PLoS ONE: Klinisk Virkningen af ​​en roman MicroRNA Chemo-Sensitivity Predictor i Gastroøsofageal Cancer

Abstrakt

Baggrund

miRNA kan være potentielt nyttige biomarkører for forudsigelse af respons på kemoterapeutiske midler, strålebehandling og overlevelse . Formålet med denne retrospektive undersøgelse var at validere miRNA respons prædiktorer i en kohorte af patienter med gastroøsofageal cancer for at forudsige den samlede overlevelse (OS) og sygdomsspecifikke overlevelse (DSS).

Materiale og fremgangsmåder

undersøgelsen befolkning omfattede 53 patienter behandlet med helbredende hensigt til loco-regional gastroesofageal kræft. miRNA-ekspression blev kvantificeret fra præ-terapeutiske og diagnostiske, formalinfikserede, paraffin indlejret tumor prøver vha Affymetrix GeneChip miRNA 1.0 Array. Baseret på vækstinhibering af NCI60 panelet i nærvær af cisplatin, epirubicine og capecitabin, var en miRNA baseret reaktion prædiktor udviklet. Den Cox proportionel risiko model blev anvendt til at vurdere sammenhængen i indsatsen prædiktor med OS og DSS.

Resultater

En univariat analyse viste en statistisk signifikant forbedring af OS til patienter, som havde gennemgået kirurgisk resektion med forudsigelse score over median forudsigelse score (HR: 0,41 (95% CI:. 0,17-0,96) Justering til operation og scene, blev denne indikator identificeret at være uafhængigt forbundet med både OS (HR: 0,37 (95% CI: 0.16- 0,87)) og DSS (HR:. 0,32 (0,12-0,87))

Konklusion

miRNA profil prædiktive for følsomhed over for cisplatin, epirubicine og capecitabin viste sig at være uafhængigt forbundet med OS og DSS hos patienter med gastroøsofageal kræft

Henvisning:.. Winther M, Knudsen S, Dahlgaard J, Jensen T, Hansen a, Jensen PB, et al (2016) Klinisk Virkningen af ​​en roman MicroRNA Chemo-Sensitivity Predictor i . gastroesofageal Cancer PLoS ONE 11 (2):. e0148070 doi: 10,1371 /journal.pone.0148070

Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health center, UNITED STATES

modtaget: 8 oktober 2015; Accepteret: 12 januar 2016; Publiceret: 17 feb 2016

Copyright: © 2016 Winther et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle microRNA datafiler er tilgængelige fra Gene Expression Omnibus database. Den DOI at lokalisere disse data vil blive udstationeret i de kommentarer dette papir

Finansiering: Undersøgelsen blev støttet af Det Danske Cancer Society, cirro – Lundbeckfonden Center for interventionel forskning i Stråling Oncology og Dansk. strategiske Forskningsråd, Karen A. Tolstrups Fond, AP Møller Fonden til fremme af Medical Science og Dansk Kraeftforsknings Fond

konkurrerende interesser:. forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konkurrerende interesser: SK , PBJ, JD, TJ og AH erklærer tidligere eller nuværende primære beskæftigelse eller ejerskab i Medicinsk Prognose Institute, der har et potentiale til at drage fordel af disse resultater. Medicinsk Prognose Institute har en patentansøgning om emnet (WO2011135459: Metoder og enheder til at identificere biomarkører for behandlingsrespons og anvendelse deraf til at forudsige behandlingseffekt). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

kemo- og strålebehandling er væsentlige terapeutiske strategier for kræftbehandling. Men på grund af iboende eller erhvervet resistens behandling, kemo- og radioterapi mislykkes, at fjerne alle tumorceller [1]. Desuden er reaktioner på den samme behandling ofte i kontrast til patienter med tilsyneladende identiske kræftformer og for patienter, der ikke reagerer på behandling, kan den tid mistede være uigenkaldeligt ødelæggende.

