PLoS ONE: antagonistiske virkning af en Spyt prolinrigt peptid på Cytosoliske Ca2 + Mobilisering induceret af progesteron i Oral Squamøs Cancer Cells

abstrakt

En spyt prolin-rige peptid 1932 Da viste en dosisafhængig antagonistiske virkning på den cytosoliske Ca

2+ mobilisering induceret af progesteron i en tunge pladecarcinom cellelinie. Struktur-aktivitets studier viste, at aktiviteten af ​​peptidet ligger i den C-terminale region med en prolin stretch flankeret af basiske rester. Endvidere manglende aktivitet af retro-inverso peptidanalog foreslog inddragelse af stereospecifikke anerkendelse. Massespektrometri-baserede shotgun analyse, kombineret med Western blotting tests og biokemiske data opnået med progesteron receptor Membrane Komponent 1 (PGRMC1) hæmmer AG205, viste stærke beviser for, at p1932 udfører sin modulerende handling gennem et samspil med progesteron receptor PGRMC1, som er overvejende udtrykt i denne cellelinie, og det er klart, spiller en rolle i progesteroninduceret Ca

2+ respons. Således er vores resultater peger på p1932 som en modulator af transduktion signalvejen medieret af dette protein, og da en veletableret inddragelse af PGRMC1 i tumorigenese, fremhæve en mulig terapeutisk potentiale p1932 til behandling af oral cancer.

Henvisning: Palmerini CA, Mazzoni M, Radicioni G, Marzano V, Granieri L, Iavarone F, et al. (2016) antagonistiske virkning af en Spyt Proline-Rich peptid på Cytosoliske Ca

2+ Mobilisering induceret af progesteron i Oral Pladecellekræft kræftceller. PLoS ONE 11 (1): e0147925. doi: 10,1371 /journal.pone.0147925

Redaktør: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA

Modtaget: April 27, 2015; Accepteret: 11 januar 2016; Udgivet: 27 Jan 2016

Copyright: © 2016 Palmerini et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret. Filerne vedrørende de udarbejdede massespektrometri resultater rapporteret i manuskriptet er bevaret i vore instrumenter optagelser

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Nando Peretti Foundation, katolske universitet i Rom, Cagliari Universitet, MIUR og regionen Sardinien i henhold til deres programmer for videnskabelig diffusion. Arbejdet blev også støttet af FaReBio dQ 2012 CNR projekt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Spyt er en blandet væske, der udskilles af de større og mindre spytkirtler placeret i mundhulen [1], og det udøver forskellige beskyttende og fordøjelsesfunktioner [2]. Disse funktioner er forbundet med spyt dynamisk sammensætning [3, 4] og af denne grund er der ydet en betydelig indsats for at definitionen af ​​spyt proteom [5] med mere end 2500 forskellige proteiner allerede blevet identificeret [6]. Disse kan inddeles i proteiner udskilt fra spytkirtler, som omfatter 400-500 komponenter svarende til ca. 90% af hele spyt proteom vægt, og proteiner fra andre kilder (mere end 2000), der indgår med mindre end 10%.

proteiner og peptider afledt af spytkirtel sekretion indbefatter muciner, a-amylaser, histatiner, statherin, PB peptid, s-cystatiner, lipaser, lipid transporter (lipocalin) og prolin-rige proteiner (PRPS), opdelt i sure (aPRPs), grundlæggende (bPRPs) og glykosyleret grundlæggende (gPRPs) [4]. Tildelingen af ​​specifikke funktioner til de forskellige komponenter og familier er krævende, sandsynligvis fordi hver familie udøver flere og integrerede funktioner, og fordi spytproteiner er tilfældigt spredt i opløsning [7-11].

bPRPs, udtrykket produkt af fire multi-allele loci navngivne PRB1-4, er en meget heterogen familie af peptider grund af omfattende polymorfier, alternative splejsning og post-translationelle modifikationer. Efter sekretion, er bPRPs delvist spaltes til mindre peptider der spænder fra 8 til 25 aminosyrerester med forskellige eksogene proteaser [12]. Disse peptider har ejendommelige primære sekvenser som ofte overlapper hinanden giver anledning til en bred række af lignende molekyler, i nogle tilfælde kun afviger med en rest.

