PLoS ONE: LIM og SH3 Domæne Protein 1 (LASP-1) Overekspression var forbundet med Aggressiv fænotype og dårlig prognose i Clear celle renalcellecarcinom

Abstrakt

Baggrund

LIM og SH3 protein 1 (LASP-1) er et specifikt omdrejningspunkt vedhæftning protein, der er kendt for at være involveret i en lang række biologiske og patologiske processer. LASP-1 overekspression er blevet beskrevet i flere typer af kræft, men dens udtryk og rolle i klar celle renalcellecancer (ccRCC) fortsat ukendt.

Metoder

Brug immunhistokemi, vi analyserede LASP- 1 proteinekspression i 216 clinicopathologically karakteriseret ccRCC tilfælde. Vi undersøgte også LASP-1-ekspression i 20 parrede ccRCC væv og i 2 cellelinier ved real-time PCR og Western blot. Brug af RNA-interferens, undersøgte vi virkningerne af LASP-1 depletering på tumorcelle adfærd

in vitro

. Statistiske analyser blev anvendt til at bestemme foreninger mellem LASP-1-niveauer, tumor funktioner og patientresultater.

Resultater

LASP-1 overekspression blev observeret i ccRCC væv (

P

0,0001) sammenlignet med adjuverende nontumorous væv, og dens udtryk niveauer blev tæt korreleret med total overlevelse og gentagelse overlevelse (

P

= 0,044 og 0,006 henholdsvis) hos patienter med ccRCC. RNA-interferens-medieret lyddæmpning af LASP-1-genet i 786-0 ccRCC celler signifikant hæmmede celle migration.

Konklusioner

Resultaterne af den foreliggende undersøgelse viser, at LASP-1 kan tjene som en prognostisk biomarkør for ccRCC patienter og kan være et lovende mål for behandling af ccRCC

Henvisning:. Yang F, Zhou X, Du S, Zhao Y, Ren W, Deng Q, et al. (2014) LIM og SH3 Domæne Protein 1 (LASP-1) Overekspression var forbundet med Aggressiv fænotype og dårlig prognose i Clear celle renalcellecarcinom. PLoS ONE 9 (6): e100557. doi: 10,1371 /journal.pone.0100557

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Marts 21, 2014 Accepteret: 23. maj 2014 Udgivet: 23 Jun 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle cel filer er tilgængelige fra GEO

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ryd celle renalcellecarcinom (ccRCC) er en almindelig urologisk malignitet verdensplan [1]. Selv enorme forbedringer er sket i behandlingen af ​​ccRCC i de seneste år, fortsat høj dødeligheden af ​​ccRCC, fordi 40% af ccRCC patienter, der gennemgår nefrektomi vil udvikle lokalt recidiv eller metastaser [2]. Derfor er pålidelige prognostiske biomarkører presserende behov for at forudsige udfaldet og identificere terapeutiske mål til behandling af ccRCC patienter.

LIM og SH3 protein 1 (LASP-1) er blevet påvist at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft og progression [3], [4]. LASP-1 blev indledningsvis identificeret fra et cDNA bibliotek af brystcancer-metastaser, og genet blev kortlagt til humant kromosom 17q21 [5], [6]. Den humane LASP-1 protein indeholder 261 aminosyrer med en N-terminal LIM domæne, efterfulgt af to actin-bindende domæner i kernen af ​​LASP-1-protein, som medierer interaktionen mellem LASP-1 og aktincytoskelettet på stedet for cellemembran udvidelser, men ikke langs actin stress fibre [7] – [10]. SH3-domænet ved C-terminalen er involveret i protein-protein-interaktioner ved binding til prolin-rige sekvenser, der specifikt zyxin, pallidin, lipoma-foretrukne partner (LPP) og vasodilator-stimuleret phosphoprotein (VASP) [6], [11] . LASP-1 er lokaliseret til flere steder af dynamisk actin samling, såsom fokale kontakter, fokale sammenvoksninger, lamellipodia membran flæser og pseudopodia [12], [13], men de nøjagtige funktioner i LASP-1 er stadig ikke godt forstået.

