone (10, 20, og 50 ug /ml) i 6 timer i A549 og NCI-H460 humane lungecancer-celler transficeret med en prdx6-afhængig luciferase reporter konstrukt. Luciferaseaktiviteten af ​​cancerceller transficeret med prdx6 promotor-Luc plasmid var over 5 * 10

4 RLU /mg proteiner, og behandlingen med thiacremonone forårsagede undertrykkelse af luciferaseaktivitet i cancerceller (fig. 2A). I overensstemmelse med den inhiberende virkning på luciferaseaktivitet blev ekspressionen af ​​PRDX6 faldt også med thiacremonone i cancerceller (fig. 2B). Vi bekræftede yderligere den relative glutathionperoxidase aktivitet ved thiacremonone. Thiacremonone inhiberede glutathionperoxidase aktivitet af begge lungecancerceller, 72 timer efter behandling med thiacremonone som vist i fig. 2C. Disse resultater antyder, at bindingen af ​​thiacremonone til PRDX6 fører til inhibering af PRDX6 ekspression og aktivitet.

(A) lungecancerceller blev transficeret med prdx6-luciferase plasmid, og derefter behandlet med thiacremonone i 6 timer. Luciferaseaktivitet blev derefter bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) lungecancerceller blev behandlet med thiacremonone i 72 timer. Celleekstrakter blev analyseret ved western blotting. Hvert billede og bånd repræsenterer tre uafhængige forsøg. (C) Niveauerne af glutathionperoxidaseaktivitet i lungekræft celler blev målt under anvendelse af assay-kits, som beskrevet i Materialer og metoder. (D) Cellerne blev høstet ved trypsinisering og farvet med 0,2% trypanblåt. Værdier (A, C og D) er gennemsnit ± standardafvigelse. * P 0,05 sammenlignet med signifikant forskellig fra ubehandlede kontrol celler

Effekt af Thiacremonone på cellevækst i en Variety af kræftceller herunder lungekræft Celler

Da PRDX6 er impliceret i lungerne. cancercellevækst, undersøgte vi, om interaktion af thiacremonone og PRDX6 kunne inhibere PRDX6 aktivitet, derved inhibere cancercellevækst. For at vurdere den inhiberende virkning af thiacremonone på cellevækst af lungecancerceller, A549 og NCI-H460, analyserede vi cellelevedygtighed ved direkte celletælling. Cellerne blev behandlet med adskillige koncentrationer af thiacremonone (10, 20, 50 ug /ml) i 72 timer. Som vist i figur 2D, thiacremonone inhiberede celleproliferation af lungecancerceller i en koncentrationsafhængig måde. Tooghalvfjerds time behandling af thiacremonone inhiberede A549 cellevækst med IC

50 værdi på 46 ug /ml, og NCI-H460 vækst celler med IC

50 værdier på 42 ug /ml. Morfologisk observation viste, at cellerne gradvist blev reduceret i størrelse og ændret til en lille rund enkelt celle form med behandlingen af ​​thiacremonone i A549-celler og NCI-H460-celler. Vi bekræftede normal cellevækstinhiberingen hjælp CCD-18 tyktarm og LL24 lunge normale celler. Imidlertid viste ingen cytotoksiske virkning i normale celler (fig S1)., Thiacremonone

Virkning af Thiacremonone på apoptotisk celledød og ekspressionen af ​​apoptotiske regulerende proteiner Salg

Apoptose er processen med programmeret celledød som har en vigtig rolle i anti-cancer effekter af kemoterapeutika [18]. For at bestemme, at inhiberingen af ​​cellevækst med thiacremonone skyldtes induktionen af ​​apoptotisk celledød, evaluerede vi ændringerne i chromatin morfologi af celler ved hjælp af DAPI-farvning efterfulgt af TUNEL farvende assays. De dobbelte mærkede celler blev derefter analyseret ved fluorescens mikroskop. Omvendt med cellevækstinhibering blev DAPI-farvet TUNEL-positive celler signifikant forøget i thiacremonone behandlede celler. Behandlingen af ​​thiacremonone resulterede i ca. 45% og 65% induktion af apoptotisk celledød i A549 og NCI-H460 cancerceller, (fig. 3A). Aktiveringen af ​​celledød regulerende proteiner herunder caspase-9 og-3, samt Bax, fører til apoptose i cancerceller [19]. For at finde ud af ekspressionen af ​​celledød regulatoriske proteiner ved thiacremonone blev ekspressionen af ​​apoptotisk celledød beslægtede proteiner undersøgt ved Western blotting. Ekspressionen af ​​pro-apoptotiske proteiner, Bax og spaltes form af caspase-3, -8, -9, og p21 og p53 blev forhøjet med en behandling af thiacremonone. Imidlertid blev udtryk for Bcl2, XIAP, og cIAP2 faldt med en behandling af thiacremonone (fig. 3B).