Et af disse peptider (1932 Da, p1932) blev patenteret for dens stærk antiviral aktivitet [PCT /IB2012 /050.415] og blev for nylig fundet at internaliseres inden mundslimhinden celler [13]. Adskillige eksperimenter udført for at vurdere biologiske virkninger af peptidet dokumenteret dets indflydelse på calcium homeostase i celler. Gradueringen af ​​cytosole Ca

2 + koncentration ([Ca

2 +]

c) er en vigtig begivenhed, der indtræffer i en celle, da Ca

2+ koncentration medierer mange biologiske begivenheder, såsom celledeling , differentiering, metabolisme, muskelsammentrækning, apoptose og immunrespons [14], samt exocytose af synaptiske vesikler i frigivelsen af ​​neurotransmittere [15].

Calcium homeostase i pattedyrceller er et komplekst fænomen og resultater fra ligevægten mellem endoplasmatisk reticulum calcium butikker og ion udvekslinger med det ekstracellulære medium. Progesteron, gennem genomiske og ikke-genomiske effekter, spiller en vigtig rolle i udvikling, vækst og vedligeholdelse af kvindelige reproduktive væv. Desuden kan det hormon påvirke fysiologien af ​​hjernen og nervesystemet, baseret på dets funktion som et neurosteroid påvirker celleoverlevelse og vækst [16, 17]. Modulering af calciumhomeostase fremmes af progesteron er generelt reguleret gennem ikke-genomiske mekanismer, som involverer forskellige typer af receptorer af progesteron [18, 19]. Interessant skal det bemærkes, at hormonet er til stede i spyt i en fri form [20].

Her beskriver vi, at p1932 har en antagonistisk virkning på cytosoliske Ca

2+ mobilisering induceret af progesteron i en human planocellulært tungen carcinom cellelinje (PE /CA-PJ15). Desuden giver vi stærke beviser for, at modulerende rolle p1932 er aktiveret via PGRMC1 receptoren, som vist ved sammenlignende protein ekspressionsundersøgelser og biokemiske undersøgelser udført i nærvær af AG-205, en specifik inhibitor af PGRMC1 anvendt alene og i kombination med p1932 . Disse resultater, fremhæve nye perspektiver i løbet af de funktionelle konsekvenser af spyt prolinrige peptider i kræft celle systemer udsat for specifikke kønshormoner.

Materialer og Metoder

Kemi

fosfatbuffer saltvand (PBS) og trypsin-EDTA er produkter af EuroClone (Padua, Italien). Føtalt kalveserum (FCS), antibiotika (penicillin og streptomycin), L-glutamin, Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), Iscoves Modificeret Dulbeccos Medium (IMDM), Fura 2-AM (Fura 2-acetoxy-methyl-ester), dimethylsulfoxid (DMSO), KCI, MgCl

2, glucose, Hepes, NaCl, CaCI

2, EGTA (ethylen glicol-bis (2-amino-ethylether) -N, N, N ‘, N’-tetra -eddikesyre), progesteron (P4), deoxycholsyre, Nonidet P-40 (NP-40), EDTA (2 – ({2 [bis (carboxymethyl) amino] ethyl} (carboxymethyl) amino) eddikesyre), Tween- 20 og AG-205, blev købt fra Sigma (Milano, Italien).

Peptider syntese

p1932, RI-p1932 og fragmenter F (MER 1-8), C (MER 1- 17des Pro), E (MER 1-11), B (MER 1-17) og D (MER 12-20) blev samlet på et Applied Biosystem 433A Peptide Synthesizer (Foster City, CA, USA) på en forudindlæst prolin-2 -chlorotrityl harpiks (Novabiochem, Läufelfingen, CH) efter Fmoc- (Na-9-fluorenylmethyloxycarbonyl) protokol for trinvis fastfasepeptidsyntese [21]. Fmoc-aminosyrer var fra Novabiochem

