PLoS ONE: miR-141 og miR-200c som markører af Samlet overlevelse i Early Stage Ikke-småcellet lungekræft Adenocarcinom

Abstrakt

Baggrund

Flere behandlinger i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er histologi-afhængige, og behovet for histologi-relaterede markører er stigende. MikroRNA’er (miRNA) er lovende molekylære markører i flere kræftformer og vise forskelle i udtryk afhængig histologisk undertype. Den miRNA familien miR-200 er blevet forbundet med reguleringen af ​​epitel-mesenkymale (EMT) /mesenchymale-epitelial overgang (MET). EMT indebærer dybtgående fænotypiske ændringer, der omfatter tab af celle-celle-adhæsion, tabet af cellepolaritet, og erhvervelse af vandrende og invasive egenskaber, der letter metastaser. En dobbelt rolle for MIR-200 familie i prognosen af ​​adskillige tumorer er blevet relateret til tumor celle oprindelse. Men den prognostiske rolle og funktion miR-200 familie i den tidlige fase NSCLC adenocarcinom og pladecellekræft (SCC) er ikke blevet veletableret.

Metoder

miRNA-ekspression bestemt ved anvendelse af TaqMan analyser i 155 tumorer fra resektion NSCLC patienter. Funktionelle undersøgelser blev gennemført i tre NSCLC cellelinier:. H23, A-549 og HCC-44

Resultater

High miR-200C-ekspression var forbundet med kortere samlet overlevelse (OS) på hele kohorte (p = 0,024). Høj MIR-200C (p = 0,0004) og MIR-141 (p = 0,009) ekspression korrelerede med kortere OS i adenocarcinom – men ikke i SCC. I den multivariate analyse, en risiko score baseret på miR-141 og miR-200C udtryk opstod som en selvstændig prognostisk faktor for OS i hele kohorten (OR, 2,787; p = 0,033) og adenocarcinom patienter (OR, 10,649; p = 0,002). Funktionelle analyser viste, at miR-200c, var relateret til mesenchymale-epitelial overgang (MET) og påvirkede celle migration og E-cadherin niveauer, mens overekspression af miR-141 reducerede

KLF6

protein niveauer og produceret en stigning på sekretion af

VEGFA in vitro

(H23, p = 0,04; A-549, p = 0,03; HCC-44, p = 0,02) og var forbundet med højere blod mikrokar densitet i patientprøver tumorprøver (p 0,001) .

Konklusion

høj miR-141 og miR-200C udtryk er forbundet med kortere OS i NSCLC patienter med adenocarcinom gennem MET og angiogenese

Henvisning:. Tejero R, Navarro A, Campayo M, Viñolas N, Marrades RM, Cordeiro A, et al. (2014) miR-141 og miR-200c som markører af Samlet overlevelse i Early Stage Ikke-småcellet lungekræft Adenocarcinom. PLoS ONE 9 (7): e101899. doi: 10,1371 /journal.pone.0101899

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Februar 28, 2014 Accepteret: 12 jun 2014; Udgivet: 8 jul 2014

Copyright: © 2014 Tejero et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI0900547), SDCSD af Barcelona Universitet og AECC-Catalunya 2013. Rut Tejero, Anna Cordeiro, Marc Ruiz-Martinez er APIF stipendiemodtagere i Barcelona Universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død, med mere end 226.000 nye tilfælde i USA i 2012 [1]. Firs procent af lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [2], som har en overlevelse samlet kun 10% og 60-70% 5-års i fase I-patienter, hvilket understreger behovet for nye diagnostiske og terapeutiske strategier. Kirurgisk resektion, når det er muligt, er den eneste helbredende behandling for tidlige fase NSCLC. Men næsten 50% af resektion patienter oplever tilbagefald og har en trist prognose [2]. Flere nye behandlinger i NSCLC er histologi-afhængige, og pladecellecarcinom (SCC) reagerer lidt anderledes end adenocarcinom til visse behandlingsregimer [3], [4] [5]. Men kun få histologi-afhængige prognostiske biomarkører er tilgængelige til rutinemæssig anvendelse i klinisk praksis, især i resektable patienter.

I de senere år har microRNA (miRNA) dukket op som lovende molekylære markører i flere kræftformer, herunder NSCLC [6 ]. Specifikke miRNA er blevet beskrevet som histologi-specifik prognostiske markører for SCC (MIR-146b og MIR-155) [7] eller adenocarcinom (MIR-21) [8].

