PLoS ONE: Prækliniske Vurdering af carboplatin Behandling Effekt i lungekræft med 18F-ICMT-11-Positron Emission Tomography

Abstrakt

Tumor respons på behandlingen vurderes primært i klinikken ved reduktioner overvågning i tumorstørrelse. Men mangler følsomhed da flere uger i mange tilfælde kan gå, før der er tegn på tumor krympning, denne tilgang. Der er derfor behov for at udvikle ikke-invasive billeddannelsesteknikker til overvågning tumor behandling respons i klinikken. Her, vurderede vi pre-kliniske anvendelighed af

18F-ICMT-11 positronemissionstomografi – en fremgangsmåde til påvisning caspase 3/7 aktivering – i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

18F-ICMT-11 optagelsen blev sammenlignet med molekylære biokemiske foranstaltninger af celledød i PC9 og A549 NSCLC celler efter behandling med carboplatin

in vitro

in vivo

. Carboplatin-induceret apoptose i ERCC1 lav /mutant

EGFR

PC9 celler var præget af tid og dosisafhængig øget caspase-3/7 aktivering, poly-ADP-ribose polymerase spaltning og Annexin V farvning.

18F-ICMT-11 optagelse blev derfor øges op til 14 gange ved 200 uM carboplatin i forhold til vehikelbehandlede celler (

P

0,01). I modsætning hertil nekrose var den fremherskende død mekanisme i ERCC1 høj /vægt

påvistes EGFR

A549-celler og ingen ændring i

18F-ICMT-11-optagelse.

In vivo

, histologisk analyse af PC9 tumorxenoplantater angivet høj præ-terapi nekrose. En 4,6 gange stigning i spaltet caspase-3/7 blev målt i ikke-nekrotiske regioner af PC9 tumorer ved 48 timer efter carboplatin-terapi. Gennemsnitlig PET-afledt tumor

18F-ICMT-11-optagelse var ufølsom over for ændringer i apoptose i nærvær af betydelige præeksisterende nekrose. PET-baserede voxel intensitet sortering dog identificeret intra-tumorale regioner med høj

18F-ICMT-11 optagelse, der muliggør nøjagtig vurdering af apoptose og derfor terapi respons. I A549 tumorer, der manglede høj præ-terapi nekrose, carboplatin induceret væksthæmning, der var kun minimalt associeret med apoptose og derfor ikke kan påvises ved

18F-ICMT-11 PET

Henvisning:. Witney TH, Fortt RR , Aboagye EO (2014) Prækliniske Vurdering af carboplatin Behandling Virkning hos Lung Cancer af

18F-ICMT-11-Positron Emission Tomography. PLoS ONE 9 (3): e91694. doi: 10,1371 /journal.pone.0091694

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: December 20, 2013; Accepteret: 12. februar 2014 Udgivet: marts 11, 2014

Copyright: © 2014 Witney et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen ført til disse resultater har modtaget støtte fra initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende (www.imi.europa.eu) under tilskudsaftale nummer 115.151, ressourcer som er sammensat af finansielle bidrag fra den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013 ) og EFPIA virksomhedernes i naturalier bidrag. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) tegner sig for den højeste cancerrelateret mortalitet [1]. Adaptive randomisering af patienter til forskellige behandlinger på grundlag af biopsi-informeret tumor profilering understreger potentielle fordele af biomarkører til at forudsige respons på terapi (BATTLE forsøg [2]). Eksistensen af ​​forskellige resistensmekanismer i NSCLC herunder dem drevet af

EGFR

,

ELM-ALK

, og

AXL

(mutant) genprodukter dog indebærer, at upfront patient lagdeling til terapi er problematisk [3]. Terapi kan føre til hurtig udryddelse af følsomme kloner, men lige så aggressiv subklon udvidelse fører til forbigående remission og tilbagefald [4]. I denne sammenhæng er blevet identificeret flere resistensmekanismer involverer dereguleret apoptoseveje [3]. Med et begrænset antal ‘livsforlængende “behandlingsformer og en ufuldstændig forståelse af narkotika resistensmekanismer, er det muligt, at tidlig evaluering af effekten kan give mere rettidig skifte til alternative behandlingsformer. Der er dog mangel på tidlige virkning biomarkører. Med hensyn til imaging effekt biomarkører, en gennemgang af Zhao og medarbejdere fremhævede nytten af ​​molekylær billeddannelse herunder positron emission tomografi (PET), når det kombineres med anatomisk billeddannelse, som en måde at vurdere effekten i biopsi-utilgængelige læsioner [5], og overlegen i forhold til klinisk vurdering af respons evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) alene [6].