(A) lungekræft celler blev behandlet i fravær (

til venstre paneler

) og tilstedeværelse af thiacremonone (50 mg /ml,

højre pannels

) i 72 timer, og derefter mærket med DAPI og TUNEL løsning. Totale antal celler i et givet område blev bestemt ved anvendelse DAPI nuklear farvning (fluorescerende mikroskop). Den grønne farve i de fikserede celler markerer TUNEL-mærkede celler. For kvantificering blev tre tilfældigt udvalgte områder vurderet. Den apoptotiske indeks (%) blev bestemt som (TUNEL-positive celle nummer /total DAPI farvede celle nummer) x 100 (forstørrelse, 200 ×). Værdier er gennemsnit ± standardafvigelse. * P 0,05 sammenlignet med signifikant forskellig fra ubehandlede kontrolceller. (B) lungekræft celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af thiacremonone (10, 20, og 50 ug /ml) i 72 timer. Ekspression af apoptose regulatoriske proteiner blev bestemt under anvendelse af Western blot-analyse. Hvert billede og bånd er repræsentativt for tre uafhængige forsøg.

Bagsiden af ​​hæmmende virkning af Thiacremonone om kræft cellevækst ved transfektion af mutant PRDX6 (C47S)

For at undersøge om cellevækst var hæmmet af samspillet mellem thiacremonone og pRDX6 blev lunge kræftceller transficeret med C47S-prdx6. Den inhiberende virkning af thiacremonone på cancercellevækst vendes ved mutant PRDX6 (C47S), og ekspression og aktivitet af PRDX6 også vendes (fig. 4). Disse resultater antyder, at interaktionen af ​​PRDX6 med thiacremonone kunne have betydning for lungekræft cellevækst, og thiacremonone undertrykker lungecancer cellevækst (fig. 4A) via suppression af PRDX6 ekspression (fig. 4B) og glutathionperoxidase aktivitet (fig. 4C) . Endvidere DTT og GSH undertrykt de inhiberende virkninger af thiacremonone på cellevækst, PRDX6 ekspression og glutathionperoxidase aktivitet (fig. 5). Disse data viste, at thiacremonone hæmmede cellevækst via hæmning af glutathion peroxidase aktivitet og udtryk for PRDX6.

(A) Lungekræft celler blev transficeret med pcDNA-prdx6 eller pcDNA-prdx6 C47S, og derefter, thiacremonone blev behandlet ( 50 ug /ml) i yderligere 72 timer. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og farvet med 0,2% trypanblåt. (B) Celleekstrakter blev analyseret ved western blotting. Hvert billede og bånd repræsenterer tre uafhængige forsøg. (C) Niveauerne af glutathionperoxidaseaktivitet i lungekræft celler blev målt under anvendelse af assay-kits, som beskrevet i Materialer og metoder. Værdier er gennemsnit ± standardafvigelse. #, S 0,05 signifikant forskellig fra ubehandlede kontrolceller. *, P 0,05, signifikant forskellig fra ubehandlede kontrolceller transficeret med pcDNA-prdx6 C47S.

, p. 0,05, signifikant forskellig mellem pcDNA-prdx6 og pcDNA-prdx6 C47S behandlet med thiacremonone

(A) Lungekræft celler blev co-behandlet med angivne koncentrationer af DTT ( 10 og 100 nM) eller GSH (100 og 200 uM) med thiacremonone (50 ug /ml) i 72 timer. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og farvet med 0,2% trypanblåt. (B) Celleekstrakter blev analyseret ved western blotting. Hvert billede og bånd repræsenterer tre uafhængige forsøg. (C) Niveauerne af glutathionperoxidaseaktivitet i lungekræft celler blev målt under anvendelse af assay-kits, som beskrevet i Materialer og metoder. Værdier (A og C) er gennemsnit ± standardafvigelse. #, P 0,05 sammenlignet med signifikant forskellig fra ubehandlede celler med thiacremonone. *, P 0,05, signifikant forskellig fra ubehandlede celler med DTT eller GSH ..