Alle koblinger blev udført med 5 gange overskud af aktiveret aminosyre i nærværelse af 10 ækvivalenter N-ethyldiisopropyl amin, under anvendelse af N -. [(Dimethylamino) -1-H- 1, 2, 3-triazole- [4, 5-β] pyridin-1-ylmethylen] -N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxid (HATU, PE Biosystems, Inc., Warrington, UK) som aktiveringsmiddel for carboxygruppen. Ved slutningen af ​​peptidkæden samling blev peptidet spaltet fra harpiksen ved behandling med en blanding af 80% trifluoreddikesyre, 5% vand, 5% phenol, 5% thioanisol, 2,5% ethandithiol og 2,5% triisopropylsilan i 3 timer (rum temperatur), med samtidig sidekædeafbeskyttelse. Efter filtrering af harpiksen blev peptidet præcipiteret i kold tert-butylmethylether. Efter centrifugering og vask med tert.butylmethylether peptidet blev suspenderet i 5% vandig eddikesyre og lyofiliseres. Analytisk og semipræparativ omvendt fase højtryksvæskekromatografi (RP-HPLC) blev udført på en Tri Rotar-VI HPLC-system udstyret med en MD-910 multikanal detektor til analytiske formål eller med en Uvidec-100-VI variabel UV-detektor for præparativ formål (alle fra JASCO, Tokyo, Japan). Analytisk RP-HPLC blev udført på en Jupiter 5 um C18, 300 Å søjle (150 x 4,6 mm, Phenomenex, Torrance CA, USA). Semipræparativ RP-HPLC blev udført en Jupiter 10 um C18 300 Å (250 x 21,2 mm, Phenomenex, Torrance CA, USA). Lineære gradienter af acetonitril i vandig 0,1% TFA (vol /vol) blev anvendt til at eluere bundet peptid. MALDI-TOF massespektrometrianalyse blev udført på en Autoflex arbejdsstation (Bruker Daltonics, Bremen, DE) bekræfter den teoretiske masse af peptidet.

Humant PE /CA-PJ15 cellelinie

PE /CA-PJ15 celler (ECACC, 96121230, Porton Down, UK) [22], blev dyrket (37 ° C, 5% CO

2) i IMDM-medium indeholdende 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin (100 U /ml hver ), suppleret med 10% inaktiveret FCS. Cellerne blev subdyrket hver fjerde dag forud for at blive fuldt sammenflydende.

Bestemmelse af cytosolisk koncentration af Ca

2+

FURA-02:00 (2 pi af en 2 mM opløsning i DMSO) blev tilsat til 1 ml PE /CA-PJ15 suspensioner (ca. 10 x 10

6 celler) opnået efter 0,05% trypsin behandling og inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C, i mørke. Celler blev derefter høstet ved centrifugering ved 800 gx 10 minutter og til slut suspenderet i HBSS-buffer pH 7,4 (140 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1 mM MgCl

2, 1 mM CaCI

2, 5 mM glucose, 25 mM Hepes, indstillet til pH 7,4) til en endelig cellekoncentration på 1 x 10

6 /mL. Salg

en portion af denne suspension (1 ml) blev derefter centrifugeret ved 800 g x 5 minutter, hvorefter cellerne blev høstet og suspenderet i 3 ml calcium-frit HBSS pH 7,4 (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl

2, 5 mM glucose, 25 mM HEPES, 0,1 mM EGTA) før fluorimetriske målinger. Fluorescens blev målt med et Perkin-Elmer LS 50 B spectrophotofluorimeter udstyret med en dobbelt magnetiseringssystem (ex. 360 og 380 nm, em. 510 nm). Spalte bredder blev sat til 1,5 nm for excitation og 3 nm for emission. Cytosolisk calcium koncentrationer ([Ca

2 +] c blev beregnet som rapporteret [23].

proteomiske analyse af progestin-receptorer i PJ15 celler

Protein ekstrakter blev opnået ved cellelysis med 50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% deoxycholsyre, 0,1% SDS, 1% NP-40, 1 mM EDTA, pH 8 suppleret med proteaseinhibitorer (RIPA-buffer). Proteiner blev separeret på SDS-polyacrylamidgel og, efter kolloidt Coomassie brilliant blue-farvning, blev gel bånd af interesse udskåret, affarvet med 25 mM NH

