PLoS ONE: Gp78, en E3 ubiquitinligase Fungerer som en Gatekeeper Undertrykkende alkoholiske steatohepatitis (NASH) og leverkræft

Abstrakt

Ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH) er relateret til metabolisk dysregulering og den forstyrrelse af endoplasmatisk reticulum (ER) homeostase, der ofte udvikler sig til hepatocellulært carcinom (HCC). Gp78 er E3 ligase, der regulerer endoplasmatisk reticulum-associeret nedbrydning (ERAD) ved ubiquitinylation af fejlfoldede ER proteiner. Her rapporterer vi, at ved ældning (12 måneder), gp78

– /- mus udviklede fedme, den gentog aldersrelateret human NASH. Lever histologi af gp78

– /- mus afslørede typiske steatose, hepatisk inflammation og fibrose, efterfulgt af progression til hepatocellulære tumorer. Akut ER stress viste, at tab af gp78 resultater i op regulering af udfoldet protein respons (UPR) veje og SREBP-1 regulerende

de novo

lipogenese, ansvarlig for fedtlever. Vævsarray af humant hepatocellulært carcinom (HCC) viste, at ekspressionen af ​​gp78 omvendt var korreleret med kliniske kvaliteter af kræft. Her har vi beskrevet dannelsen af ​​den første prækliniske forsøgsmodel, som spontant udvikler aldersrelateret NASH og HCC, der forbinder ERAD at hepatosteatosis, skrumpelever og kræft. Det tyder på, at gp78 er en regulator af normal lever homeostase og en tumor suppressor i human lever

Henvisning:. Zhang T, Kho DH, Wang Y, Harazono Y, Nakajima K, Xie Y, et al. (2015) Gp78, en E3 ubiquitinligase Fungerer som en Gatekeeper Undertrykkende alkoholiske steatohepatitis (NASH) og leverkræft. PLoS ONE 10 (3): e0118448. doi: 10,1371 /journal.pone.0118448

Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 3, 2014 Accepteret: 16 januar 2015; Udgivet: 19 Mar 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

Ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD) er den mest fremherskende hepatisk manifestation af det metaboliske syndrom og er en sygdom med flere karakteristika, herunder simpel steatose og ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH). NASH er kendetegnet ved overskydende fedt i leveren, betændelse, skade og fibrose, som kan udvikle sig til cirrhose og hepatocellulært carcinom (HCC) [1,2]. Steatose er defineret som tilstedeværelsen af ​​hepatisk triglycerid (TG) dråber i mere end 5% af hepatocytter [2]. Dette scenario fra NASH til kræft er ikke endeligt fastlagt, selv om de tidligere musemodeller blev skabt for at rekapitulere funktioner i en menneskelig sygdom kontinuum [2,3]. I molekylære mekanismer bag NAFLD, har det endoplasmatiske reticulum (ER) stressrespons nylig blevet foreslået at spille en afgørende rolle [4,5]. Det endoplasmatiske reticulum (ER) er et membranøs netværk ansvarlig for syntese, modning, og protein sortering til plasmamembranen eller ekstracellulær

milieu

[6]. Udfoldet protein reaktion (UPR) aktiveres til at klare patofysiologiske midler eller betingelser for at fremkalde ER stress ved at reducere proteinsyntese, lette proteinnedbrydning, og stigende produktion af chaperoner og foldases som guider spirende eller fejlfoldet protein til at folde korrekt [7]. Tre større arme UPR er evolutionært konserveret fra gær til metazoans og fungere som proksimale sensorer ER stress, som er membranspændende proteiner, herunder aktiverende transskriptionsfaktor 6 (ATF6), inositol-krævende enzym 1 (IRE1), og dobbeltstrenget RNA -aktiverede proteinkinase-lignende ER kinase (PERK) [7]. Hvis forkert foldede proteiner ikke funktionelt løst, er de translokeres fra det endoplasmatiske reticulum (ER) til cytosolen, hvor de nedbrydes af ubiquitin-proteasom maskiner, kendt som ER-associeret nedbrydning (ERAD) [8,9]. Imidlertid, forsinket eller utilstrækkelig UPR kan vise fysiologisk homeostase til patofysiologiske resultater, herunder fedtophobning, inflammation, fibrose og apoptose, systemisk fører til kroniske metaboliske sygdomme, såsom fedme, insulinresistens, og type 2-diabetes [6]. Sammenkædning af UPR veje til forebyggelse af steatose er blevet belyst i knockout-mus, der er afbrudt af en enkelt UPR sensor arm eller direkte downstream gen, hvilket fører til leversteatose såsom knockout mus af ATF6α, lever specifik Ire1αand GRP78 chaperone [10]. Mekanismerne bag ER stress-induceret steatose omfatter aktivering af sterol regulatoriske element-bindende proteiner (SREBPs); transkriptionsfaktorer involveret i

de novo

lipid biosyntese. Forhøjet SREBP-1c korrelerer med leversteatose i humane NAFLD patienter [11]. Under langvarig stress, blev rollen som C /EBP homologt protein (CHOP) i ER stress-induceret apoptose illustreret i Chop

