PLoS ONE: Anticancer Effekt af Ginger Uddrag mod bugspytkirtelkræftceller Hovedsageligt gennem Reaktive Oxygen Species-medieret Autotic Cell Death

Abstrakt

ekstrakt af ingefær (

Zingiber officinale Roscoe

) og dens store bidende komponenter, [6] -shogaol og [6] -gingerol, har vist sig at have en antiproliferativ virkning på adskillige tumorcellelinier. Imidlertid er anticanceraktivitet af ingefær ekstrakt i bugspytkirtelkræft dårligt forstået. Her viser vi, at ethanol ekstraheret materialer af ingefær undertrykt cellecyklusprogression og dermed inducerede død menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer, herunder Panc-1 celler. Den underliggende mekanisme indebar AutoSIS, en nyligt karakteriseret form for celledød, men ikke apoptose eller necroptosis. Ekstrakten markant øgede LC3-II /LC3-I-forholdet, nedsat SQSTM1 /P62 protein, og øget vakuolisering af cytoplasmaet i Panc-1-celler. Det aktiverede AMPK, en positiv regulator af autophagy, og hæmmede mTOR, en negativ autophagic regulator. De autophagy hæmmere 3-methyladenin og chloroquin delvist forhindret celledød. Morfologisk imidlertid fokal membran brud, nuklear krympning, fokal hævelse af perinukleære rum og elektron tætte mitokondrier, som er unikke morfologiske træk ved AutoSIS, blev observeret. Ekstraktet forbedrede reaktive ilt arter (ROS) generation, og antioxidanten N-acetylcystein svækket celledød. Vores undersøgelse viste, at daglig intraperitoneal indgivelse af ekstrakten signifikant forlænget overlevelse (P = 0,0069) i en peritoneal formidling model og undertrykte tumorvækst i en ortotopisk model af pancreascancer (P 0,01) uden alvorlige bivirkninger. Selvom [6] -shogaol men ikke [6] -gingerol viste lignende effekter, analyser kromatografiske foreslået tilstedeværelsen af ​​andre bestanddele (r) som aktive stoffer. Tilsammen viser disse resultater, at ingefær ekstrakt har potent anticancer aktivitet mod bugspytkirtelkræftceller ved at inducere ROS-medieret AutoSIS og garanterer yderligere undersøgelse med henblik på at udvikle en effektiv kandidat stof

Henvisning:. Akimoto M, Iizuka M, Kanematsu R, Yoshida M, Takenaga K (2015) Anticancer Effekt af Ginger Uddrag mod bugspytkirtelkræftceller Hovedsageligt gennem Reaktive oxygen Species-medieret Autotic celledød. PLoS ONE 10 (5): e0126605. doi: 10,1371 /journal.pone.0126605

Academic Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense Universitet, SPANIEN

Modtaget: Januar 6, 2015; Accepteret: April 5, 2015; Udgivet: 11 maj, 2015

Copyright: © 2015 Akimoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud-in-Aid i: Shimane University “SUIGANN” Projekt (https://www.shimane-u.ac .jp) (til KT); Videnskabelig Forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan (https://www.mext.go.jp) (ingen 25.430.110 til KT.); og Japan Åreforkalkning Research Foundation (til KT). Dette arbejde blev også støttet af Støtte til Super Science High Schools fra Japan Science and Technology Agency til Izumo High School (https://rikai.jst.go.jp) (til KT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en meget aggressiv neoplasma med mange kemo- og strålebehandling-resistente fænotyper. Forekomsten af ​​pancreascancer vokser årligt verden over, bliver den fjerde mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald i verden. Faktisk det anslåede antal nye tilfælde bugspytkirtelkræft var 277.000 i 2008 og 338.000 i 2012, og der var 266.000 pancreas kræftdødsfald i 2008 og 331.000 bugspytkirtlen kræftdødsfald i 2012 [1, 2]. Da størstedelen af ​​bugspytkirtlen kræftpatienter er diagnosticeret på et ubrugeligt stadie [3, 4], den samlede 5-års relativ overlevelse er lav, og den mediane overlevelsestid er kun 6 måneder, selv hos patienter i behandling kvalitet. For at opnå nye kundeemner til udvikling af forebyggende og terapeutiske strategier, har været fokuseret mange forskningsindsats på at forstå de molekylære mekanismer, der ligger bugspytkirtelkræft progression [3, 4].