4HCO

3 /ACN 1: 1 (v /v), dehydreret med 100% ACN, reduceret med 10 mM DTT i 25 mM NH

4HCO

3 og alkyleret med 55 mM IAA i 25 mM NH

4HCO

3. Efter fuldstændig dehydrering, en opløsning af 0,02 ug /uL trypsin i 25 mM NH

4HCO

3 blev tilsat, og proteiner blev spaltet ved 37 ° C natten over. reaktionen blev standset ved tilsætning af TFA ved slutkoncentration på 0,1%. supernatanterne indeholdende tryptiske peptider blev opsamlet sammen med peptidfragmenter ekstraheret fra gelen med 100% ACN /0.1% TFA i vand 3: 2 (v /v). Tryptiske peptider blev analyseret ved væskekromatografi-elektrosprayionisering-tandem-massespektrometri (LC-ESI-MS /MS) på en Ultimate 3000 Micro HPLC-apparatet (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) udstyret med en FLM-3000-Flow administratormodulet direkte koblet til en LTQ Orbitrap XL hybrid FT massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Omvendt fase-kromatografi blev udført på en Jupiter C18, 5 um, 300 Å, 150 x 1,0 mm søjle (Phenomenex, Torrance, CA, USA) og en 95 min run (gradient 1.6 til 44% acetonitril i vand med 0,1% myresyre over 60 min) ved en strømningshastighed på 80 pl /min. Massespektrometriske målinger blev udført i positiv ion-mode med en kapillær temperatur på 250 ° C, en kappe gasstrøm på 40 vilkårlige helheder, en kilde spænding på 3,6 kV og en kapillær spænding på 48 V. Massespektre blev opsamlet i FT-IT data scanning afhængig (MS scanne ved 60000 af opløsning i Orbitrap og MS /MS scanning på de tre mest intense toppe i ion trap). Protein identifikationer blev opnået med den integrerede ion regnskabsmæssige algoritme (SEQUEST HT) af softwaren Proteome Discoverer (version 1.4, Thermo) og søge en menneskelig database (UniProtKB /Swiss-Prot Protein Vidensbase Slip 2013_09 af 18-Sep-13 indeholder 540.958 sekvens firmaer, taksonomiske restriktioner: Homo sapiens, 20271 sekvens firmaer). De søgeparametre var 10 ppm tolerance for prækursorer ioner og 0,8 Da for produkt-ioner, en savnet spaltning, carbamydomethylation af cystein som fast modifikation, oxidation af methionin som variabel modifikation og falsk positiv rate under 5% beregnet på en lokkedue databasesøgning.

progestinreceptoren western blotting

Protein koncentrationen af ​​cellelysat blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Plasmamembraner blev fremstillet som tidligere beskrevet [24] med mindre modifikationer. Celler blev homogeniseret i iskold homogeniseringsbuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA) indeholdende 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) ved Dounce homogenisator (30 slag). Homogenatet blev centrifugeret i 10 min ved 2000 g og 4 ° C, efterfulgt af centrifugering af supernatanten ved 100.000 g i 1 time ved 4 ° C for at pelletere plasmamembraner, der blev resuspenderet i lysepuffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0 , 1 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM DTT, og protease inhibitor cocktail). Proteinet kvantificering blev udført under anvendelse af en 2-D Quant Kit proteinassaykit (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Proteiner blev indlæst og separeret på SDS-polyacrylamidgeler, og overført til nitrocellulosemembraner. Blots blev blokeret i en blokeringsopløsning (PBS, 0,1% Tween-20, 5% (w /v) fedtfri tørmælk) og inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende muse monoklonale primære antistoffer: anti-PGRMC1 (klon C-3 , Santa Cruz, CA, USA), anti-nPR (klon 2C11F11, Santa Cruz), anti-mPRα (klon H-76, Santa Cruz) og anti-β-Actin (Clone AC-15, Sigma). Membraner blev vasket ekstensivt og efter inkubation med peberrodsperoxidase (HRP) -mærket gede-anti-muse eller anti-kanin-antistof (Santa Cruz) fremkaldt med ECL plus kemiluminescens påvisningssystem (GE Healthcare, UK).

Statistiske analyser

Alle værdier er angivet som gennemsnit ± SEM (n) og signifikante niveauer blandt grupper blev vurderet af ANOVA og post-hoc Scheffé test. P-værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater og Diskussion

antagonistisk effekt af p1932 peptid på P4 effekt

Den patenterede peptid p1932 (NH

2

1GPPPQGGNK

10PQGPPPPGKPQ-PCT /IB2012 /050.415) er et fragment stammer fra den proteolytiske behandling af prolin-rige proteiner PRB1-L (UniProt /Swiss-Prot, P0428), PRB-2 (P02812), PRB1- M (Q86YA1) og PRB2 (Q7M4Q5) [4]. Sekvensen af ​​p1932 gentages fire gange i PRP1-L og PRB2, og tre gange i PRB1-M, hvilket bringer den gennemsnitlige koncentration i humant spyt omkring 5-10 uM. Ikke desto mindre, som for mange andre spyt peptider, den præcise rolle p1932 i oral fysiologi og patologi er i øjeblikket ukendt. I et nyligt papir har vi oplyst evne p1932 skal internaliseres inden cellerne i mundslimhinden i en tid bortfald af få minutter øvrigt demonstrerede vi manglen på cytotoksicitet selv ved koncentrationer langt over dem, der findes i spyt for dette peptid [13] .