– /- mus, hvor CHOP-mangel giver partiel resistens til ER stress-induceret apoptose [12]. Bidraget fra UPR mangel og langvarig ER stress til patogenesen af ​​HCC er blevet belyst i kemiske kræftfremkaldende-induceret CHOP knockout-mus og induktion af CHOP ofte observeret i transposonbaserede-induceret levertumorer [13].

ERAD er ofte betragtet som en konstitutiv proces på grund af de sporadiske fejl, der kan forekomme under syntesen og foldning af proteiner. Det regulerer også omsætningen af ​​visse foldede proteiner regulerer stofskiftet [14]. It par med UPR ved at fjerne fejlfoldede proteiner og af denne grund, gener af ERAD maskiner er opreguleret ved ER stress og UPR veje [15]. Genetisk ablation af en række ERAD komponenter fører til embryonal letalitet hos mus af Hrd1 /synoviolin E3 ligase og p97 (VCP /CDC48) ATPase [16,17], som fremhæver den funktionelle nødvendighed ERAD. Således er mangel på ERAD foreslået at kulminere i ophobning af fejlfoldede proteiner i lumen og membran af ER, en tilstand kendt som kronisk ER stress, som er fælles for flere sygdomme [18].

gp78 var ved først identificeret som en receptor for autokrin motilitet faktor (AMFR) og blev efterfølgende karakteriseret som et RING-afhængig og eR membranforankret E3 ligase hvis katalytiske domæner opholde sig i cytoplasmaet [19]. Det besidder også flere membranspændende domæner, der er involveret i ubiquitinering-medieret nedbrydning af forskellige substrater, herunder CD3-δ, ApoB lipoprotein, cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR), og metastase suppressor KAI1 [20,21]. Andre har rapporteret, at gp78 kan ubiquitinere visse foldede proteiner og kan fungere som et metabolisk regulator af gener, såsom HMG-CoA-reduktase (HMGCR) og Insigs involveret i lipidmetabolisme. På den anden side, i betragtning af den kritiske rolle gp78 i ERAD-regulerende ER homeostase, er det tænkeligt, at en defekt af gp78-medieret ERAD processer kan føre til kronisk ER stress og har en betydelig indvirkning på cellelevedygtighed, især for celler, der bærer en tunge byrde af fejlfoldede proteiner og kan være forbundet med NASH.

formålet med undersøgelsen var at undersøge den spontane fænotype af gp78-knockout mus udsat for normale kosten betingelser. Vi har fundet en aldersrelateret gp78 rolle i forbindelse med dysregulering af metabolisme og ER homeostase i leveren af ​​gp78 knockout-mus. Genetisk afbrydelse af gp78 i mus udviklede fedtlever, inflammation og spontan hepatocellulær cancer i alderen mus.

Resultater

Konstruktion af gp78-KO mus og gp78 opregulering som reaktion på ER stress

Gp78 heterozygote mus blev opnået med ES cellelinje, der genereres af genomisk insertion af et gen-trapping vektor. Genet-trapping vektor blev indsat i den første intron nedstrøms for ATG-kodonen mellem den første og anden exon, som blokerer produktionen af ​​endogent transkription (fig. 1A). For at undersøge nødvendigheden af ​​gp78 under fosterudviklingen, krydsninger mellem