En af de godt beskrevet pathway biomarkører i tilknytning til både medfødt og erhvervet resistens i NSCLC er apoptose pathway [3]. Apoptose, eller programmeret celledød, er en vigtig proces kræves for vævshomeostase, embryonisk udvikling og afskaffelse af skadelige celler i kroppen. Under tumorudvikling de mekanismer, der styrer normal celle apoptose bliver dereguleret. Nogle af de mest almindeligt muterede gener fundet i cancer, p53 og Bcl-2, diktere hvis /når cellerne leve eller dø [7], [8]. For at overvinde iboende tumor resistens til normale death stimuli, traditionelle cytotoksiske, strålebehandling og mekanisme-baserede terapier er blevet designet til at inducere tumorspecifik apoptotisk celledød gennem adskillige divergerende mekanismer. Disse forskellige mekanismer konvergere med aktivering af effektor caspase, caspase-3, under udførelsesfasen af ​​apoptotisk celledød, med efterfølgende forpligtelse til DNA-nedbrydning, nedbrydning af den cellulære cytoskelet, membranblæredannelse, dannelse af apoptotiske legemer og fjernelse af cellen af immunsystemet [9].

Blood biomarkører for celledød er blevet udforsket i lungekræft via måling af opløseligt caspase-spaltet cytokeratin 18 produkt M30 [10], selv om denne metode hverken giver oplysninger om heterogene læsion respons det er heller ikke i stand til at skelne mellem tumor respons og normalt væv toksicitet. I betragtning af den næsten universelle forekomst af caspase-3/7 aktivering i programmeret celledød, kunne dens afsløring af billeddannelse være en lovende biomarkør for behandlingseffekt. Vi har for nylig udviklet en caspase-3/7-specifik probe,

18F – (

S

) -1 – ((1- (2-fluorethyl) -1 H- [1], [2] , [3] triazol-4-yl) methyl) -5- (2 (2,4-Difluorophenoxymethyl) -pyrrolidin-1-sulfonyl) isatin (

18F-ICMT-11), for det

in vivo

billeddannelse af terapi-induceret tumor apoptose.

18F-ICMT-11 er blevet vist af os og andre til at være et følsomt mål for både traditionelle cytotoksisk induceret celledød [11] – [13], og tumor apoptose efter behandling med et lille molekyle caspase aktivator [11] . Automatiseret, facile radioaktiv mærkning af

18F-ICMT-11 er blevet beskrevet til GMP-standarder [14], med en første-in-man forsøg rapportering favorabel dosimetri profil [15]. NSCLC kan præsentere som et kompleks læsion herunder præ-terapi nekrotiske komponenter; en detaljeret vurdering af specificitet

18F-ICMT-11 mod apoptotisk celledød i forhold til terapi-induceret nekrose er ikke tidligere blevet rapporteret. I denne artikel præsenterer vi en ny strategi til påvisning af behandlingseffekt med

18F-ICMT-11 PET i prækliniske modeller af NSCLC med varierende reaktioner på carboplatin, der er knyttet til unikke genetiske pre-determinanter for respons.

Materialer og metoder

Cell kultur

PC9 og A549 celler fra LGC Standards (Teddington, Middlesex, UK). PC9 celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium, med A549s dyrket i DMEM. Begge medier blev suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100 U.mL-1 penicillin og 100 μg.mL-1 streptomycin (Invitrogen, Paisley, Refrewshire, UK), og cellerne blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Celledød blev induceret ved tilsætning af carboplatin (Accord Healthcare Ltd., Middlesex, UK, 0-200 uM).