i dette arbejde viser vi for første gang den dosisafhængige effekt af p1932 på modulationen af ​​cytosolisk calcium frigivelse fremmes af progesteron i PE /CA-PJ15 cellelinje.

Disse celler, der kan betragtes en model af den menneskelige oral carcinom celler [25], blev med vilje valgt at undersøge de mulige konsekvenser af p1932 i tilstedeværelse af progesteronreceptorer tidligere forbundet med prognostisk betydning over hovedet-og halscancer [26].

effekten af ​​P4 på PE /CA-PJ15 celler blev undersøgt ved at anvende hormonet under to forskellige koncentrationer (5 og 10 um) for at undersøge mulige dosisrelaterede virkninger. Progesteron (P4) behandling af celler blev udført i fravær af ekstracellulært calcium, som tidligere blev fjernet med 0,1 mM EGTA 0,1 mM. Efter få sekunder upon P4 behandling, en stigning på [Ca

2 +]

c kunne observeres ved begge koncentrationer (figur 1). En sådan hurtig stigning antyder en hurtig ikke-genomisk effekt af P4 [27], der kan være medieret af forskellige klasser af progesteronreceptorer, såsom den klassiske nukleare progesteronreceptor (nPr) i sin monomere form (nPR-A), progesteron receptor membranbestanddele 1 (PGRMC1), og membranen progesteronreceptoren mPR [28].

figuren viser resultatet af et typisk eksperiment. Celler blev suspenderet i HBSS-buffer uden calcium. Efter 250 sekunder calcium blev tilsat for at nå en koncentration på 1 mM. Forsøget blev gentaget 10 gange, og en lignende opførsel blev altid observeret. Indsat: Maksimal stigning af [Ca

2+] c, rapporteret som Δ [Ca

2 +] c, efter tilsætning af stigende mængder af progesteron. De viste resultater svarer til middelværdier ± SEM for 10 forsøg. ANOVA. Virkninger på grund progesteron i fravær af calcium: p 0,0001, og i nærvær af 1 mM calcium: ikke signifikant (ikke vist i det indsatte). Post-hoc: Scheffe test på p-niveau 0,05. Stjernerne vist statistisk signifikans.

[Ca

2 +]

c stigning var afhængig af progesteron koncentrationen, og i det indsatte i figur 1 virkningerne af P4 på [Ca

2 +]

c er rapporteret som Δ [Ca

2 +]

c (nM). Statistisk analyse bekræftede virkningen af ​​stigende doser af progesteron på [Ca

2 +]

ci calcium-fri betingelser (p 0,0001). Når 1 mM Ca

2+ blev tilsat til mediet, en yderligere stigning af [Ca

2 +]

c blev observeret (figur 1), både i fravær og i nærvær af progesteron, i retning af 42 ± 3 nM (gennemsnit af 10 målinger ± SEM). Dette resultat indikerer, at [Ca

2 +]

c ændringer efter P4 stimulus er primært afhængig af frigivelsen af ​​Ca

2+ fra intracellulære lagre, efter aftale med tidligere resultater [29]. I denne henseende det lineære forhold observeret mellem [Ca

2 +]

c stigning og P4 dosis er sandsynligvis tegn på en direkte indvirkning, således udelukker uspecifikke virkninger af P4 på cellemembranerne, der i sidste ende ville føre til intracellulære calcium stiger [30]. I de følgende eksperimenter p1932 peptid blev anvendt ved en lavere koncentration (1700 nM) i forhold til den, der findes i spyt (5-10 uM), idet der i betragtning, at i fysiologiske betingelser ikke alle spyt brøkdel af p1932 peptid er i kontakt med slimhindeceller samtidig.