MIR-200 familie består af fem medlemmer beliggende i to forskellige klynger: mIR-200a, mIR-200 mia og mIR-429 omfatter klynge 1 (kromosom 1) og mIR-200C og mIR-141 omfatter cluster 2 (kromosom 12). Alle fem miRNA har været forbundet med reguleringen af ​​epitel-mesenkymale (EMT) /mesenchymale-epitelial overgang (MET) [9]. EMT indebærer dybtgående fænotypiske ændringer, der omfatter tab af celle-celle-adhæsion, tabet af cellepolaritet, og erhvervelse af vandrende og invasive egenskaber [10]. Denne proces er grundlæggende for fosterudviklingen, og er også involveret i tumor invasion og metastase [11]. MIR-200 familien handle gennem deres mål ZEB1 og ZEB2 [9] og TGF-β2 [12]. De miRNA er således i stand til at håndhæve epitel fænotype gennem post-transkriptionel repression af disse gener, således at ekspression af E-cadherin og polaritet faktorer er nødvendige for dannelse af celle-celle vejkryds. MIR-200 familien synes at have en dobbelt rolle i patientens prognose. Overekspression af miR-200 familien fungerer som en markør for bedre resultat i mave- og ovariecancer [13], [14], [15]. I brystkræft [16] og NSCLC [17] I modsætning hertil er høj ekspression af miR-200 familien forbundet med kortere overlevelse. I brystkræft, den miR-200 familien fremmer metastase gennem en ikke-E-cadherin-relaterede mekanisme, målretning

SEC23A

, der formidler sekretion af metastase-undertrykkende proteiner [16]. Men rollen som høje MIR-200 niveauer i NSCLC er endnu ikke blevet belyst.

I det foreliggende arbejde, har vi analyseret rolle medlemmer af miR-200 familie i tumorer fra resektion NSCLC patienter og korreleret vores resultater med samlet overlevelse (OS) efter operationen, både i hele kohorte og ifølge histologiske undertyper. Derudover har vi studeret de funktionelle konsekvenser af de prognostiske markører i NSCLC cellelinjer.

Resultater

Patienter

Tabel 1 viser de vigtigste kliniske karakteristika for alle 155 patienter. Median alder var 65 år (range, 35-85) og 87% var mænd. Enogtyve (13,6%) patienter havde Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status (PS) 0, og 132 (85,2%) havde PS 1. Ninety-fire (60,6%) patienter havde stadium I sygdom. Halvfjerds-tre (47,1%) patienter havde adenokarcinom og 70 (45,1%) SCC. Et hundrede og tredive-otte (89%) patienter var nuværende eller tidligere rygere. Tyve (12,9%) patienter fik adjuverende kemoterapi (16 for fase II eller III sygdom og fire for trin I sygdom med T 4 cm). Median opfølgning var 43 måneder (interval, 2-160). Efter en opfølgning på 160 måneder, havde 70 (45,2%) af patienterne tilbagefald.

miR-200 familie udtryk og kliniske karakteristika

Parret tumor og normal vævsprøver blev opnået fra 155 NSCLC patienter. De fem medlemmer af MIR-200 findes i to klynger: MIR-200a /b, og MIR-429 (klynge 1) og MIR-200C og MIR-141 (klynge 2). Alle medlemmer af MIR-200 familie undtagen MIR-141, blev nedreguleret i tumor i forhold til normalt væv (MIR-200a, p = 0,043; MIR-200b, s 0,001; MIR-429, p = 0,003; MIR-200C , p. 0,001) (Figur S1)

Patienter med PS 1-2 viste højere niveauer af miR-429 (p = 0,039) end dem med PS 0. Aktuelle rygere havde lavere niveauer af miR-200a ( p = 0,027) og miR-429 (p = 0,032) end aldrig-rygere eller tidligere rygere.

miR-141 og miR-200c som markører for OS

Brug af cutoffs defineret af Maxstat pakke af R, vi klassificerede patienter som havende høje eller lave ekspressionsniveauer af de fem miRNA. Blandt de 155 patienter i hele kohorte, dem med høje niveauer af MIR-200C viste en kortere OS (p = 0,024, figur 1A). Blandt de 94 patienter med stadium I-sygdom, høje niveauer af MIR-200C (p = 0,019, figur 1B) og MIR-141 (p = 0,03, figur 1C) var forbundet med kortere OS. Ingen signifikante forskelle i OS blev identificeret ifølge ekspressionsniveauerne af de resterende miRNA