Growth Inhibition Assay

Lægemiddelkoncentrationer som hæmmede 50% af cellevækst ( GC

50) blev bestemt under anvendelse af et sulforhodamin B (SRB) -teknik som beskrevet andetsteds [16]. Alle cellelinier blev behandlet i 72 timer, 24 timer efter podning, medmindre andet er angivet

Flowcytometrisk Målinger af celledød

Celler blev trypsineret (0,25% trypsin, 1 mM EDTA). Og høstet ved centrifugering (1300 g, 3 min). Fritstående celler til stede i medierne før trypsinisering blev lagret, og samlet med de trypsiniseret celler. Cellepellets (1 × 10

6 celler) blev vasket i iskold HEPES-bufret saltvand (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI

2, pH 7,4) og resuspenderet i 100 pL af den samme buffer. Annexin V, Alexa Fluor 488 (Invitrogen) blev tilsat (5 pi /100 pi cellesuspension) i kombination med 7-aminoactinomycin D (7-AAD, 20 μg.mL

1; Invitrogen), før inkubering i 10 min ved 20 ° C. Den resulterende blanding blev vasket en gang, holdes kortvarigt på is, og derefter analyseret i et LSRII cytometer (BD Biosciences, Rockville, MD), med 20.000 celler talt pr begivenhed. Resterende cellerester, identificeret på fremad (FS) og side lysspredning (SS) profiler, blev udelukket fra analysen ved selektiv gating.

Western blots

PolyADP-ribose polymerase (PARP) og caspase-3-spaltning blev vurderet ved anvendelse af en standard Western blotting-protokol [17]. Membraner blev probet under anvendelse af polyklonalt kanin-anti-PARP1 antistof (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK 1:1000), en kanin monoklonalt anti-ERCC1 antistof (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA; 1:1000) og et polyklonalt kanin anti-spaltet caspase-3-antistof (Cell Signaling Technology, 1:1000). En kanin-anti-actin-antistof (Sigma-Aldrich Co. Ltd, 1:2000) blev anvendt som en loading kontrol. Blots blev scannet (Bio-Rad GS-800 Kalibreret densitometer; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og signal kvantificering blev udført ved densitometri under anvendelse scanning analyse software (Mængde One; Bio-Rad)

18F-ICMT-11 Radiosynthesis

18F-ICMT-11 syntese og radioaktiv mærkning blev udført i overensstemmelse med tidligere beskrevet metode [14]. Radiokemiske renhed var . 98% ved slutningen af ​​syntese med en specifik aktivitet på 35,1 ± 7,9 GBq /pmol (

n

= 8)

In vitro

18F-ICMT-11 celleoptagelse

Celler (1 x 10

5) blev udpladet i 6-brønds plader natten forud for behandlingen (køretøj /carboplatin). På dagen for eksperimentet frisk vækstmedium indeholdende 0,74 MBq

18F-ICMT-11 blev sat til individuelle brønde. Celleoptagelse blev målt efter inkubation ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i 60 min. Derefter blev cellerne trypsineret (0,25% trypsin, 1 mM EDTA) og høstet ved centrifugering (1300 g, 3 min). Fritstående celler til stede i medierne før trypsinisering blev lagret, og samlet med de trypsiniseret celler. Celler blev vasket 3 gange med iskold PBS (1 ml, 1300 g, 3 min), med 20 pi efterfølgende tages for caspase-3/7 Aktivitetsmenutast vurdering (se nedenfor), før pelletering af de resterende celler og lysis i RIPA puffer (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA; 1 ml, 10 min). Cellelysat blev overført til tælle rør og forfald-korrigerede radioaktivitet blev bestemt på en gamma-tæller (Cobra II Auto-Gamma tæller, Packard Biosciences Co, Pangbourne, UK). Alikvoter blev lynfrosset og anvendes til proteinbestemmelse efter radioaktivt henfald under anvendelse af et BCA 96-brønds plade-assay (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA). Data blev udtrykt som procent af total radioaktivitet pr mg protein, kalibreret under anvendelse af 10 gl standarder for de 0,74 MBq /ml

18F-ICMT-11 stamopløsning.