Precision medicin er en lovende metode til forbedring af behandlingen respons og overlevelsesrater under hensyntagen genetisk variation i tillæg til variation i genekspression. Derfor identifikation af biomarkører prædiktive for effekt af kemoterapeutiske midler og strålebehandling er af stor klinisk værdi. I klinisk kræftforskning, microRNA (miRNA) er biomarkører med et betydeligt potentiale på grund af både væv-specificitet og afvigende ekspression i tumorceller [2]. miRNA er små, endogen, ikke-kodende RNA’er, der virker som posttranskriptionel regulatorer, målrettet mRNA til nedbrydning eller translationel undertrykkelse [3]. De er involveret i reguleringen af ​​mange biologiske processer, herunder tumor tilblivelse, fungerer som tumor undertrykkere eller onkogener [3,4].

Derudover har miRNA udtryk profilering vist sig at være forbundet med tumor progression og reaktion på terapi, hvilket tyder på deres anvendelse som prognostiske og prædiktive biomarkører samt deres vigtige rolle i reguleringen af ​​narkotika følsomhed [5,6]. Identifikation af miRNA prædiktiv for behandlingsrespons tilbyder en yderst lovende mulighed for direkte kliniske beslutninger for valg af behandling og forbedre resultatet af sygdom.

I denne retrospektive undersøgelse af patienter med gastroøsofageal cancer, en roman bioinformatik strategi er blevet anvendt . Baseret på vækstinhibering af 60 humane cancercellelinier (NCI60) udsættes for cisplatin, epirubicine og capecitabin, foruden deres hidtidige miRNA ekspression af de 60 cellelinier, en miRNA-baserede reaktion prædiktor til de tre kemoterapeutiske midler blev udviklet. Formålet med denne undersøgelse var at validere respons prædiktor hos patienter med loco-regional gastroesofageal kræft behandles med kurativ intention for at forudsige udfaldet i form af samlet overlevelse og sygdomsspecifik overlevelse.

Materialer og metoder

patienter

undersøgelsen bestod af 53 patienter diagnosticeret med loco-regional gastroesofageal kræft (gastroøsofageal krydset cancer (GEJ) eller gastrisk cancer (GC)) med tilgængelige præ-terapeutisk og diagnostisk, formalin -Faste, paraffin indlejrede (FFPE) tumor prøver med tilstrækkeligt materiale til miRNA microarray analyse (mindst 400 ng total RNA). Alle patienter blev diagnosticeret med loco-regional gastroesofageal kræft i perioden 2009-2012 og behandles med kurativ intention ved Dept. of Oncology, Århus Universitetshospital, Danmark. Klinisk-patologiske parametre blev indhentet fra journaler og patologi rapporter. Kun TNM-etaper var til rådighed fra de medicinske journaler, og dermed blev patienterne efterfølgende iscenesat af forfatterne efter de femte-syvende udgaver af AJCC /UICC mellemstationer retningslinjerne for. Undersøgelsen blev godkendt af Region Midtjylland Udvalgene vedrørende Health Research Etik og Dansk Datatilsynet og blev gennemført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen. Dispensation fra indkøb af informeret samtykke fra patienterne i undersøgelsen populationen blev givet af Region Midtjylland Udvalgene vedrørende Health Research Ethics som undersøgelsen ville fremprovokere nogen sundhedsrisiko eller ville være til nogen byrde for deltagerne. Patientinformation blev anonymiseret og de-identificeret før analyse.

Alle patienter var blevet behandlet med perioperativ kemoterapi med cisplatin, epirubicine og capecitabin. Ikke alle patienter fik fuld dosis kemoterapi. En miRNA prædiktor profil, korreleret til behandling følsomhed i NCI60 af de tre kemoterapeutiske midler, blev udviklet. Baseline patient og tumor egenskaber er anført i tabel 1.