spyt peptid p1932 alene (1700 nM) havde ingen effekt på [Ca

2 +]

ci PE /CA-PJ15 celler, enten i fravær eller i overværelse af Ca

2+ i mediet. Men når det tilsættes 2 minutter før P4 behandling i calcium-fri betingelser, p1932 fuldstændigt standset virkningen af ​​progesteron virkninger (både ved 5 og 10 uM koncentrationer) (figur 2, indsat). Derudover observerede vi en dosisafhængig virkning, når p1932 spyt peptid blev testet ved forskellige koncentrationer i 17-1700 nM (Fig 3). Især blev det ved progesteron-medierede inhibitoriske virkninger (5-10 uM) effektivt lineær op til den højeste koncentration (1700 nM) af peptid anvendes.

Figuren viser resultatet af et typisk eksperiment. Celler blev suspenderet i HBSS-buffer uden calcium. Peptid (1700 nM) blev føjede to minut før progesteron (10 uM). Efter 250 s calcium blev tilsat for at nå en koncentration på 1 mM. Indsat: Maksimal stigning på [Ca

2 +]

c, rapporteret som Δ [Ca

2 +]

c, efter tilsætning af stigende mængder af progesteron. De viste resultater svarer til middelværdier ± SEM for 10 eksperimenter ANOVA. Virkninger på grund progesteron i fravær af calcium: p 0,0001 og i nærvær af 1 mM calcium: ikke signifikant (ikke vist i indsat).

Post-hoc

: Scheffe test på p-niveau 0,05. Stjernerne vist statistisk signifikans.

Efter 120 sekunder efter tilsætning af peptidet (17-1700 nM), progesteron (10 uM [sorte firkanter] eller 5 uM [hvide firkanter]) blev også dispenseret . Data (rapporteret som Δ [Ca

2 +] c) rapporterer midler ± SEM af 10 eksperimenter ANOVA. Virkninger af progesteron: p 0,001 og peptidkoncentration: p. 0,001

For at fastslå de minimale strukturelle krav til at udtrykke den antagonistiske effekt, vi syntetiseret forskellige fragmenter af p1932, og udførte eksperimenter på 1700 nM at undersøge forholdet mellem fragmentsekvenser og biologisk aktivitet. Fragmenter C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11), og F (MER 1-8) viste en betydelig lavere antagoniserende aktivitet sammenlignet med det intakte peptid (figur 4). Omvendt fragment B (MER 1-17), og fragmentet D (MER 12-20), resulterede så aktive som p1932 peptid. Interessant nok MER 1-17 des Pro fragment, som mangler en prolinrest, havde ingen inhibitorisk virkning tyder på en høj grad af specificitet med den formodede molekylære mål af p1932 [31]. Endelig er den retro-inverso (RI) form for p1932, når de testes i løbet af 17-1700 nM koncentrationsområde, viste ingen antagonistisk effekt (data ikke vist), hvilket tyder på at inddrage et stereo-specifik mekanisme for anerkendelse. Disse resultater fremhæver associeringen af ​​C-terminale del af peptidet, der indeholder den 12-GPPPPGKPQ-20 prolin-rige sekvens, med fuld inhibitorisk virkning på [Ca

2 +]

c stigning.

Efter tilsætning af enten peptid eller dets fragmenter ved forskellige koncentrationer (fra 17 til 1700 nM), blev 5 uM progesteron også tilføjet til calcium-frit vævsdyrkningsmedium. Data (rapporteret som Δ [Ca

2 +] c), rapporterer de midler ± SEM af 10 forsøg. ANOVA: Effekter af peptid: p 0,001 og koncentration: p 0,001. Post-hoc: (scheffée p = 0,05). Homogene peptid delmængder: 1. A (p1932), B (MER 1-17) og D (MER 12-20); 2. C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11) og F (MER 1-8).