Caspase-3/7 Aktivitetsmenutast Assay

caspase-3/7 Aktivitetsmenutast blev bestemt under anvendelse Promegas caspase-3/7-assay ifølge producentens instruktioner (Promega, Madison, WI, USA). Celler blev inkuberet i 1 time med caspase-Glo-reagens, og den enzymatiske aktivitet af caspase-3/7 blev målt ved anvendelse af en TopCount NXT mikroplade luminescens-tæller (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) og normaliseret til proteinindhold (BCA). Dataene blev udtrykt som en fold-stigning i caspase-3 aktivitet i køretøjet kontrol celler.

In vivo

Tumor Modeller

Alle eksperimenter dyr blev udført af autoriserede efterforskere i overensstemmelse med det Forenede Kongerige Home Office Vejledning om, hvordan ordningen for Animal (Videnskabelige procedurer) Act 1986, i henhold til projektet licens 70/7177, og inden for de offentliggjorte retningslinjer for velfærd og anvendelse af dyr i kræftforskningen [18]. Tumorceller (2 × 10

6 og 5 × 10

6 for PC9 og A549, henholdsvis) blev injiceret subkutant på bagsiden af ​​BALB /c nøgne mus (i alderen 6-8 uger, Charles River), med dyr behandlet med køretøj eller carboplatin når xenotransplantaterne nåede -100 mm

3 (se nedenfor for behandling skema). Tumor dimensioner blev målt periodisk ved anvendelse af en kaliber og tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af ligningen:. Volumen = (π /6) × a × b × c, hvor a, b og c viser tre ortogonale akser tumoren

PET Imaging Studies

Dynamisk

18F-ICMT-11 billedbehandling scanninger blev udført på en dedikeret lille dyr PET-scanner (Siemens Inveon PET-modul, Siemens Medical Solutions USA, Inc.) efter en bolus

iv

injektion af ~3.7 MBq radiotraceren i tumorbærende mus [19]. Dynamiske scanninger blev erhvervet i listen tilstand format over 60 minutter. De indsamlede data blev derefter sorteret i 0,5 mm sinogram skraldespande og 19 tidsrammer for billedet genopbygning (4 × 15 s, 4 × 60 s og 11 × 300 s), som blev udført af iterativ rekonstruktion (2D-OSEM). Siemens Inveon Research Arbejdsplads software blev anvendt til visualisering af radiotracer optagelse i tumoren; 30-60 min kumulative billeder af de dynamiske data blev anvendt til at definere tre-dimensionelle (3D) områder af interesse (ROI’er). Optællingen densiteter blev midlet for alle ROI’er på hvert tidspunkt for at opnå en tid versus radioaktivitet kurven (TAC). Tumor TAC blev normaliseret til injiceret dosis, målt ved en VDC-304 dosiskalibrator (Veenstra Instruments), og udtrykt som procent injiceret dosis pr ml væv, ved hjælp kalibreringsfaktoren bestemt for Inveon PET-scanner. For billedet visualisering, blev 3D-OSEM rekonstruktion udført og præsenteret som summerede 30-60 min frames.

In vivo

Carboplatin behandlingstabel

Til behandling-respons undersøgelser, mus med størrelse-matchede ca. 100 mm

3 xenotransplantattumorer blev behandlet ip med enten vehikel (saltvand; 0,012 ml /g legemsvægt) eller carboplatin (Accord Healthcare Ltd .; 120 mg /kg; 0,012 ml /g legemsvægt). 24 timer efter injektion blev carboplatin-behandlede og kontrol køretøj mus afbildet af

18F-ICMT-11 PET. En anden gruppe af mus modtog to doser af enten vehikel eller carboplatin, med den anden injektion administreres 24 timer efter den første dosis. Disse mus blev efterfølgende afbildet af

18F-ICMT-11 PET 48 timer efter den første dosis.