RNA isolering og kvantificering af miRNA

Total RNA blev ekstraheret fra fem på hinanden følgende lysbilleder af 12 um FFPE forbehandling tumor sektioner ved hjælp af RECOVERALL

™ Total Nucleic Acid Isolation Kit til FFPE (Ambion, Inc. 2130 Woodward St. Austin, TX) i overensstemmelse med producentens protokol. Verifikation af invasiv karcinom i hæmatoxylin og eosin farves FFPE slides blev udført af en erfaren patolog (TT). Den gennemsnitlige brøkdel af tumor område (defineret som arealet af invasive carcinom) blev estimeret til 57% (interval: 5-100). Kvantificering af totalt RNA blev udført under anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop Technology, Wilmington, Del). miRNA blev mærket ved hjælp FlashTag

™ HSR Biotin RNA Mærkning Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) og hybridiseret til GeneChip miRNA-version 1.0 mikroarrays (Affymetrix, Santa Clara, CA) i henhold til manufactorer detaljer. Arrays blev vasket og farvet på en Affymetrix Fluidik Station 450X og scannet på en Affymetrix G7 scanner ifølge producentens anvisninger. Normalisering af miRNA microarray data blev udført i R ved hjælp Robust Multi-matrix Average (RMA). Alle miRNA var målbare i alle 53 patient tumorprøver.

Predictor udvikling baseret på in vitro assay

For at vurdere sammenhængen mellem miRNA-ekspression og narkotika følsomhed, væksthæmning (GI50) vektorer af 60 celle linjer udsat for cisplatin, epirubicine og capecitabin blev hentet fra DTP hjemmeside. Sammenhæng mellem miRNA-ekspression og narkotika følsomhed blev beregnet for hver kombination miRNA-drug. MikroRNA’er med en korrelation over 0,25 (positivt korreleret miRNA) eller under -0,25 (negativt korreleret miRNA) blev godkendt til hver behandling (S1 tabel), og derefter kombineres for at forudsige respons på kombinationsbehandlingen. Derfor blev en miRNA respons profil udviklet i hvilket udtryk niveauer blev korreleret til følsomheden af ​​cisplatin, epirubicine og capecitabin.

Forudsigelse af kemo-følsomhed i kliniske prøver

Den normaliserede udtryk for hver miRNA i et svar profil blev anvendt til at forudsige følsomheden ved at dreje miRNA ekspressionsniveauer i en enkelt forudsigelse score. Derfor for hver patient, følsomhed over for den modtagne behandling strategi blev beregnet som forskellen mellem gennemsnittet af positivt korrelerede miRNA og gennemsnittet af negativt korrelerede miRNA: Prediction score = middelværdi (positivt korreleret miRNA) -mean (negativt korreleret miRNA). Hver miRNA i profilen fik lige stor vægt. Dernæst blev forudsigelse score normaliseret til en skala fra 0 til 100 ved en lineær transformation af forudsigelsen score på alle patientprøver; en score på nul betød mindst følsom og en score på 100 betød mest følsomme over for den givne behandling. For hver patient, blev en score på forudsagt følsomhed over for den modtagne behandling strategi beregnet.

Statistik

En statistisk analyse plan, med præ-specificerede succeskriterier, blev udført før indledningen af ​​undersøgelsen. De snesevis af behandling følsomhed for hver patient blev forudsagt før afblinding af de kliniske data. Det primære resultat var samlet overlevelse (OS), defineret som tidsperioden fra diagnose af gastroesofageal kræft til død uanset årsag eller sidste opfølgning (aug 11

th 2014) og den sekundære udfald sygdomsspecifikke overlevelse, defineret som tiden fra diagnose til død fra eller med gastroesoophageal kræft eller sidste dag i opfølgningen (aug 11

th 2014).

blev udført ved dichotomizing de forudsigelse scores ved hjælp af median score som Survival analyser et afskåret. Patienterne blev forudsagt følsomme ovenfor afskåret og modstandsdygtig under eller lig med afskåret. Overlevelse skøn blev beregnet efter den Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved hjælp af den univariate Cox proportional hazards model til at vurdere sammenhænge mellem forudsigelse scores og OS eller DSS. Antagelsen af ​​proportionale farer blev verificeret med log-minus-log plots og Schoenfeld s residualer. Multivariate analyser blev udført for at justere for faktorer af formodet prognostisk relevans. Hazard ratio (HR) for både uni- og multivariate analyser præsenteres på 3 år med 95% konfidensinterval (CI). Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af STATA, version 12 (StataCorp, College Station, TX, USA).