gp78

+/-

heterozygote afkom blev udført og gav levedygtig

gp78

– /-

homozygot mus på en normal Mendel frekvens. For at udelukke tilstedeværelsen af ​​afkortede gp78 protein nedstrøms for afbrydelsen websted i gp78-KO celler blev RT-PCR og protein analyser udføres, og bekræftede, at gp78-KO mus ikke udtrykte gp78 mRNA eller protein i embryonale lysat eller levervæv (Fig . 1B). Herefter disse mus ikke udtrykker gp78 omtales som gp78-KO. Af note, blev endogent gp78 protein i vildtype (WT) celler og væv ikke påvist i regelmæssige Western blots, uanset maksimale belastning og brugen af ​​forskellige anti-gp78-antistoffer. Gp78 protein kunne visualiseres i vildtypemus efter berigelse ved immunopræcipitation med anti-gp78-antistof, hvilket antyder, at gp78-ekspression ikke er allestedsnærværende i hepatocytter og /eller er normalt meget lav. Konsekvent, viste immunhistokemi at gp78 blev farvet i vildtype-hepatocytter omkring portalen vene (Fig. 1C). Dernæst vi rettet reguleringen af ​​gp78 udtryk i udødeliggjort leverceller og cancerceller. For at undersøge, om gp78 udtryk er involveret i ER stress-induceret ERAD i leverceller, vi behandlede celler med tunicamycin (TM) til at fremkalde ER stress, hvilket resulterer i opreguleret gp78 udtryk (fig. 1D), tyder på, at gp78 udtryk og dets aktivitet er behov for at mildne forstyrrelser af eR homeostase. Krydsning med inter- og intra-genotyper viste, at homozygote viste ingen tydelige fænotyper, som de er levedygtige, groft normal og frugtbar. Det er overraskende, at gp78 ikke er afgørende for fosterudvikling eller overlevelse, i betragtning af den funktion og betydning ERAD maskiner og dets konstitutive proces [16,17].

(A) Skematisk af gp78-targeting strategi. Den gp78 allel forstyrret af indsættelse af et gen fælde vektor (OmniBank Vector 76) i den første intron. Genomisk DNA isoleret fra WT, heterozygote og homozygote blev genotypebestemt ved PCR. Primer sæt med dobbelt reverse primere er designet til intern PCR kvalitet. (B) Total RNA og lysater blev udarbejdet i embryo og voksne lever og blev analyseret i RT-PCR (Top) blev begge lysater immunfældet med kanin anti-gp78-antistoffer (epitop: 524-537) og derefter immunoblottedes med monoklonalt anti-gp78 antistoffer (epitop: 451-551) for at identificere gp78 protein (nederst). (C) Immunhistokemi (IHC) af leveren med monoklonalt anti-gp78 antistof. Pil angiver gp78 positiv plet. PV, portåren. Originalt billede, X400. (D) Opregulering af gp78 som reaktion på ER stress. Udødeliggjort THLE-3 og cancerøse HepG2 leverceller blev behandlet med tunicamycin (1 ug /ml) i 24 timer. og lysater blev immunfældet med anti-gp78-antistof og immunblottet. GRP78 /BIP, en chaperon af UPR veje. (F) Fotografi af maven af ​​1-årige mus (til venstre). Sammenligning af legemsvægt WT og gp78-KO-mus ved 3 måneder (n = 25), 6 måneder (n = 25), 12 måneder (n = 25) gamle (højre). Asterisk angiver en betydning bestemmes af Student test (*, p 0,05).

Ablation af gp78 inducerer leversteatose og inflammation i alderen mus

Aldring er velsagtens den mest universelle risiko faktor for de fleste af de almindelige sygdomme, herunder type 2 diabetes mellitus (T2DM), neurodegenerering og kræft, som ofte er forbundet med metaboliske dysregulering og /eller akkumulering af fejlfoldede proteinaggregater [22]. Således forventes det, at aldring-relaterede metabolisk lidelse og dysregulering af protein homeostase forstærke gp78 tab-associerende ERAD mangel på grund af de foreslåede gp78 roller

in vitro

som en metabolisk regulator og /eller en ådselsæder for fejlfoldede proteiner. Det var en bemærkelsesværdig observation, at mere end 70% af gp78-KO-mus vokse fedt med abdominal fedme i en alder af ca. 1 år (fig. 1E). Visceral fedme er forbundet med lipiddysregulering, insulinresistens, og NAFLD [2]. Desuden leveren er det organ der er ansvarlig for

de novo

lipogenese og systemisk styrer erhvervelse og fjernelse af triacylglycerol (TG), afledt fra tre kilder (kost,