PET-baserede Voxel Intensitet Sortering histogrammer

intensiteter af alle voxels inden for tumor ROIs blev beregnet og sorteret som pr deres intensitet frekvens til opnåelse af PET-baserede voxel intensitet sortering (PVIS) histogrammer [11]. For hver ROI, alle voxels, 30-60 minutter efter radiotracer tilføjelse og deres tilhørende intensitet blev udvundet (~300 voxels pr ROI). Voxel intensiteterne fordelinger blev yderligere bearbejdet gennem en statistisk analyse (Prism v5.0 software, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Inden for det snævre interval af apoptose set vilkårlige vi valgt 95

percentil cut-off til biologisk beskrive 5% højeste intensitet voxel-sandsynligt at indeholde apoptotiske celler – snarere end for eksempel på grundlag af modtageren driftskarakteristik analyse.

aktiv caspase-3 og TUNEL Immunhistokemi Assay

efter PET billeddiagnostiske undersøgelser blev tumorvæv fjernet, fikseret i formalin, indlejret i paraffin, sektioneret (5 um skiver) og forarbejdet til aktiv caspase-3 og DNA-nedbrydning terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) fluorescerende påvisningsassays vha spaltet caspase-3 (Asp 175) monoklonalt antistof (Cell Signaling Technology) kombineret med Alexa Fluor 594 gede-anti-kanin (Invitrogen) og In situ Celledød Detection Kit (Roche), hhv. Den Prolong Gold antifade monterings opløsning (Invitrogen) indeholdende 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) blev tilsat til vævssnit før montering af dækglas. TUNEL-assayet blev udført ifølge producentens vejledning, med caspase-3-farvning udført ifølge [11], [13]. Alternative snit blev modfarvet med hematoxylin og eosin (H Online Resource 1) og har vægt

EGFR

. Celledød blev induceret

in vitro

i PC9 og A549 humane NSCLC celler efter carboplatin behandling (0-200 uM). Dosisafhængig væksthæmning vurderet ved 72 timer efter behandling med en sulforhodamin B assay (SRB) viste halv maksimal væksthæmning (GC 50

) af 71,6 ± 9,5 uM og 136 ± 31,6 uM for PC9 og A549 henholdsvis (

n

= 3;. figur 1A). Apoptotisk celledød blev bedømt ved western blotting. Niveauer af spaltet caspase-3 og spaltningen af ​​sin nedstrøms substrat, PARP, viste en dosisrelateret stigning i PC9 celler, hvorimod der ikke blev observeret nogen ændringer med A549 (fig. 1B). Flowcytometrisk målinger bekræftede en apoptotisk mekanisme for celledød i PC9s (figur 1C.), Med nekrose den primære mekanisme til dødsfald i A549s (figur 1D.)

A:. Carboplatin-induceret væksthæmning i PC9 og A549 celler under anvendelse et sulforhodamin B-assay 72 timer efter behandling. B: Western blot-analyse af indholdet af uspaltet PARP, spaltet PARP og spaltes (aktiv) caspase 3 72 h efter carboplatin behandling (0-200 uM) i PC9 og A549-celler. Actin blev anvendt som en loading kontrol. C, D: Flowcytometrisk analyse af PC9 (C) og A549-celler (D) behandlet med carboplatin (100 uM) eller vehikel. Apoptotiske celler blev identificeret ved Annexin V-Alexafluor488 (λ Ex /Em = 495/519 nm) og nekrotiske celler med 7-AAD (λ Ex /Em = 546/647 nm). Befolkning Q4 repræsenterer levedygtige celler, mens befolkningen Q3 repræsenterer apoptotiske celler, der har lav 7-AAD fluorescens og pletten med Annexin V. Befolkning Q2 repræsenterer sekundære apoptotiske /nekrotiske celler.

18F-ICMT- 11 Cell optagelse korrelerer med caspase-3 Aktivering

in vitro

Dosis-afhængige ændringer.