Resultater

Resultat analyse

Den mediane follow-up tid for alle patienter var 23 måneder (interval: 4-54 måneder) og 1- års OS sats var 79% (95% CI: 66-88), og den 3-årige OS rate 44% (95% CI: 30-58). På tidspunktet for evalueringen, havde 30 patienter (57%) døde, hvoraf 24 patienter var døde af primær cancer. Radiografisk respons blev observeret i 30 patienter (60%) blandt 50 patienter med tilgængelige evaluering behandling CT-scanninger. Ingen patienter opnåede patologisk komplet respons (defineret som ingen tegn på vitale resterende tumor tilbage i de resektion prøven efter neoadjuverende kemoterapi celler). Baseline patient og tumor egenskaber er anført i tabel 1.

associering mellem den forudsagte følsomhed og overlevelse

Brug af NCI60 cellelinje panel, følsomhed over for cisplatin, epirubicine og capecitabin var korreleret til baseline miRNA ekspression af 1756 humane miRNA og andre små nucleolar RNA’er i de samme cellelinier. Begge miRNA bliver positivt korreleret og negativt korreleret med hver af de tre kemoterapeutiske midler blev identificeret. I S1 tabel, der miRNA bruges til at forudsige respons på listen. Ved anvendelse af diagnostiske og præ-terapeutiske FFPE tumorprøver fra den undersøgte population, blev miRNA ekspressionsniveauerne målt. For at forudsige følsomheden blev miRNA ekspressionsniveauer af responset profil forvandlet til en enkelt forudsigelse score på en skala fra nul til 100 som tidligere beskrevet. En score på nul repræsenterede lav følsomhed og en score på 100 høj følsomhed

Når stratificeret efter median forudsigelse score, tendenser i retning af øget OS (HR: 0,53 (95% CI: 0,25-1,14)). Og DSS ( HR: 0,57 (95% CI: 0,24-1,34)) blev vist hos patienter med forudsigelse score over medianen. Kirurgi er hjørnestenen i denne behandling strategi og yderligere analyse af kun de patienter, der havde gennemgået kirurgisk resektion (N = 49) viste en signifikant forbedring af OS (HR: 0,41 (95% CI: 0,17-0,96)) og en borderline signifikant forbedret DSS (HR: 0,40 (95% CI: 0,15-1,08)). for patienter med forudsigelse score over median, fig 1.

Prediction scores dikotomiseret af median score

i en multivariat analyse, blev forudsigelsen score identificeret til at være en uafhængig prognostisk markør for både OS (HR: 0,37 (95% CI: 0,16-0,87)) og DSS (HR: 0,32 (0,12-0,87)) efter justering for kirurgi og fase, tabel 2.

diskussion

Gastroøsofageal kræftformer er maligniteter med dårlige responsrater til standard behandlingsregimer, hvilket resulterer i en 5-års samlet overlevelse på kun 15-25% [ ,,,0],7,8]. miRNA kan være potentielt anvendelige biomarkører for forudsigelse af respons på kemoterapeutiske midler. I denne undersøgelse blev en miRNA profil prædiktiv for følsomhed for cisplatin, epirubicine og capecitabin udviklet i 53 patienter med gastroøsofageal cancer. En univariat analyse, herunder kun patienter, som havde gennemgået kirurgisk resektion viste en statistisk signifikant forbedring af OS for patienter med forudsigelse score over afskåret. Derudover en multivariat analyse identificeret forudsigelsen score som uafhængigt korreleret med både OS og DSS. Denne lovende resultat er opmuntrende og en ny, større prospektive undersøgelse er nødvendig for at validere den potentielle kliniske anvendelighed af prædiktor.

Udviklingen af ​​miRNA prædiktor profilerne var baseret på en roman bioinformatiske tilgang, tidligere offentliggjort på diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) [9]. Brug af NCI60 panelet blev to miRNA profiler udviklet som ekspressionsniveauerne korrelerede med sensitivitet over for kombinationsbehandlinger CHOP (cyclophosphamid, doxorubicin, vincristin og prednison) og CHOEP (cyclophosphamid, doxorubicin, vincristin, etoposid og prednison). I denne undersøgelse, at miRNA profiler med held forudsagde respons på behandling af patienter med DLBCL.