Ginger (

Zingiber officinale Roscoe

), er en rhizomatous flerårig plante, almindeligt anvendt som et krydderi i fødevarer og drikkevarer og anvendes primært som et middel mod fordøjelsesforstyrrelser, herunder dyspepsi, kvalme, gastritis, opkastning, kolik og diarré [5, 6]. Ingefær ekstrakt og dets skarpe komponenter, såsom [6] -gingerol og [6] -shogaol, vides også at udvise mange biologiske virkninger, herunder anti-inflammation, antioxidation og anticanceraktivitet [5, 6]. På grund af sin stærke anti-inflammatorisk aktivitet, har ingefær nylig henledt opmærksomheden som et middel mod slidgigt og leddegigt [7, 8]. Med hensyn til anticanceraktivitet, ingefær og dens bestanddele er blevet vist at inhibere proliferation af og inducerer apoptose af forskellige cancer celletyper

in vitro

[9-15]. Desuden har brugen af ​​ingefær til chemoforebyggelse af colorektal cancer tiltrukket opmærksomhed [16-18]. Men anticancer aktivitet af ingefær ekstrakt og dens bestanddele mod kræft i bugspytkirtlen er blevet dårligt undersøgt.

I denne undersøgelse undersøgte vi anticancer aktivitet af ingefær ekstrakt mod kræft i bugspytkirtlen celler både

in vitro

og

in vivo

og undersøgt dens potentielle mekanisme. Her rapporterer vi, at ingefær ekstrakt fører til reduktionen af ​​levedygtighed celle og tumorvækst i Panc-1 celler primært gennem ROS-medieret AutoSIS, en nyligt karakteriseret form for celledød.

Materialer og Metoder

celler og cellekultur

Humane bugspytkirtelkræftceller, Panc-1, aSPC-1, BxPC-3, Capan-2, CFPAC-1, MiaPaCa-2 og SW1990, og mus bugspytkirtelkræftceller, Panc02 , blev anvendt i denne undersøgelse. Panc-1 og MiaPaCa-2-celler blev opnået fra Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Japan), og andre humane pancreatiske cellelinjer blev fremskaffet fra ATCC (Manassas, VA). Panc02 celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. T. Hollingsworth, University of Nebraska Medical Center [19, 20]. Panc-1-Luc-ZsGreen celler og Panc02-Luc-ZsGreen celler, der udtrykker ildflueluciferase og ZsGreen blev oprettet ved lentiviral transduktion af plasmidet pHIV-Luc-ZsGreen, som er blevet deponeret hos Addgene (https://www.addgene.org /Bryan_Welm /), og efterfølgende kloning. Humane pulmonære alveolære epitelceller (HPAEpiC) blev indkøbt fra ScienCell (Carlsbad, CA, USA) og blev opretholdt i alveolær epitelcelle-medium (AEpiCM) suppleret med 2% føtalt bovint serum (FBS), epitelcellevækst supplement (EpiCGS) og penicillin /streptomycin. Humane umbilical vene endotelceller (HUVEC) blev opnået fra Lonza Walersville, Inc. (Walkersville, MD, USA) og blev dyrket i EBM-2 supplementeret med EGM SingleQuats (Lonza). Mitokondrier DNA-mindre P29 (ρ

0P29) celler og cybrid P29mtP29 celler, der blev genindført med P29 mtDNA i ρ

0P29 celler blev etableret fra Lewis lungekarcinom P29 celler [21]. Colon kræftceller (Colo320DM, HT29, LoVo, LS174T, SW480, SW620) [22], gastriske kræftceller (MKN1, MKN45) [23], lunge kræftceller (A549, QG56, PC-10, PC-1) [24 ], brystcancerceller (MCF7, BT549, MDA-MB-231, MDA-MB-468) [25, 26], leukæmiceller (THP-1, K562) [27], osteosarkomceller (Saos-2) [28 ], cervicale cancerceller (HeLa) [29], hepatomaceller (HepG2) [30], fibrosarcomceller (HT1080) [29] og muse coloncarcinom LuM1 celler afledt fra colon 26 tumor [31] blev også anvendt i denne undersøgelse . HT29, LS174T, SW480, SW620 og MDA-MB-468 blev indkøbt hos ATCC. MCF7 og HT1080-celler blev opnået fra JCRB Cell Bank. THP-1 og K562-celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Y. Honma, Shimane University Faculty of Medicine. Mavekræft cellelinjer blev leveret af Patologisk Institut (Dr. S. Morikawa), Shimane University Faculty of Medicine. Andre cellelinjer blev leveret af Dr. A. Nakagawara, Chiba Cancer Center Research Institute. Karakteristik af cellelinierne anvendt i denne undersøgelse, er beskrevet andetsteds [19-31]. Leukæmicellelinjer blev dyrket i RPMI1640-medium indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 40 pg /ml gentamicin. Andre cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% FBS og 40 pg /ml gentamicin i en fugtig atmosfære med 21% O