LASP-1 er blevet rapporteret at være overudtrykt i flere typer af cancere og metastatiske cancercellelinjer, såsom brystcancer [14], ovariecancer [4] og kolorektal cancer [15]. Desuden LASP-1 lyddæmpning i metastatiske cancer cellelinjer resulterede i en kraftig hæmning af celleproliferation og migration, og førte til reduktioner zyxin ved de fokale kontakter [4]. Interessant,

in vitro

lyddæmpning af LASP-1-genet reduceret celleproliferation og migration og i høj grad påvirket zyxin lokalisering [3]. Desuden gentransfektion-medieret LASP-1 overekspression i SW480 CRC-celler resulterede i aggressive cancerceller og fremmes cancervækst og metastase [15]. Imidlertid roller LASP-1 i ccRCC ikke er blevet beskrevet,.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​LASP-1 i ccRCC anvendelse af human ccRCC vævsprøver og cellelinjer, og vurderede associering mellem LASP-1-ekspression og ccRCC resultat efter resektion. Desuden har vi udført RNA-interferens (RNAi) medieret gen silencing af LASP-1 i ccRCC celler for at undersøge den rolle, LASP-1 i ccRCC invasion

in vitro

.

Materialer og metoder

patienter og vævsprøver

To hundrede og seksten renal tumor prøver og deres tilstødende nontumorous væv blev opnået fra patienter med ccRCC som gennemgik radikal eller partiel nefrektomi ved Institut for Urology Surgery, Xijing Hospital, fjerde Military Medical University fra august 2005 til september 2010. diagnosen blev bekræftet af den postoperative patologiske analyser. Patienter med en historie af malignitet og dem, der tidligere havde fået neoadjuverende terapi blev udelukket fra denne undersøgelse. Ingen patienter havde påviselige fjernmetastase ved kirurgi. Undersøgelsen bestod af 82 kvinder og 134 mænd (gennemsnitsalder, 63 år, aldersgruppe, 18-82 år). I den foreliggende undersøgelse, blev de kliniske og patologiske træk noteres. Brug af 2010 TNM og klassificering Fuhrman klasse blev tumorerne klassificeret i følgende grupper for de statistiske analyser: tidlig fase (TNM1 og TNM2), sent tidspunkt (TNM3 og TNM4), lav kvalitet (grad 1 og 2) og høj kvalitet (grad 3 og 4). De klinisk-patologiske karakteristika patienter blev hentet fra de medicinske journaler opsummeret i tabel 1. Opfølgende data blev opnået ved telefon, brev eller ambulant klinisk database. Alle patienter blev fulgt fra tidspunktet for den første operation indtil enten død eller fristen for denne undersøgelse (November 30, 2013). blev påvist Gentagelse i 127 patienter (58,7%) på den sidste opfølgende undersøgelse, og 46 patienter (31,0%) var døde som følge af ccRCC sygdomme. Den gennemsnitlige follow-up tid var 49,3 måneder (interval, 1-67 måneder).

For real-time PCR og Western blot-analyser, i alt 20 parrede tumorvæv og matchede tilstødende nontumorous væv blev indsamlet fra ccRCC patienter, der gennemgår kirurgi behandling ved Institut of Urology Surgery, Xijing Hospital, fjerde Military Medical University mellem marts og juni, 2013. De 20 patienter omfattede 12 mænd og 8 kvinder, med en gennemsnitsalder på 61 år (range, 21-79 år). Efter resektion blev de friske væv umiddelbart nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Både tumor og nontumourous væv blev verificeret ved histopatologisk undersøgelse.

Undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af den etiske komité i fjerde Military Medical University, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter før operation. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

Immunhistokemi

De vævsprøver blev fikseret i 10% formalin og rutinemæssigt behandlet for paraffin indlejring. Vævssnit (5-um tyk) blev farvet med hæmatoxylin-eosin og revideret af to patologer at definere de ondartede og tilsvarende notumorous væv. Immunhistokemi (IHC) blev udført på paraffinindlejrede tumor- snit under anvendelse antistof mod LASP-1 (1:200, Abcam, Cambridge, UK) efter antigen-genvinding. En negativ kontrol uden det primære antistof blev fremstillet for alle prøverne. Den gennemsnitlige LASP-1-ekspression sats blev vurderet ved at inspicere mindst 5 mikroskopiske felter på 400 × forstørrelse. LASP-1-ekspression blev anset for at være negativ, når 10% af kræftceller i de mikroskopiske områder viste immunfarvning, og objektglassene blev revideret en anden gang for at reducere læsning fejl

Cellelinjer

.

786-0 menneskelige ccRCC cellelinje blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og dyrket i RPMI 1640-medium, der var blevet suppleret med 10% FBS. Den menneskelige ccRCC cellelinje A498 blev opnået fra Tiancheng Technology Co Ltd (Shanghai, Kina) og dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FBS. Cellerne blev høstet i den logaritmiske vækstfase til anvendelse i eksperimenterne beskrevet nedenfor.

Real-time PCR

Totalt RNA fra tumor og nontoumorous væv af de 20 ccRCC patienter blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Revers transskription blev udført i et 20-ul reaktionssystem med 2 ug af total RNA, der var blevet behandlet med M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) til at syntetisere første streng cDNA ifølge producentens anbefalinger, efterfulgt af cDNA-amplifikation som tidligere beskrevet. Primersekvenserne der blev anvendt til real-time PCR for LASP-1 var: (F) 5′-ATGAACCCCAACTGCGCC-3 ‘og (R) 5′-TCAGATGGCCTCCACGTAGTT-3’

Western Blot

.

Samlet protein blev isoleret fra tumor og nontoumorous væv af seks ccRCC patienter, der bruger Total protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing, Kina). 30 ug protein per bane blev adskilt under anvendelse af 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel og overført til en polyvinylidine difluorid membran. Membranen blev blokeret i 5% skummetmælk i 2 timer og derefter inkuberet med antistof mod LASP-1 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK) eller β-actin (1:5000, Abcam, Cambridge, UK) ved 4 ° C natten over. Efter vask fire gange i Tris-pufret saltvand med Tween-20 blev membranen probet med en peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof (1:2000, Proteintech Gruppen, Chicago, Illinois, USA).

lille interfererende RNA (siRNA) -medieret LASP-1-gen silencing

Ekspression af humant LASP-1 blev slået ned med siRNA-duplexer som den følgende sekvens: 5′-AAGGTGAACTGTCTGGATAAG-3 ‘, 5’-CUUAUCCAGACAGUUCACCdTdT-3 ‘. Negative kontrolprøver siRNA’er (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘og 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) rettet mod ukendte mRNA-sekvenser blev anvendt som kontroller. Alle de siRNA’er blev syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina). En BLAST-søgning af det humane genom bekræftet, at de udvalgte sekvenser var specifikke for målgenerne. Celler i eksponentiel vækstfase blev udpladet i seks-brønds plader ved en densitet på 0,5 x 10

5 celler /ml, dyrket i 24 timer og transficeret med 1 ug siRNA, når de havde nået 30-50% sammenflydning efter producentens anbefalede protokol. Fluorescein (FAM) -mærkede negativ kontrol siRNA blev anvendt til at visualisere transfektionseffektiviteten.