de novo

syntese og fedtvæv ). Således udforskede vi udvikling af hepatisk sygdom i gp78-KO-mus og undersøgt genekspressioner forhold til lipidmetabolisme og ER stress markører i levervæv af 12-måneder gamle fede gp78-KO-mus, hvilket resulterede i nogen signifikant forskel i genekspression mønster (S1A fig.). Ifølge tidligere undersøgelser i dyrkede celler med eksogent kolesterol, gp78 ubiquitinerer HMGCR, som er et hastighedsbegrænsende trin i cholesterolbiosyntese, og også INSIG-2, som inhiberer aktiveringen af ​​SREBPs (SREBP-1a, 1c), fremme transskription af gener i forhold til lipidbiosyntese og mobilisering [23-25]. Imidlertid blev opregulering af HMG-CoA reduktase og undertrykkelse af SREBP-1 ikke signifikant observeret selv er konsekvent observeret INSIG-2 opregulering i vores gp78-KO hepatocytter. Efter aftale med en rapport andre gp78-KO embryonale fibroblastceller [26], gp78-KO mus viser heller ikke tegn på, at gp78 er direkte impliceret i kolesterol syntese gennem HMGCR nedbrydning. Dernæst vi farvet med hematoxylin og eosin (H portåren, FL; fedtlever område. (D) Procentdel af forekomsten herunder mild fedtlever, inflammation i 1-årige KO mus (n = 25 mus per hver gruppe).

Tab af gp78 under akut ER stress fører til ER stress medieret steatose gennem SREBP-1 aktivering

Vi først ønskede at forstå mekanismen (er), hvorved knockout af gp78 giver anledning til høj forekomst af NASH i alderen mus. Som vi hypotese, at både gp78 sletning og “aldersrelateret andet hit” er ansvarlige for NASH udvikling i gp78-KO mus, det kørte os at undersøge, om en aldersrelateret anden hit er spontan og tilfældig ER stress, der vises i forskellige kvaliteter i hele lever. , Forventede vi, at hele gp78-KO lever ville akkumulere lipid dråber som reaktion på tunicamycin, en akut ER stress inducer. Vi injicerede en subletal dosis af tunicamycin (TM) intraperitonealt til 6 måneder gamle gp78-KO-mus, som ikke kunne skelnes fra WT mus. Som forventet musene hurtigt tabte vægt efter TM behandling, med et større tab i gp78-KO end WT-mus (fig. 3A). TM-injicerede levere blev brun farvet ved 3 dage (fig. 3B). Lever farve gp78-KO på 11 dage ikke helt tilbage til den for kontrollen. Histologisk analyse visualiseret en markant forskel mellem leveren af ​​WT og gp78-KO mus efter TM injektion. Mens mindre lipiddråber blev observeret i TM-behandlede WT lever under stor forstørrelse, blev let detekteret lipiddråber sammen med celle ballooning hele gp78-KO lever (fig. 4C). TM-induceret steatosis af gp78-KO vises i hele leveren, sammenlignet med lokale og partielle områder i spontan steatosis af alderen gp78 KO lever (fig. 2A og C). Det foreslog kraftigt, at spontan NASH i alderen gp78-KO mus er forårsaget af spontan og tilfældig ER stress. Dernæst udførte vi immunoblotanalyse med leveren lysater at belyse molekylære mekanismer bag den fedtlever af gp78. I overensstemmelse med arbejdet med cellelinjer (fig. 1D), Den defensive rolle gp78 mod akut ER stress var underforstået, baseret på den iagttagelse, at gp78 udtryk blev også op reguleret

in vivo

efter TM behandling (S1B fig.). Sammen med dette, det GRP78 chaperon, beskytter fejlfoldede proteiner viste højere udtryk i TM-injicerede gp78-KO end WT mus. Tidligere rapporter har vist, at kronisk ER stress er involveret i patogenesen af ​​steatose [5,10]. De molekylære mekanismer, der ligger ER stress-medieret steatose omfatter opregulering af transkripter og aktivering af SREBP-1, som er en master regulator af fedtsyre og triglycerid biosyntese, hvorimod INSIG-2 er et vekselvirkende suppressor af SREBP-1 på ER-membranen [ ,,,0],24]. Således under kronisk ER stress, nedregulering af INSIG-2 fører til SREBP-1-aktivering efterfulgt af