2/5% CO

2 (normoxi) eller 1% O

2/5% CO

2 (hypoxi). Hypoxiske dyrkningsbetingelser blev opnået i et fugtigt automatisk O

2 /CO

2 inkubator (Wakenyaku, Kyoto, Japan).

Reagenser

[6] -Shogaol og [6 ] -gingerol blev købt fra TOKIWA phytochemical CO., Ltd (Chiba, Japan).

Udarbejdelse af ingefær ekstrakt (SSHE)

Tørt pulver af de grundlæggende dele af Syussai Shoga (ingefær i japansk), som blev dyrket i Hikawa område i Izumo, Shimane Prefecture, blev ekstraheret med ethanol (10: 1; volumen for vægt) i 20 minutter i en sonication vandbad. Ethanol blev afdampet ved 80 ° C til opnåelse af en rå ethanolekstrakt af ingefær (benævnt SSHE). Ekstrakten blev afvejet og opløst i ethanol eller dimethylsulfoxid (DMSO) i den ønskede koncentration.

cellevækst og levedygtighed assay

cellevækst og levedygtighed blev målt ved anvendelse af MTT (3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) analysen. Kort fortalt celler (2×10

4 celler /brønd) blev dyrket i 96-brønds vævskulturplader og behandlet tre gange i 100 pi DMEM /10% FBS indeholdende forskellige koncentrationer af SSHE eller opløsningsmiddel alene i den angivne periode. Ved slutningen af ​​inkubationen blev 10 pi MTT (2,5 mg /ml) (Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan) tilsat til brøndene for at tillade dannelse af MTT formazankrystaller i 4 timer. Efter mediet var fjernet, blev krystallerne solubiliseret i 100 pi DMSO. Absorbansen blev registreret ved 550 nm. Cellelevedygtighed blev også analyseret ved en trypanblåt udelukkelse farvestof test.

Cellecyklusanalyse

Panc-1-celler behandlet med SSHE i 20 timer blev fikseret i 70% ethanol og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. De fikserede celler blev vasket med Dulbeccos PBS (DPBS) og inkuberet med 100 ug /ml RNase A og 50 pg /ml PI (Sigma-Aldrich Japan). Cellerne blev derefter underkastet flowcytometrianalyse under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Måling af mitokondrier membranpotentiale

Mitokondrier membranpotentialet blev overvåget af JC 1 mitochondriemembran Potential Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Til dette assay blev 100 pl /ml af JC-1-farvning opløsning til Panc-1-celler behandlet med SSHE i 20 timer i plader med 6 brønde, og cellerne blev inkuberet i 15 min. Bagefter blev cellerne løsrevet ved trypsinisering, vasket to gange med assaybuffer, og derefter udsat for flowcytometri.

Annexin V /propidiumiodid (PI) farvning

Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (BECKMAN COULTER Inc., Pasadena, CA) blev anvendt til at detektere annexin V og /eller PI-positive celler. Kort beskrevet blev Panc-1-celler vasket med iskold DPBS og derefter farvet med Annexin V-FITC i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke og PI i iskold bindingsbuffer. Annexin V og /eller PI-positive celler blev talt under anvendelse af et FACS Calibur flowcytometer.

Måling af ROS-generering

Produktionen af ​​ROS blev overvåget ved flowcytometri med 2 ‘, 7’ dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA) (Molecular Probe-Life Technologies, Carlsbad, CA) og mitokondrie superoxid indikator MitoSOX Rød (Invitrogen) som prober. Kort beskrevet blev Panc-1-celler behandlet med SSHE inkuberet med 10 pM af H2DCFDA eller 5 uM MitoSOX Red i serumfrit DMEM i 10 minutter. Mediet blev fjernet, og cellerne blev løsnet med en kort behandling af 0,25% trypsin i Hanks balancerede saltopløsning. Efter tilsætning af frisk dyrkningsmedium blev cellerne opsamlet ved centrifugering, vasket en gang med DPBS og suspenderet i DPBS. Fluorescensen blev overvåget ved anvendelse af FACSCalibur flowcytometer eller under en laser konfokalt mikroskop (FluoView FV1000, Olympus, Tokyo).