OS ifølge (A) MIR-200C ekspressionsniveauer i hele kohorte (N = 155).; (B) MIR-200C ekspressionsniveauer i trin I patienter (N = 94); og (C) miR-141 ekspressionsniveauer i fase I-patienter (N = 94).

miR-141 og miR-200c i adenocarcinom

Der blev ikke observeret nogen forskel i OS efter til ekspressionsniveauerne af enten mIR-141 eller mIR-200c i patienter med SCC (figur 2A og 2B). Men blandt patienter med adenocarcinom, de miRNA identificeret to godt-opdelte grupper. Mean OS til adenocarcinom patienter med højt miR-200C udtryk var 61,2 måneder (95% CI = 42,9-79,5), mens den var 145,5 måneder (95% CI = 134,4-156,6) for dem med lave niveauer (P 0,001; Figur 2C ). Mean OS til adenocarcinom patienter med højt miR-141-ekspression var 71,7 måneder (95% CI = 44,9-81,6), mens den var 136,9 måneder (95% CI = 110,9-1162,9) for dem med lave niveauer (p = 0,009; figur 2D )

Samlet overlevelse baseret på (A) mIR-200C ekspressionsniveauer i patienter med SCC (N = 70).; (B) MIR-141 ekspressionsniveauer i patienter med SCC (N = 70); (C) MIR-200C ekspressionsniveauer i patienter med adenocarcinom (N = 73); og (D) MIR-141 ekspressionsniveauer i patienter med adenocarcinom (N = 73).

Vi analyserede derefter kombinatoriske virkning af MIR-141 og MIR-200C ved at generere en risiko score baseret på ekspression niveauer af begge miRNA. Patienter med høje niveauer af begge miRNA blev klassificeret som høj risiko, dem med lave niveauer af begge miRNA som lav risiko, og dem med andre kombinationer som mellemliggende risiko. Fem år OS var 49,4% for patienter med høj risiko, 66,7% for patienter mellemliggende risiko, og 100% for patienter med lav risiko (p = 0,002, figur 3).

miR-200C har en større indvirkning på celle migration end miR-141

Cell migration blev målt ved

in vitro

scratch assay efter transfektion med præ-miR-200c, præ-miR-141 eller pre-miRNA negative kontrol. Høje niveauer af MIR-200C reduceret cellemigration i sammenligning med kontrol i H23-cellelinjen (p = 0,005), A-549 (p = 0,0085) og HCC-44 (p = 0,013) (figur 4A). Ingen signifikante forskelle blev observeret for MIR-141, undtagen i A-549 (p = 0,043). Efter transfektion blev E-cadherin-niveauer analyseret ved immunhistokemi (figur 4B) og øgede niveauer blev observeret i celler transficeret med præ-MIR-200c.

(A) efter 36 eller 48 timer af transfektion med præ-miRNA i de NSCLC cellelinier blev cellemigrering målt ved

in vitro

scratch assay. Høje niveauer af MIR-200C reduceret cellemigration i sammenligning med kontrol i alle cellelinier (H23, p = 0,005; A-549, p = 0,0085; HCC-44, p = 0,013), mens høje niveauer af MIR-141 reducerede celle migration kun i A-549 (p = 0,04). (B) E-cadherin-niveauer blev vurderet ved immunohistokemi og øgede niveauer blev observeret i celler transficeret med præ-MIR-200c i forhold til dem transficeret med præ-MIR-141 eller præ-MIR-kontrol i alle tre cellelinier.

miR-141 negativt regulerer KLF6, hvilket fører til øget VEGFA niveauer

in vitro

, og er relateret til højere mikrokar tæthed i patientprøver

Siden miR-141 overekspression havde tidligere været relateret til højere dannelse af blodkar i æggestokkene tumorer i musemodeller [18] undersøgte vi den potentielle virkning af denne mekanisme på den prognostiske rolle miR-141 i NSCLC. Brug Targetscan 6.2, identificerede vi KLF6 som et formodet mål for miR-141, men ikke af miR-200c. Immunoblotting af KLF6 i H23-celler transficeret med præ-MIR-141or pre-MIR-200C viste, at kun MIR-141 reducerede signifikant KLF6 proteinniveauer ved 24 timer (figur 5A). Siden KLF6 regulerer ekspression og sekretion af VEGFA, en kritisk angiogenfaktor [19] undersøgte vi effekten af ​​at øge miR-141 ekspressionsniveauerne på