Carboplatin-induceret celledød blev oprindeligt evalueret med

18F-ICMT- 11

in vitro

(fig. 2A). Carboplatin behandling af PC9 celler resulterede i en dosis-afhængig aktivering af caspase-3/7 Aktivitetsmenutast (Caspase-Glo assay;. Figur 2B), op til 87 ± 19 gange på 200 um (

P

= 0,001 ,

n

= 3). Disse data underbygger yderligere resultater opnået ved Western blot og flowcytometri (fig. 1B og C.). Ændringer i caspase-3/7 aktivitet blev ikke påvist i A549 ved lignende lægemiddelkoncentrationer (Fig 2B.)

A:. Kemisk struktur af

18F-ICMT-11. B: Dosis-afhængige ændringer i caspase 3/7 aktivitet efter carboplatin behandling. C: Dosis-afhængige ændringer i

18F-ICMT-11 optagelse i celler efter carboplatin behandling. D: Sammenhæng mellem caspase 3-aktivitet og

18F-ICMT-11 optagelse i PC9 celler

Tilsætning af 0,74 MBq (20 uCi)

18F-ICMT-11 til celler 72h indlæg. carboplatin behandling (0-200 uM) resulterede i detekterbar optagelse og fastholdelse af radiotraceren følgende 1 h puls-chase med radiotracer. En stigning i cellulær optagelse, proportional med carboplatin dosis blev målt i PC9 celler; nåede statistisk signifikans ved 100 uM, stigende fra 28,8% ± 6,7% radioaktivitet /mg protein for vehikelbehandlede kontroller til 414,4% ± 20,1% radioaktivitet /mg protein ved 200 uM (

n

= 3; P 0,01 ), en 14,4-fold forøgelse (fig. 2C). Der var en fremragende korrelation mellem cellulær caspase-3/7 aktivitet og

18F-ICMT-11 optagelse i denne linje (figur 2D;. R

2 = 0,954). Ingen signifikant ændring i

18F-ICMT-11 optagelse blev detekteret med A549-celler efter tilsætning af carboplatin (fig. 2C).

Tidsforløb for apoptotisk celledød.

Tidsforløbet af apoptotisk celledød blev yderligere bedømt ved 50 uM carboplatin, en dosis tæt på GC

50 af PC9 celler (fig. 1A). Starten af ​​apoptose i PC9s kunne påvises ved 48 timer efter behandling, målt ved et 7,8 ± 4,6 gange stigning i caspase-3/7 aktivitet (

P

= 0,03;

n

= 4 ;. figur 3A), med caspase-3 og PARP-spaltning også tydeligt ved Western blot (fig 3B (ii.)). En tidsmæssig stigning i spaltet caspase-3 blev detekteret op til 96 timer efter behandling i PC9 celler der var imidlertid en reduktion i caspase-3-aktivitet mellem 72 og 96 timer og faldt fra 19,1 ± 3,4 gange til 11,1 ± 0,8-fold stige over baseline henholdsvis (

n

= 4;

P

= 0,036). Størrelsen af ​​apoptotisk respons var 7,9 gange lavere med celler behandlet med 50 pM i 96 timer i sammenligning med en koncentration på 200 uM på samme tidspunkt.

18F-ICMT-11 intracellulær akkumulering spejlet den tidsmæssige forøgelse af kløvet caspase-3 i denne cellelinie (fig. 3B, C), stiger fra 15,8% ± 4,2% radioaktivitet /mg protein til 64% ± 8,1% radioaktivitet /mg protein i celler behandlet ved 50 uM i 96 timer sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (

P

= 0,009). Trods fremragende korrelation mellem cellulær kløvet caspase-3 og

18F-ICMT-11 optagelse i denne cellelinie, korrelation mellem

18F-ICMT-11 optagelse og caspase-3/7 aktivitet blev mindre veldefineret (fig. 3D R

2 = 0,3314). Trods påvisning af svage bånd svarende til spaltet caspase-3 og PARP med A549 celler behandlet enten 48 timer eller 72 timer (fig. 3B (ii)), var der ingen stigning i påviseligt caspase-3/7-aktivitet (fig. 3A) . Samtidig var der ingen signifikant ændring i

18F-ICMT-11 over hele denne tidsforløbet (Fig 3C.)