Western blotting

Celleekstrakter blev fremstillet ved lysere celler med RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat, 2 mM EDTA, protease inhibitor cocktail og phosphatase inhibitor cocktail) på is i 20 minutter. Lysaterne blev centrifugeret ved 12.000 x

g

i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev anvendt til efterfølgende analyser. SDS-polyacrylamidgelelektroforese og immunoblot analyser blev udført som tidligere [32] beskrevne. De primære anvendte antistoffer var kanin-monoklonalt anti-SQSTM1 /P62 (D5E2, 1: 1.000 fortynding, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), kanin polyklonalt anti-LC3B (1: 1.000 fortynding, Cell Signaling), kanin polyklonalt anti-phospho- mTOR (S2481) (1: 1.000 fortynding, Cell Signaling), kanin monoklonalt anti-mTOR (7C10, 1: 1.000 fortynding, Cell Signaling), kanin monoklonalt anti-phospho-AMPKα (T172) (40H9, 1: 1.000 fortynding, Cell signaling), og kanin monoklonalt anti-AMPKα antistof (23A3, 1: 1000 fortynding, Cell signaling). De sekundære antistoffer var HRP-konjugeret kanin eller anti-mus IgG (1: 3000 fortynding, Cell Signaling). For lastning kontrol, anti-β-actin antistof (sc-47.778, 1: 3000 fortynding, Santa Cruz Biotechnology) blev anvendt. Signaler blev visualiseret ved hjælp af ECL plus (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Membranerne blev scannet med en Luminoimaging Analyzer LAS4000 (GE Healthcare).

immunfluorescensfarvning

Panc-1 celler behandlet med opløsningsmiddel alene eller SSHE blev fikseret med 4% formaldehyd /5% saccharose i DPBS i 20 minutter, skyllet med DPBS, og permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i DPBS i 4 min. I nogle eksperimenter blev celler farvet med 100 nM af MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) i 10 minutter før fiksering. Cellerne blev blokeret med 3% BSA /0,1% glycin i DPBS i 1 time, skyllet og derefter inkuberet med kanin monoklonalt anti-AIF (D39D2, 1: 200 fortynding, Cell Signaling) eller kanin polyklonalt anti-LC3B antistof (1: 200 fortynding) i 1 time. Efter grundig vask med DPBS blev cellerne inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret gede anti-kanin IgG (1: 300 fortynding, Invitrogen) i 1 time. Cellerne blev modfarvet med DAPI og observeret under et laser konfokalt mikroskop.

Transmission (TEM) analyse

Ubehandlet Panc-1-celler og celler behandlet med 200 ug /ml SSHE for 28 timer blev anbragt i 2% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd i 30 mM HEPES-buffer (30 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM CaCI

2, pH 7,4) i 2 timer ved 4 ° C og post-fikseret med 1 % OSO

4 i 1 time ved 4 ° C. Prøverne var dehydreret med gradueret alkohol og indlejret i TAAB812 harpiks (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berkshire, UK). Ultratynde snit blev farvet i 1 time i 3% vandig uranylacetat, vasket og modfarvet med 0,3% bly citrat, og de blev undersøgt på en transmission-elektronmikroskop (EM-002B, JEOL Ltd., Tokyo, Japan).

GFP-LC3 plasmid og transfektion

EGFP-LC3B fusion plasmid (pCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP) blev konstrueret ved kloning LC3B cDNA, som blev amplificeret ved PCR, ind i en pCMX-SAH /Y145F-GFP-vektoren [33]. Konstruktionen blev bekræftet ved DNA-sekventering. Panc-1 alen blev transient transficeret med plasmidet under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Efter 24 timer blev cellerne udsat for SSHE og undersøges under et laser konfokalt.