de novo

lipogenese og lever steatosis [10,24]. Vi undersøgte nedregulering af INSIG-2 efterfulgt af op regulering af den spaltede form af SREBP-1 under TM stimulus og observeret mere aktivering af SREBP-1 i TM-behandlede gp78-KO leveren (S1B Fig.). Således SREBP-medieret lipogenese er delvis ansvarlig for TM-induceret fedtlever af gp78-KO. Det næste spørgsmål var, om den langsommere genopretning af kropsvægt i gp78-KO mus (fig. 3A) skyldes langvarig ER stress, hvor protein misfoldning er vedvarende eller overdreven. Vi analyserede 11 dage gamle mus injiceret med TM at undersøge liver status. Resultater indikerer vedvarende steatosis samt progression af fibrose i gp78-KO leveren, mens WT var inddrevet til deres ikke-injicerede status (fig. 3D). Konsekvent, viste immunblots at SREBP-1, regulering lipogenese stadig blev aktiveret ved 11 dages gp78-KO lever mens niveauet af WT blev genfundet til niveauet i ubehandlede mus (fig. 3E). Desuden TM-behandlede gp78-KO på 11 dage viste længere halveringstider GRP78, PDI, og UPR sensorer (IRE, ATF6, og Perk), indirekte markører for ophobning af fejlfoldede proteiner, end WT modstykker. Vedligeholdt udtryk for UPR underforstået forlænge ER stress i TM-eksponerede gp78-KO leveren. Når ER-funktionen er alvorligt svækket under langvarig ER stress, det organel fremkalder apoptotiske signaler og C /EBP homologt protein (CHOP) er en afgørende faktor for komponenterne i ER stress-medieret apoptose pathway [12]. For at undersøge om tab af gp78 påvirker cellelevedygtighed grund forlænge ER stress, vi isoleret gp78-KO embryonale fibroblastceller (MEF). Vi undersøgte, om levedygtigheden af ​​gp78-KO MEF’er er følsomme over for TM behandling (fig. 3F). Reduktion af overlevelse i gp78-KO MEF celler molekylært understøttet af en svag opregulering af GRP78, PDI, og betydelig udtryk for pro-apoptotisk CHOP i gp78-KO MEF celler (Fig. 3F). Sammenfattende viser disse resultater overbeviste os om, at tabet af gp78 falder ned i en tilstand af kronisk ER stress efter indre eller ydre faktorer ER stress i ældre mus. Med andre ord, gp78-E3 ligase spiller en kritisk rolle i ER stress-medieret ERAD i alderen hepatocytter.

(A) 1 mg /kg legemsvægt af tunicamycin (TM) blev injiceret intraperitonealt til 6 måneder gamle gp78 -KO mus. Kropsvægten er repræsenteret efter normalisering til startpositionen vægt som betød ± SE (n = 3 pr gruppe). (B) Radise lever er brun farvet efter TM injektion. Lever af gp78-KO på 11 dage blev ikke inddrevet. (C) Akut ER stress forstærker hele fedtlever af gp78-KO. H PDI, disulfidisomeraseproteinet, SERBP; Sterol Regulatory Element Binding transkriptionsfaktor; INSIG, Insulin Induced Gene. (F) Chop-medieret apoptose. Cell overlevelse blev analyseret med levedygtige optælling i gp78-KO mus embryonale fibroblast (MEF) celler behandlet med TM (1 pg /ml) som vist gange (øverst). Induktion af UPR blev analyseret i immunoblots og gp78 ekspression blev visualiseret efter immunpræcipitering (nederst). Hakke; ER stress-medieret apoptose markør.

(A) Fotografi i gp78-KO mus huser to levertumorer. (B) H glypican-3, human HCC markør; β-catenin, afvigende Wnt signalering markør hhv. (E) Gp78 nedregulering i IHC vifte af menneskelige HCC. Duplikerede prøver pr en patient blev farvet med anti-gp78-antistof. A, normal lever ( 50% plet); b, trin I ( 50% plet); c, fase II ( 10% plet); d, fase III (0% plet). Graf repræsenterer niveauet af gp78-ekspression ifølge tumorklassificering (normal lever, n patient = 10; trin I, n = 3; trin II, n = 40; trin III, n = 46). En score blev beregnet (0, negativ, 1, 10%; 2, 10% og 50%, 3, 50% positive farvet). (F) hypotetisk mekanisme bag NASH og HCC patogenese i gp78-KO mus. Gp78-medieret ERAD effektivitet giver anledning til overfølsomhed respons på akut ER stress efter ældning, hvilket fører til kronisk ER stress, hvor fejlfoldede proteiner er persistente og inducere Chop-medieret apoptose, SREBP-medieret lipogenese i sidste ende fører til inflammation, NASH, og cancer.

Gp78 spiller rollen som en tumor suppressor i hepatocellulær carcinogenese

NAFLD, især den aggressive fase af ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH) er forbundet med en øget risiko for leverkræft og retrospektive data tyder på, at omkring 27% af tilfældene af NASH omdanne til HCC efter udviklingen af ​​skrumpelever, et sent tidspunkt i ardannelse (fibrose) [27]. Interessant, observerede vi, at den samlede, 20% (6/25 mus) af gp78-KO mus udviklede levertumorer, mens alle WT mus undersøgte var kræft fri i den tid undersøgte linie (figur 4A.). H