A:. Tidsforløb for ændringer caspase 3/7 aktivitet efter carboplatin behandling. B: Western blot-analyse af indholdet af uspaltet PARP, spaltet PARP og spaltes (aktiv) caspase 3 stolpe 50 pM carboplatin behandling (0-96 h) i PC9 (i) og A549-celler (ii). C: Temporal ændringer i

18F-ICMT-11 optagelse i celler efter carboplatin behandling. D: Sammenhæng mellem caspase 3-aktivitet og

18F-ICMT-11 optagelse i PC9 celler

18F-ICMT-11 kan skelne Apoptotisk fra Nekrotisk Cell Død

in vivo.

midlertidige ændringer i behandlingsrespons.

PC9 og A549 tumorer blev dyrket som xenografter, med kaliber målinger af tumorstørrelse målt efter køretøj, 24 timer og 48 h carboplatin behandling (120 mg /kg ip dagligt) og sammenlignet med baseline. For begge tumorer, carboplatin behandling resulterede i vækst anholdelse. For PC9 tumorer blev en signifikant forskel i tumorvolumen målt 48 h efter carboplatin behandling i forhold til køretøjets kontroller, der er steget til 143 ± 18% baseline mængde med carboplatin-behandlede tumorer resterende ved 96 ± 13% baseline volumen (

P

= 0,013;

n

= 4;. figur 4A). En væsentlig forsinkelse i tumorvækst blev målt både 24 timer og 48 timer efter carboplatin behandling i A549 tumorer i forhold til køretøjets kontroller (Fig 4B.); senere tidspunkter blev ikke målt

A, B:. Tumor volumener registreret af kaliber målinger af PC9 (A) og A549-tumorer (B) før og efter carboplatin behandling som angivet. De viste data er gennemsnit ± SD af% volumen i forhold til baseline (

n

= 4). *,

P

0,05; **,

P

0,01. C, D: repræsentant axial PET-CT-billeder (30-60 min summeret aktivitet) for PC9 (C) og A549 (D) tumorer. Tumor margener, der er angivet fra CT billedet, er skitseret i rødt. Middel ± SD (

n

= 4-6 dyr pr gruppe). E, F: Tumor TAC repræsenterer gennemsnitlige tællinger fra en dynamisk 60-minutters scanning for PC9 (E) og A549 xenografter (F) efter carboplatin behandling (køretøj, 24 timer eller 48 timer carboplatin-behandlede

n =

4-6 dyr pr gruppe).

Vi næste vurderet

18F-ICMT-11 som en følsom markør for tumor celledød

in vivo

. Tumor-associerede

18F-ICMT-11 radioaktivitet blev bestemt ved dynamisk 60-minutters PET billeddannelse. Repræsentative aksiale Billeder, der viser tumorassocierede

18F-ICMT-11 er illustreret i figur 4C og 4D til PC9 og A549 tumorer hhv. 3D regioner af interesse blev defineret for både PC9 og A549-tumorer, med gennemsnitlige tællinger anvendes til at opnå en tid versus radioaktivitet kurven (ROI, Fig 4E og 4F hhv.). For begge tumor linjer, var der ingen signifikant forskel i gennemsnit tumor-associerede

18F-ICMT-11 radioaktivitet på 24 timer og 48 timer efter carboplatin behandling i forhold til kontrol af køretøjer som defineret af arealet under TAC’en (30-60 min) eller normaliserede optagelse er værdier ved 60 minutter efter radiotracer indsprøjtning (% ID /ml

60).

confounds tumor heterogenitet.