, p. 0,05, signifikant forskellig mellem behandlet celle med thiacremonone og co-behandlede celler med DTT eller GSH og thiacremonone

Thiacremonone Hæmmet tumorvækst i vivo allograft

for at belyse den anti-tumor effekt af thiacremonone in vivo, at tumorvækst i allotransplantat bærende mus efter thiacremonone behandlinger blev undersøgt. I LLC allotransplantat studier blev thiacremonone administreret intraperitonealt to gange om ugen i 3 uger til mus. Tumorvolumen blev målt ugentligt, og alle mus blev dræbt i slutningen af ​​eksperimentet, når tumorerne blev dissekeret og vejet. Den inhiberende virkning af thiacremonone på væksten af ​​lungetumor var signifikant i begge allotransplantat modeller med C57BL /6J-mus samt PRDX6 overudtrykt mus. Den relative tumorvækst blev målt efter behandling af thiacremonone (30 mg /kg, n = 10). Tumorvækst i C57BL /6J (tumor volumen; 8000,4 ± 2000,7 mm

3, tumor vejer 4.7 ± 0,82 g) mus blev signifikant reduceret med thiacremonone (tumor volumen 4543.6 ± 731.1 mm

3, tumor vægt; 3,45 ± 0,31 g, fig. 6A). Denne hæmmende effekt blev fundet i PRDX6 overudtrykt mus (tumor volumen 10060,5 ± 1039,6 mm

3 (Tg-kontrol) versus 5048.9 ± 737,9 mm

3 (Tg-thiacremonone), tumor vægt 4,9 ± 0,21 g (Tg -styring) versus 3,44 ± 0,78 g (Tg-thiacremonone), fig. 6B). Den immunhistokemi-analyse af tumor sektion af H 0,05 signifikant forskellig fra ubehandlede mus. (C) Tumor sektioner af normale mus blev analyseret ved H 3,6 mg /ml [26], og med en IC

50 på 7,3 ug /ml ved DADS [34]. IC

50 af S-allylcysteine ​​(SAC) til humane metastatiske celler var ca. 5,3 mg /ml på dag 3 [28]. Efter behandling i 24 timer, cellevæksten af ​​prostatacancerceller med 9 ug /ml sulforaphane (SFN) var 10,2 ± 3,1% sammenlignet med det i kontrolceller (100%) [29]. Selvom koncentrationer af forbindelser førende cancercellevækst inhibering er forskellige, det afhænger af celletypen og forbindelser behandles, afledte forbindelser fra hvidløg herunder thiacremonone har en anti-cancer virkning. Men eksakte action mekanismer er stadig uklart.

Som PRDX6 skyllepumpetab peroxid, såsom små H

2O

2, det understøtter overlevelsen af ​​kræftceller og tumor vedligeholdelse [30]. Mange undersøgelser har vist, at PRDX6 fremmer invasion og metastase af en række forskellige cancerceller, herunder lunge-, bryst-, og ovariecancerceller [4], [12], [31]. PRDX6 udtrykkes i alle vigtige organer, med et særligt højt i lungerne [32]. Endvidere PRDX6 blev fundet ved højere niveauer i lunge pladecellecarcinom patienter [33]. Overekspression af PRDX6 øget lungekræft cellevækst via aktiviteten af ​​PRDX6 [4]. Således målrettet PRDX6 af visse forbindelser kan være effektive til lunge tumor væksthæmning som kemoterapeutika. PRDX6 har dobbelt enzymaktiviteter såsom glutathionperoxidase og iPLA2 [32]. Glutathionperoxidase fremmer vækst cancercelle via hæmning af apoptose og en højere sandsynlighed eller af tilbagefald herunder lunge metastase og lokale recidiver [34]. Glutathionperoxidase inhiberer cisplatin-induceret apoptose via nedregulering af Bcl2 i NCI-H460 humane lungecancerceller [35].