In vitro

migrationsanalyse

Celler i serumfrit medium (1 x 10

5 celler /200 pi) blev tilsat til de bedste kamre i 8 um porestørrelse Transwell kamre (Corning Star, Cambridge, Massachusetts, USA). De nederste kamre blev fremstillet ved anvendelse af 10% FBS som en kemoattraktant. Cellerne fik lov til at migrere gennem de porøse membraner i 20 timer ved 37 ° C. De celler, der var migreret gennem membranen og fastgjort til den nedre overflade af membranen blev behandlet med en fiksering /farveopløsning (0,1% krystalviolet, 1% formalin og 20% ​​ethanol) til visualisering. For kvantificering blev cellerne talt under et mikroskop i fem tilfældigt udvalgte felter under et Nikon ECLIPS 80i mikroskopi ved forstørrelse på 400 ×. Mindst fem kamre fra tre uafhængige forsøg blev analyseret.

Statistisk analyse

IBM SPSS Statistics 19.0 software blev brugt til at udføre alle statistiske analyser. Forskelle blandt kategoriske variabler blev analyseret for statistisk signifikans ved anvendelse af en chi i anden-test, mens de kvantitative variabler blev analyseret ved anvendelse af parrede Wilcoxon test eller uparret

t

-test. Univariate og multivariate Cox proportionel risiko analyser blev anvendt til at vurdere virkningerne af forskellige faktorer på prognose. En Kaplan-Meier-analyse blev anvendt til at vurdere overlevelse og log-rank tests blev anvendt til at sammenligne patientens overlevelse mellem undergrupper. Alle

P

værdier var tosidet, og

P

. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

LASP-1 overekspression i RCC væv detekteret ved hjælp IHC

for at tydeliggøre den underliggende rolle LASP-1 i RCC progression, vi først undersøgte protein udtryk niveau LASP-1 ved hjælp af IHC i 216 tumorvæv og matchede tilstødende nontumorous væv. Vi fandt, at LASP-1-ekspression blev signifikant opreguleret i tumorvæv sammenlignet med de matchede hosliggende nontumorous væv (

P

0,0001; 1A, B og C). Salg

LASP-1 protein-ekspression i paraffinindlejrede ccRCC væv (A) og tilstødende nontumorous væv (B) ved hjælp af immunhistokemi (forstørrelse, 100 ×), hvor positive LASP-1 immunfarvning viste brun farve. Wilcoxon analyse viste, at tumorvæv udviste signifikant højere LASP-1-ekspression end nontumorous væv (C, n = 216). Western blot (D) og real-time PCR (E, n = 20) analyser bekræftede resultaterne i immunhistokemi-analyse. Western blot-analyse viste også forskellen LASP-1 ekspression i humane embrynal nyreceller (HEK-293) og ccRCC cellelinier (F). T betegner tumorvæv, mens P refererer til peritumor (nontumorous) væv i panelet D.

Verifikation af differentieret LASP-1-ekspression ved hjælp af Western blot og real-time PCR-analyser i væv og cellelinjer

for at verificere de opnåede resultater ved IHC, opdaget vi LASP-1-ekspression i 6 ccRCC væv og deres matchede tilstødende nontumorous væv (Figur 1D). Resultaterne afslørede også forøget LASP-1-ekspression i tumorvæv sammenlignet med nontumorous væv. Real-time PCR blev derefter påført i 20 ccRCC væv og parret nontumorous væv, og blev også fundet LASP-1-mRNA-niveauer at være opreguleret i tumorvæv (figur 1E). Desuden har vi bestemt, at LASP-1 blev udtrykt i 2 ccRCC cellelinjer og humane embryonale nyreceller (HEK-293) ved hjælp af western blot analyse. I overensstemmelse med resultaterne opnået i de vævsprøver, højere LASP-1-niveauer blev detekteret i den mere aggressive cellelinie (786-0) end i lav-aggressive cellelinje (A498) eller HEK-293-celler (figur 1F).