VEGFA

niveauer. Vi overudtrykt både MIR-141 og MIR-200C i H23, A-549 og HCC-44 NSCLC cellelinier og behandlet af cellerne med DFX at producere hypoxi. Efter 48 timer, vi analyserede proteinniveauer af VEGFA i supernatanten af ​​disse celler. Den overekspression af miR-141 produceret en gennemsnitlig stigning på 28% i frigivelse af VEGFA (H23, p = 0,04; A-549, p = 0,03, HCC-44, p = 0,02), mens der sås ingen signifikante forskelle for miR- 200c, undtagen i HCC-44 cellelinien (p = 0,04) (figur 5B).

(A) immunblotting af KLF6 i celler transficeret med præ-mIR-negativ kontrol eller præ-mIR-141 /200c . MIR-141 signifikant reduceret KLF6 proteinniveauet i de tre cellelinjer. (B) Efter 48 timers transfektion med pre-miRNA i hypoxiske betingelser blev VEGFA koncentrationen i kultursupernatanten målt ved ELISA. Alle resultater repræsenterer middelværdien ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. (C) I alt 29 adenocarcinom tumor vævssnit blev analyseret ved immunohistokemi med CD34 + som fartøj markør; to repræsentative tilfælde med høje /lave niveauer af MIR-141 er vist. (D) blev observeret signifikante forskelle i blod mikrokar tæthed mellem adenokarcinomer med høje niveauer af miR-141, og dem med lave niveauer af miR-141 (p 0,001).

Vi søgte derefter at afgøre, om der findes en relation mellem mIR-141 ekspressionsniveauer og antal blodkar i patientprøver. Efter bestemmelse af antallet af blodkar i tumorprøver fra 29 patienter ved immunhistokemi under anvendelse af et antistof mod CD34 +, som er en markør af blodkar endotel (figur 5C), vi klassificeret tumorprøverne i to grupper: høje eller lave niveauer af mIR-141. Det gennemsnitlige antal af blodkar i tumorer med høje niveauer var 22% højere end gennemsnittet i tumorer med lave niveauer (P 0,001; Figur 5D)

Multivariate analyser

I den multivariate analyse. på hele kohorte, vi medtaget alle de kliniske og biologiske faktorer med univariat P≤0.1 og risikoen score baseret på miR-141 og miR-200C udtryk. MIR-141 /miR-200C risikoscore (høj-risiko vs andre) opstod som en selvstændig prognostisk markør for kortere OS (OR, 2,787; 95% CI = 1,087-7,148; p = 0,033), sammen med scenen Jeg og alder . 65 (tabel 2)

I den multivariate analyse, herunder kun adenocarcinom patienter, at miR-141 /miR-200C risikoscore var også en uafhængig prognostisk faktor til OS (OR, 10,649; 95% CI = 2,433 til 46,608; p = 0,002) sammen med alder . 65 (tabel 2)

diskussion

i det nuværende arbejde, vi har fundet, at høj miR- 141 og miR-200C udtryk er forbundet med kortere overlevelse i resektion NSCLC adenocarcinom patienter, herunder dem med tidlige fase sygdom. Desuden kombinatoriske virkning af de to miRNA var en uafhængig prognostisk faktor til OS. Forskellige mekanismer er involveret i virkningen af ​​disse miRNA; mens miR-141 ser ud til at handle gennem angiogenese ved at hæmme

KLF6

og stigende

VEGFA

niveauer, miR-200C spiller en rolle i reguleringen af ​​markedsøkonomisk behandling.