Analyse af progesteronreceptorer

proteomiske analyse af PJ15 celler blev udført for at påvise tilstedeværelsen af ​​de tre klasser af formodede progestinreceptorer beskrevet i litteraturen: nPR, PGRMC1, og mPRα. Efter cellelyse blev proteiner separeret ved SDS-PAGE, hvorefter og proteinerne med masserne i 21, 40 og 100 kDa intervaller blev analyseret ved LC-ESI-MS /MS. Under disse betingelser, vi kun identificeret PGRMC1 (tabel 1) (21 kDa) i dobbelte eksperimenter. PGRMC1, mPRα og nPR udtryk blev også vurderet ved Western blotting-analyse, som bekræftede, at PGRMC1 er den største progesteron receptor udtrykt i PE /CA PJ15 celler. Western blots afslørede også mPRα, men i mindre grad i forhold til PGRMC1 (figur 5), hvilket således bekræfter tidligere co-immunfældningsforsøg vurderinger tyder på, at, sandsynligvis, PGRMC1 og mPRα funktionelt hører sammen [32]. Omvendt blev nPR receptoren ikke identificeret efter aftale med data fra Lukits og coll. opnået med den samme cellelinje (tabel 1 og figur 5) [26]

Listed er følgende protein parametre:. alfanumeriske unikt protein sekvens id (tiltrædelse), protein identifikator tegn med en navngivningskonvention (indtastning navn) , Gene navn og protein navn (beskrivelse), som UniProtKB protein vidensbase; den beregnede molekylvægt af proteinet i kilo-Dalton-enheder (MW), den teoretisk beregnede isoelektriske punkt (pI cal.) og proteinet antal aminosyrer (# AAS); proteinidentifikation s SEQUEST HT Score; procentdel af proteinsekvens omfattet af identificerede peptider (COV); antal peptider unikke for proteinet (# Unique Peptider); antallet af de identificerede peptider matchende til proteinet (# Peptider); samlede antal identificerede peptidsekvenser (peptid spektrum matcher) (# PSM’er) opnået ved to forskellige forsøg (Exp 1 og Exp 2). I tabellen er angivet de PGRMC1 peptiderne følgende parametre: den identificerede amino sure peptidsekvens; Oplad tilstand af prækursor-ion; den teoretiske protonerede monoisotopisk peptidmasse, i dalton (MH +); masse-til-ladningsforhold (m /z) af precursor ion, i dalton; forskellen mellem den teoretiske masse af peptidet og den eksperimentelle masse af prækursor-ion i ppm (AM); retentionstid af precursor ion, i minutter (R.T.); den SEQUEST HT krydskorrelation score for alle kandidatlande peptider forespørges fra databasen (Xcorr); antal Mistede spaltninger.

PGRMC1 blev NPR og mPRα proteiner niveauer afsløret med specifikke antistoffer i PE /CA PJ15 cellulære ekstrakter opnået lysere celler med RIPA buffer. Blot anti mPRα udførtes også på membranpræparat. Proteiner uddrag fra HepG2 og MCF7-celler blev analyseret som positive kontroller (PGRMC1: 21,67 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/O00264; nPR: 82,29 kDa isoform A, 98,98 kDa isoform B, http: //www. uniprot.org/uniprot/P06401; mPRα: 39.72 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/Q86WK9). Lige protein belastning (50 ug) blev bekræftet ved β-actin udtryk.

På grund af den høj ekspression af PGRMC1 i PE /CA PJ15 celler, vi ønskede at fastslå sin rolle i [Ca

2+] c stige efter progesteron stimulus ved anvendelse af den specifikke inhibitor AG-205 alene og i kombination med p1932. AG-205 er kendt for at binde til hæm-bindende site af dette protein således modificere dets spektroskopiske egenskaber og funktioner [33]. Den PGRMC1 inhibitoren AG 205 (0,01-1,0 uM) eller p1932 peptid (0,01-1,0 uM), blev indført i inkubationsmediet 50 sekunder før progesteron (5 eller 10 uM). I nærvær af AG-205 eller p1932 peptid virkningen af ​​P4 (5-10 uM) på Δ [Ca

2 +] c var statistisk inhiberet på en dosisafhængig måde, således efterligne virkningen af ​​p1932 (fig 6a) . Derefter blev AG-205 (0,01-1,0 uM) og p1932 peptid (0,01-1,0 uM) tilsat samtidigt i mediet 50 sekunder før progesteron. Kombinationen af ​​de to stoffer på de samme doser, førte til en inhiberende virkning højere på progesteron aktivitet, end der blev observeret for den enkelte AG-205 eller p1932 peptid alene, hvilket indikerer en additiv virkning af de to molekyler (Fig 6B).