Øget LASP-1-ekspression var korreleret med tumor progression og dårlig prognose i ccRCC patienter

Korrelationer mellem LASP-1-ekspression og klinisk-patologiske karakteristika blev analyseret ved hjælp af chi-squared test. Som opsummeret i tabel 1, blev der signifikante korrelationer fundet mellem LASP-1-ekspression og fire kliniske parametre, herunder tumor størrelse (

P

= 0,002), TNM stadie (

P

= 0,005), gentagelse status (

P

= 0,006) og død status (

P

= 0,026). Forholdet mellem Fuhrman kvalitet og LASP-1-ekspression viste borderline signifikans (

P

= 0,081). Men der var ingen statistiske sammenhænge mellem LASP-1-ekspression og de øvrige parametre, såsom alder og køn,.

Vi brugte derefter univariate og multivariate Cox regressionsanalyser at vurdere sammenhængen mellem LASP-1-ekspression og resultat i ccRCC patienter. I univariate analyse (Tabel 2), tumorstørrelse, Fuhrman kvalitet, TNM stadie og LASP-1 opregulering var signifikant korreleret med dårlig samlet overlevelse (

P

= 0,034, 0,0001, 0,0001 og = 0,003 henholdsvis) og tilbagefald overlevelse (

P

= 0,005, 0,0001, 0,0001 og 0,0001, henholdsvis) i ccRCC patienter. Derefter de fire faktorer, der var signifikant forbundet med udfaldet (

P

0,05) i univariate analyse blev udsat for en multivariat analyse. Den multivariate analyse afslørede, at Fuhrman kvalitet, TNM stadie, og LASP-1 opregulering var uafhængige prognostiske faktorer for samlet overlevelse (

P

= 0,001, 0,0001 og 0,044 henholdsvis) og tilbagefald overlevelse (

P

= 0,002, 0,010 og 0,006 henholdsvis) i ccRCC patienter (tabel 3). Desuden Kaplan-Meier-kurve analyse også indikeret, at LASP-1 opregulering var signifikant associeret med dårligere resultat i ccRCC patienter (figur 2A og B). Vejviser

LASP-1 lyddæmpning hæmmede ccRCC celle migration

in vitro

siRNA transfektion blev ansat til at knockdown LASP-1-ekspression i 786-0 celler, som viste høj endogen LASP-1-ekspression. Virkningerne af siRNA transfektion på LASP-1-ekspression blev bekræftet under anvendelse af Western blot analyse. Mængden af ​​LASP-1-protein var naturligvis reduceret sammenlignet med den i de negative kontrolceller (figur 3A). Endvidere transwell invasion assay viste, at silencing LASP-1-ekspression faldt dramatisk celle mobilitet sammenlignet med kontrolceller (figur 3C). En uparret

t

-test blev anvendt til at vurdere forskellen mellem 786-0 og si786-0 celler i antal besatte celler pr felt (fig. 3B), hvilket viste, at antallet af besatte celler pr blev signifikant nedsat efter knockdown af LASP-1-ekspression (

P

0,0001).

Western blotting blev brugt til at verificere knock-down af LASP-1-ekspression i 786-0 celler ved siRNA transfektion (A). En uparret t-test blev anvendt til at vurdere forskelle i antallet af invaderede celler pr mellem 786-0 og si786-0 cellelinjer (B). Transwell resultater for de 786-0 og si786-0 cellelinjer er vist (C).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi LASP-1-ekspression i en serie af 216 ccRCC væv og sammenlignet disse data med dem, der opnås i klinisk etablerede ccRCC for første gang. Resultaterne viste, at proteinet ekspressionsniveauer af LASP-1 var højere i ccRCC væv end i de parrede nontumorous væv, som indikeret ved IHC og valideret med western blot og real-time PCR. Association afslørede at LASP-1-opregulering signifikant var forbundet med større tumorstørrelse og værre TNM fase. Taget sammen viste disse resultater, at LASP-1 kan spille en vigtig rolle i ccRCC progression. Yderligere prognostiske analyser viste, at LASP-1 overekspression kan være en uafhængig prognose faktor i ccRCC. yderligere undersøgelser med store stikprøvestørrelser er imidlertid forpligtet til at bekræfte disse resultater og etablere rolle LASP-1 forudsige prognosen for patienter med ccRCC.