For nylig, en fænotypisk plasticitet er blevet postuleret for forbigående EMT-MET processer [20]. Induktion af MET ved overekspression af miR-200 familiemedlemmer er vigtig på et senere tidspunkt i metastaser processen. Mens EMT tillader cellen at migrere fra den primære tumor, MET gør det muligt at kolonisere og producere metastaser i fjerntliggende organer [10], [11]. Således har både nedregulering og overekspression af miR-200 familiemedlemmer været relateret til dårligere prognose. For at undersøge, om reguleringen af ​​MET af miR-141 og miR-200c var histologi-afhængige, vi undersøgte deres prognostisk værdi i de to store histologiske undertyper og fundet både miR-141 og miR-200c var relateret til OS kun adenocarcinom patienter. Det er blevet observeret, at NSCLC adenocarcinom er en mere mesenchymal-lignende tumortype, da det er blevet observeret, at vimentin, en markør for mesenkymale celler blev overudtrykt i godt differentierede adenocarcinomer og i H23, A-549 og HCC-44 cellelinier , men ikke påvist i SCC væv [21], [22]. I tråd med vores resultater, miR-200C overekspression som en markør for dårlig prognose tidligere var rapporteret i en kohorte af 70 NSCLC patienter består af både adenokarcinom og SCC histologier [17], men dens prognostisk værdi blev ikke undersøgt i undergruppen af ​​patienter med adenocarcinom. I andre tumormodeller, såsom brystcancer, overekspression af MIR-200 familiemedlemmer medført øget metastase [23] og er forbundet med dårlig prognose [16]. Desuden har de høje serumniveauer af MIR-141 blevet forbundet med dårlig prognose i tyktarmskræft [24] og høje niveauer af MIR-200C med dårlig prognose i gastrisk cancer [25]. I modsætning hertil et arbejde ved hjælp af data fra en online TCGA database rapporterede, at lave niveauer af miR-200b *, miR-200a og miR-429 var relateret til kortere OS i en heterogen kohorte af NSCLC-patienter, der omfattede dem med metastatisk sygdom [26] .

Da miRNA graduere niveauerne for flere mål proteiner afhængig af deres sekvens, deres virkning er afhængig af de proteiner, der udtrykkes i hver celle typer [27]. Både miR-141 og miR-200C er placeret i samme kromosomale region (12p13.31) og deler den samme transskription start sted [28], men hvis vi gruppere miRNA i miR-200 familie efter ligheden mellem deres frø sekvens, kan vi identificere to forskellige klynger – miR-200BC /429 og miR-200a /141 – som adskiller sig ved en enkelt nukleotid ændring [29]. Selvom miR-141 og miR-200c transkriptionelt reguleres på samme måde, de adskiller sig i deres mål. Når vi analyserede rolle MIR-141 og MIR-200C i EMT /MET i H23, A-549 og HCC-44 cellelinjer, kun MIR-200C påvirket EMT i alle tre cellelinier. Overekspression af MIR-200C øgede proteinniveauer ved E-cadherin og reducerede migration kapacitet af tumorcellerne, som tidligere blev vist af Ceppi

et al

i et andet panel af NSCLC-cellelinier. Ceppi

et al

undersøgt ekspressionen af ​​miR-200C

in vitro

in vivo

og en stærk omvendt korrelation med invasion blev opdaget. Genindførelse af miR-200C i meget invasive /aggressive NSCLC celler inducerede et tab af mesenkymale fænotype ved at genoprette e-cadherin og reducere N-cadherinekspression, og hæmmet

in vitro

celle invasion samt

i vivo

metastasedannelse [30]. Desuden Pacurari et al. fandt, at miR-200C nedregulering i SCC lunge tumor prøver blev korreleret med øgede niveauer af DCL1, ATRX og HFE -. biomarkører relateret til EMT [31]

Selvom miR-141 er en mir-200 familiemedlem, det var ikke involveret i EMT /MET.

in vitro

overekspression af miR-141 var relateret til reduktion af

KLF6

protein niveauer, der producerer en stigning i udskillelsen af ​​

VEGFA

. Desuden tumorer med høje niveauer af MIR-141, havde et større antal blodkar. Det er blevet vist, at cancerassocierede fibroblaster (CAF) isoleret fra murine lunge-adenokarcinomer secernerede rigelige VEGFA og øget tumorcelleinvasion i cokultur undersøgelser [32]. Når vi analyserede ekspressionen af ​​MIR-141 i tumoren og parret normalt væv, blev der ikke observeret signifikante forskelle i ekspressionsniveauer, fører os til at spekulere, at den prognostiske rolle MIR-141 kan være relateret til dets ekspression i CAF-celler snarere end i tumorceller. Den overekspression af miR-141 ville føre til overproduktion af VEGFA og øget neoangiogenese, der tidligere har været relateret til prognose i NSCLC [33].