Axial billeder af 30-60 min opsummerede aktivitet afsløret en heterogen mønster af

18F-ICMT-11 distribution i PC9 tumorer (fig. 4C), mens A549 radioaktivitet var mere homogen i sin distribution (fig. 4D). Selvom den delvise volumen effekt kan bidrage til denne tilsyneladende heterogenitet, voxel-wise analyse af PET data ved PVIS (30-60 min) bekræftede uensartet fordeling af

18F-ICMT-11 tumor radioaktivitet (fig. 5A og 5B for PC9 og A549 henholdsvis). For PC9s, var der et klart skift i PVIS histogrammer over 48 timer tidsforløb, med en 1,5-fold gruppe gennemsnitlig stigning i antallet af voxel med høj intensitet i PC9 tumor ROI’er af carboplatin injicerede mus sammenlignet med vehikel, som vist ved den 95

percentil (

P

= 0,01;. figur 5C). Ingen signifikant forskel voxel intensiteter eller distributionen blev observeret i A549 tumorer over behandlingen tidsforløbet (fig. 5D).

De intensiteter af alle voxels inden for tumor ROI’er blev beregnet og udtrykt som histogram plots af normaliseret voxel intensitet versus antallet af voxels. A, B: Typiske data fra tre repræsentative dyr (køretøj, 24 timer eller 48 timer carboplatin-behandlet) for PC9 (A) og A549 (B) er vist. C, D: Den statistiske sammenligning af 95

percentil voxel intensiteter for PC9 (C) og A549 (D) blev udført under anvendelse Prism v5.0 software (GraphPad). Middel ± SD (

n

= 4-6 dyr pr gruppe) *,

P

. 0,05; **,

P

. 0,01

H 3,5% ± 0,70% kløvet caspase-3 farvning blev målt 48 timer efter behandling, signifikant højere end køretøjets kontroller (4,6-dobling;

P

= 0,0003;. Figur 6B). I sammenligning med bærerbehandlede kontrol PC9 tumorer, TUNEL farvning var 3,5 gange højere 24 timer efter behandling, stiger fra 0,49% ± 0,17% farvning til 1,74% ± 0,17%, (

P

= 0,047; Fig. 6C). Ingen signifikant ændring i TUNEL-farvning blev målt 48 timer efter behandling på grund af store variationer i de tilfældigt udvalgte FOVs. I A549-tumorer, carboplatin behandling resulterede i tab af cellularitet, defineret ved H stigende fra 0,14% ± 0,05% til 0,87% ± 0,02% i køretøjer og 24 h carboplatin-behandlede tumorer henholdsvis (

P

= 0,0015;. figur 6A 6C). En lille stigning i kløvet caspase-3 farvning blev målt 48 timer efter carboplatin behandling i A549 tumorer, stigende fra 0,34% ± 0,07% i bærerbehandlede tumorer til 0,70 ± 0,13% (2-fold stigning;

P

= 0,02;.. figur 6B)

Tumor væv blev fjernet efter PET imaging scan, forarbejdet til histologisk analyse og farvet for aktiv (spaltet) caspase-3 og DNA-fragmentering (TUNEL-assay) påvisning, sammenholdt med H 0,05; ***,

P

0,001.

n

= 3 tumor sektioner med 5 tilfældige FOV per afsnit. Fotografiske billeder af H V, levedygtige.

Diskussion

Platinum-terapi er den mest effektive terapeutiske regime til avanceret NSCLC med responsrater på 15-30% i uselekterede patienter (median overlevelse, 10- 12 måneder) [23]. Adskillige mekanismer er blevet beskrevet at understrege medfødt og erhvervet resistens over for platinbaseret terapi involverer ændringer i nukleotid excision reparation [21]. ERCC1 udtryk spiller en central rolle i disse DNA beskadiget-medieret reparation veje [24]. På det seneste andre mekanismer involverer

EGFR

er blevet beskrevet. Især epistatisk interaktioner mellem FANCD2 og mutant

EGFR

celler har vist sig at hæmme homolog rekombination reparation og bevidstgøre celler til platinbaseret terapi [20]. I øjeblikket evaluering af effekt til platinbaseret terapi, såvel som de fleste andre behandlingsformer stole på RECIST evaluering, selv om mange måneder kan passere, før behandlingssvigt opdages ved RECIST-kriterierne alene [25].