Capecitabine er et prodrug, der omdannes enzymatisk til 5-fluorouracil i kroppen.

in vitro

afledte respons profiler for de to lægemidler har både overlapninger og forskelle. I denne undersøgelse anvendte vi den respektive

in vitro

profil for det respektive lægemiddel, der anvendes i klinikken.

Forudsigelse af respons på kombinationsbehandling blev udført ved at kombinere prædiktorer for individuelle lægemidler. For en vellykket forudsigelse af respons, blev profiler for cisplatin, epirubicine og capecitabin kombineres. Ved analyse af de enkelte prædiktorer i en multivariat analyse, de cisplatin og epirubicine prædiktorer bidraget mest, mens capecitabin prædiktor bidraget mindst (data ikke vist).

Terapi fiasko er almindeligt observeret i kliniske omgivelser på grund af enten iboende eller erhvervet resistens over for kemoterapi eller radioterapi. miRNA har vist sig at spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​narkotika og stråling følsomhed i gastroesofageal kræft. I kræft i spiserøret, Hamano et al rapporterede, at overekspression af miR-200C var signifikant korreleret med dårlig respons på cisplatin kemoterapi, eventuelt gennem opregulering af Akt-vejen (PPP2R1B) [10] og Tanaka et al viste, at høj præ behandlingsrelaterede ekspressionsniveauer af miR-200c i serum var signifikant associeret med nedsat respons på cisplatin kemoterapi [11]. I gastriske cancerceller imidlertid overekspression af MIR-200C er blevet korreleret med reduceret tumorvækst og migration [12] Ud over forøget cisplatin følsomhed [13]. Disse modstridende resultater indikerer de forskellige konsekvenser af miR-200c i forskellige typer kræft. I denne undersøgelse blev miR-200C inkluderet som prædiktor for respons på epirubicine (negativt korreleret).

Ligesom med miRNA respons profil med dette studie, adskillige andre undersøgelser har identificeret miRNA at være forbundet med kemoterapeutiske effekt i gastroesofageal cancer. For eksempel HSA-let-7c er vist at være associeret med prognose og til at være en markør for følsomhed over for cisplatin gennem regulering af IL-6 /STAT3 vej hos patienter med øsofageal cancer [14] og MIR-141 har været fundet at udøve anti-apoptotiske virkninger, som giver cisplatin resistens i øsofagus cancercellelinier, eventuelt gennem nedregulering af YAP1 [15]. I den foreliggende undersøgelse har-let-7c var negativt korreleret med capecitabin og MIR-141 var negativt korreleret med epirubicine. I en anden undersøgelse blev forbehandling MIR-505-stjerne og MIR-99b vist at være signifikant korreleret med patologisk respons hos patienter med øsofageal adenocarcinom [16]. I nærværende undersøgelse blev miR-505-star negativt korreleret med capecitabin og miR-99b negativt korreleret med capecitabin og epirubicine.

Som konklusion miRNA profil prædiktive for følsomhed over for cisplatin, epirubicine og capecitabin blev vist til være uafhængigt associeret med OS og DSS hos patienter med gastroøsofageal cancer. Denne lovende resultat er opmuntrende og en ny, større prospektive undersøgelse er berettiget for at validere den potentielle kliniske anvendelighed af prædiktor.

Støtte Information

S1 Table. Lister over microRNA for alle narkotika og kombination prædiktorer anvendes.

For hver behandling listen over Affymetrix probesets på miRNA version 1.0 matrix vises med deres Affymetrix ID. Probesets vist i romersk er positivt korreleret, probesets i kursiv er negativt korreleret. For kombinationsbehandlinger, er individuelle profiler kombineres

doi:. 10,1371 /journal.pone.0148070.s001

(DOCX)

anerkendelser

Forfatterne takker Mogens Jons Johannsen for fremragende teknisk assistance. Undersøgelsen blev støttet af Det Danske Cancer Society, cirro-Lundbeckfonden Center for interventionel forskning i Stråling Oncology og Det Danske Strategiske Forskningsråd, Karen A. Tolstrups Fond, AP Møller Fonden til fremme af Medical Science og Dansk Kraeftforsknings Fond.