forsøgene blev udført på PE /CA PJ15 mærket med FURA-02:00. Efter 50 sekunder i inkubationsmediet, P4 (5 um, Fig 6A; 10 pM, figur 6B) blev tilsat, og stigningen i cytosolisk calcium som A [Ca

2+] c målt. Den PGRMC1 inhibitor AG 205 (0,01-1,0 uM) og /eller p1932 peptid (0,01-1,0 uM), blev tilføjet i de mellemstore 50 sekunder før 5 eller 10 uM progesteron. I nærvær af AG205 eller p1932 peptid, virkningen af ​​P4 (5-10 uM) på Δ [Ca

2 +] c var statistisk inhiberet på en dosisafhængig måde. Når AG 205 (0,01-1,0 uM) og p1932 peptid (0,01-1,0 uM) blev tilsat i kombination, den observerede inhiberende virkning var højere end i prøver behandlet med hvert middel alene. Hver data svarer til gennemsnittet ± SEM af seks uafhængige målinger.

PGRMC1 receptor indeholder et N-terminalt transmembrane domæne (72-135 aa) og en cyt-b5 eller hæm /steroid-bindende domæne [ ,,,0],34]; lignende funktioner er delt med sin homolog PGRMC2. Begge proteiner udtrykkes i forskellige humane væv, herunder hjerte, lever, og placenta [35], og overudtrykkes i mange cancer celletyper [36-38]. PGRMC1 binder P4 med moderat affinitet og medierer P4 antimitotisk og anti-apoptotisk virkning. Det er lokaliseret til plasmamembranen, cytoplasmaet og nukleare membraner, hvilket forklarer dets potentielle involvering i hurtige ikke-genomiske progesteron signaler. For nylig PGRMC1 fandtes at være strengt korreleret til Sigma-2-receptorer [39], på trods af nogle kontroversielle resultater [40].

MPR (MW 40 kDa) blev først isoleret i havørred [41] og er repræsenteret med mindst fem undertyper dvs α, β, γ, δ, og ε nøje knyttet til gestagen og adiponectin-Q-receptor (PAQR) familie [42]. Deres effektive tilstedeværelse og naturen som progestin-receptorer er blevet etableret efter års debat [43]. Disse receptorer har høj affinitet for P4 (Kd 5 nM) og kan mediere hurtige svar som værende direkte koblet til G-proteiner [32, 44]. Både PGRMC1 og mPRα receptorer er i stand til hurtigt at reagere på en P4 stimulus, og dermed bestemme en stigning på [Ca

2 +]

c fra endoplasmatiske butikker [45, 46]. I betragtning af, hvordan disse proteiner spiller sammen [30], er det muligt, at de repræsenterer de molekylære mål for p1932.

De strukturelle træk ved p1932 tyder stærkt på dette peptid som en potentiel interactor af Proline-Rich Recognition domæner (fattigdomsbetingede sygdomme) og især af de SH3 domæner [46, 47]. For at opnå bindingen mellem en prolin-rig sekvens og en SH3 domæne, skal en -PxxP- kerne være til stede i liganden sekvens. Desuden er en basisk rest flankerer -PxxP- kerne er vigtige ved fastlæggelse af interaktionen specificitetsbestemmende to typer af kanoniske konsensussekvenser: klasse I -PxxPxx (R /K) og klasse II – (R /K) xPxxP- [48 ]. Tilstedeværelsen af ​​tre -PxxP- konsensus kerner, foruden tilstedeværelsen af ​​et klasse-II motiv i den C-terminale område af p1932 (NH

2-

1GPPPQGGNKP

10QGPPPPGKPQ), hvori bor den hæmmende aktivitet, kraftigt støtte vores hypotese, at p1932 kan målrette SH3 domæner. NPR er kendt for at interagere med c-Src-kinase er SH3 domæne gennem sin prolin-rig region [49], men manglen på denne receptor i PJ15 celler, som et resultat af den proteomisk og western-blot-analyser, regler-out denne mekanisme. PGRMC1 receptoren i stedet højt udtrykt i denne cellelinie, hvilket tyder det er selve receptoren reagerer på P4 stimuli i PJ15 celler. Den transmembrane region af PGRMC1 besidder en formodet SH3 target konsensussekvenser for CRK /Grb2 /Abl og Src kinaser mens hæm-bindende domæne indeholder konsensussekvens for Lck /Abl-P typen tyrosinkinaser og for ERK1 [47], som også forudsagt af