De seneste data har vist, at høj LASP-1-ekspression i kræftsygdomme er afgørende for cancercelleproliferation, progression og metastase [16]. Celler med høj LASP-1-ekspression viste stærkere vitalitet og var mere modtagelige for dannelse af metastatiske læsioner på grund af deres forbedrede evne til at danne kloner [17]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at lukke munden på LASP-1-ekspression i bryst-, æggestokkene og kolorektale cancer cellelinjer fører til reduceret proliferation og migration [4], [14], [15]. I overensstemmelse med resultaterne af disse undersøgelser, resultaterne af den nuværende

in vitro

eksperimenter i ccRCC cellelinier viser, at LASP-1-ekspression er nødvendig for celle migration.

Den mekanisme, der LASP- 1 påvirker kræft celledeling og migrering er fortsat uklart. Cell migration og den kontrollerede montering og demontering af fokale sammenvoksninger er stærkt integrerede flertrinsprocesser og centrale funktioner i den molekylære patologi kræft [18]. Til dato har mere end 50 forskellige vedhæftning proteiner, der regulerer hastigheden og organisering af actin polymerisering og fokal vedhæftning omsætning i fremspring blevet identificeret [19], [20]. LASP-1 er blevet vist at interagere med lipoma foretrukken partner (LPP) og zyxin, som begge kan påvirke endeløse actin dynamik [21]. Binding forekommer mellem den C-terminale SH3 domæne af LASP-1 og N-terminale prolin-rige domæner af zyxin og LPP [4]. Zhao

et al

. har rapporteret, at gen transfektion-medieret LASP-1 overekspression i SW480 CRC celler resulterede i aggressive fænotyper i kræftceller og fremmet kræft vækst og metastase [15]. Denne observation understreger vigtigheden af ​​LASP-1 i cancer.

Nylige undersøgelser har vist, at LASP-1 transkriptionelt opreguleret i respons på morfogenet Sonic Hedgehog [22]. Afbrydelse af hedgehog signalering kaskade fører til en række udviklingsmæssige forstyrrelser og spiller en central rolle i dannelsen af ​​en række humane cancere. I denne sammenhæng er det interessant at bemærke, at zyxin er også blevet identificeret som et forskelligt transskriberet gen i flere typer af kræft ved hjælp af microarray teknologi [15]. Grunewald

et al

. har rapporteret, at LASP-1 overekspression medierer human ovariecancer celle migration og proliferation og påvirkninger zyxin lokalisering [4]. Zyxin er lokaliseret primært mod fokale vedhæftning plaques og spiller en central rolle i polymerisation filament actin i pattedyrceller. Zyxin tavshed i HeLa celler resulterer i væsentligt reduktion i actin stress fiber dannelse, mens under cyklisk strækning, zyxin kun dissocieres fra fokale kontakter og akkumuleres i kernen, uden at påvirke vinculin eller actinfilamenter [6]. Den reducerede cellemotilitet efter LASP-1 lyddæmpning kan forklares ved den funktionelt tab af zyxin som et stillads protein, der letter dannelsen af ​​molekylkomplekser, og derved fremme stedspecifik actin [8]. I den foreliggende undersøgelse, vi bankede ned LASP-1 ekspression i 786-0 cellelinje og observerede dårlig migration evne in vitro, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser.

Konklusioner

sammenfattende vi observeret for første gang, at LASP-1 blev opreguleret i ccRCC, hvilket betyder, at dens vigtige rolle i udviklingen af ​​ccRCC. LASP-1 overekspression var forbundet med større tumorer og aggressive fænotyper i ccRCC og lyddæmpning af LASP-1-ekspression hæmmede migration kræftcelle

in vitro

. Derfor LASP-1 kan være en roman prognostisk biomarkør og en lovende terapeutisk mål for ccRCC.