Materialer og metoder

Undersøgelse befolkning og etik redegørelse

Et hundrede og halvtreds-fem voksne patienter diagnosticeret med NSCLC, der gennemgik komplet kirurgisk resektion på Hospital Clinic i Barcelona, ​​Spanien fra marts 1996 og december 2009 er medtaget i undersøgelsen. Godkendelse til undersøgelsen blev opnået fra centrum institutionelle gennemgang bord, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

RNA ekstraktion og miRNA-analyse

Total RNA og miRNA detektion blev udført fra FFPE tumorvæv som beskrevet tidligere [34]. MiRNA detektion blev udført ved hjælp af kommercielle assays (TaqMan miRNA tests, Appplied Biosystems)

Western Blot-analyse

blev udført Western Blot-analyse som tidligere beskrevet [35] ved hjælp af følgende primære antistoffer:. KLF6 sc -7158 (Santa Cruz Biotechonology) og α-tubulin (Sigma).

Immunhistokemi

immunhistokemisk assay blev udført som tidligere beskrevet [36] under anvendelse af et Flex Monoclonal Mouse Anti-human CD34 Class II klon QBend 10 Klar-til-brug (Dako) og monoklonale Mouse Anti-human E-Cadherin Clone NCH-38 (Dako).

Blood fartøj kvantificering

Fire uafhængige områder blev valgt under en 40X felt, og en 200X felt (0,785 mm

2 pr felt), og bruges til at tælle CD34-positive skibe i hvert af disse områder. To uafhængige patologer undersøgte dias, og gennemsnittet af fire 200X felt tællinger af CD34-positive skibe blev registreret.

Cellelinjer, miRNA transfektion og VEGF kvantificering

H23 (American Type Culture Collection) og HCC-44 (DSMZ) celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen). A-549 (DSMZ) celler blev dyrket i DMEM (Invitrogen) indeholdende 10% føtalt kalveserum.

En dag før transfektion, 7 × 10

4-celler blev podet i plader med 6 brønde. Den følgende dag blev celler transficeret med 100 nM pre-MIR-141 /200c eller præ-MIR-Negative Control # 2 under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ved 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med 400 pM desferrioxamin at inducere hypoxiske betingelser. Efter 24 timers inkubation blev VEGF-koncentration i supernatanter målt i tre eksemplarer ved anvendelse af VEGF Humant Elisa Kit (ab100662, Abcam).

Cellemigration analyse

Cell migration blev målt ved

in vitro

scratch assay [37]. 5 * 10

5-celler blev udpladet i en plade med 12 brønde én dag før transfektion med pre-miRNA. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellemonolaget skrabet i en lige linje til at skabe en “bunden” med en p100 pipettespids. Afstanden migration (um) blev vurderet ved 36 h (HCC-44) eller 48 t (H23 og A-549) efter transfektion hjælp cellSense indtastning 1.7 software (Olympus).

statistiske analyser

OS blev beregnet ud fra tidspunktet for kirurgi til datoen for død eller sidste opfølgning. Kaplan-Meier kurver for OS, med deres konfidensintervaller 95% (CIS), blev trukket og sammenlignet ved hjælp af en log-rank test. Alle faktorer med en p-værdi 0,1 i univariate analyse blev inkluderet i Cox multivariate regressionsanalyser til OS

parret t-test blev anvendt til at sammenligne ekspressionsniveauerne af miRNA mellem tumorvæv og parret normalt væv.. Ikke-parret t-test blev anvendt til at sammenligne forskelle mellem to grupper. Optimale cutoffs af miRNA udtryk data til OS blev vurderet ved hjælp af maksimalt udvalgte log-rank statistik ved hjælp af Maxstat pakken (R pakke). Anvendeligheden af ​​disse cutoffs blev bekræftet af Kaplan-Meier-test. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af PASW Statistics v18 (SPSS) og R v2.8.1. Niveauet af signifikans blev sat til ≤0.05.

Støtte Information

figur S1.

Expression niveauer af miR-200 familiemedlemmer fås fra 155 NSCLC tumor og parret normalt væv. (A) Cluster 1: miR-200a, miR-200b, og miR-429. (B) Cluster 2:. MiR-141 og miR-200c

doi: 10,1371 /journal.pone.0101899.s001

(TIF)