Dyreforsøg

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af animalsk forskning. Protokollen blev godkendt af Izumo Campus Animal Care og brug Udvalg Shimane University (Tilladelse nummer: IZ26-7). Alle mus blev opstaldet i dyret midt i Shimane University medicinske fakultet under specifikke patogenfrie betingelser ved en kontrolleret temperatur på 23 ± 2 ° C, relativ luftfugtighed 55 ± 10%, og med 12 timers lys /12 timer mørke cykler. De fik mad og vand

ad libitum

. Mus blev kontrolleret for deres helbred under hele forsøgsperioden mindst en gang om dagen efter tumorinjektion. Alle operationer blev udført under medetomidin (0,3 mg /kg) /midazolam (4,0 mg /kg) /butorphanol (5,0 mg /kg) anæstesi. Mus blev aflivet ved normalt CO

2 inhalation ved afslutningen af ​​en undersøgelse. For den peritoneale formidling model, Panc02-Luc-ZsGreen celler (5×10

5 celler /mus) blev injiceret intraperitonealt som en cellesuspension i 7 uger gamle C57BL /6-mus (Crea Japan, Tokyo, Japan), og musene blev randomiseret og grupperet i kontrollen (n = 8) og SSHE grupper (n = 8). De behandlingsregimer blev startet dagen efter podning med tumoren. Mus blev aflivet i en CO

2 kammer, når de var døende, målt ved en mangel på vedvarende målrettet respons på blide stimuli. Alle bestræbelser herunder subkutan administration af meloxicam (5 mg /kg) blev foretaget for at minimere lidelse. Eksperimentet blev udført to gange, og de kombinerede data blev underkastet analyser. For ortotopisk model af pancreascancer, Panc-1-Luc-ZsGreen celler (1×10

6 celler /mus) blev implanteret med 50% Matrigel ind pancreas fra 6 uger gamle nøgne hunmus (BALB /c nu /nu, Japan SLC, Shizuoka, Japan) [32]. En uge efter injektion blev de randomiseret og grupperet i kontrollen (n = 6) og SSHE grupper (n = 6). De behandlingsregimer blev startet en uge efter tumor injektion. For muse coloncarcinomceller eksperimenter, LuM1 celler (3 x 10

5 celler) blev subkutant implanteret i Balb /c-mus (n = 6 for kontrol og SSHE gruppe). Mængden af ​​LuM1 tumorer blev vurderet ved måling af to vinkelrette diametre med passere. Tumor volumen (V) blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: V =

(en

2

xb) /2

, hvor

en

er den lille diameter og

b

den store diameter. I SSHE gruppe blev mus intraperitonealt administreret 80 mg /kg SSHE gang dagligt. I kontrolgruppen blev mus administreret opløsningsmiddel alene i DPBS.

Bioluminescent imaging

In vivo

selvlysende billeddannelse blev udført ved hjælp af IVIS billeddannende system (Caliper Life Sciences, Hopkinton , MA). Alle mus blev injiceret intraperitonealt med 150 mg /kg d-luciferin (Promega, Fitchburg, WI) og bedøvet med 2,5% isofluran. Ti minutter senere blev fotoner fra dyrenes hele kroppe filmede med IVIS billeddannende system (Caliper Life Sciences) ifølge producentens instruktioner. Data blev analyseret ved levende billede 2,50 software (Caliper Life Sciences).

Blood hæmatologi og biokemi test

Mus blev bedøvet, og blod blev opsamlet fra hjertet. Perifert blod profiler blev analyseret af Sysmex KX-21NV automatiseret hæmatologianalysator (Sysmex, Kobe, Japan). Niveauerne af hvide blodlegemer (WBC), røde blodlegemer (RBC), blodplader (PLT), hæmoglobin (HGB), hæmatokrit (HCT), betyder (MCV), gennemsnitlig korpuskulær hæmoglobin (MCH), og betyde corpuscular hæmoglobin koncentration (MCHC) blev undersøgt. Glucose (Glu) niveauer, total kolesterol (T-Cho) niveauer, alaninaminotransferase (ALAT) og aspartat aminotransferase (AST) niveauer, og BUN (BUN) niveauer blev analyseret med en automatiseret analysator til klinisk kemi, SPOTCHEM EZ SP- 4430 (ARKRAY, Inc., Kyoto) under anvendelse SPOTCHEM II teststrimler.

omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC)

flydende kromatografiske separationer blev opnået ved anvendelse af en omvendt fase C -18, 3 um, 2,4 x 250 mm søjle (COSMOSIL. Nakarai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) ved en strømningshastighed på 1 ml /min. Den mobile fase var 70% methanol. Elueringsprofilen blev overvåget ved UV-spektrofotometri ved 228 nm.

Statistisk analyse

Alle data er præsenteret som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans mellem datasæt blev testet ved uparret Students

t

test. Overlevelse af mus blev analyseret under anvendelse af log-rank test. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

SSHE hæmmer cellecyklusprogression og inducerer død af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer

Behandling af Panc-1 celler med SSHE for 20 timer resulterede i en anholdelse i G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen (fig 1A). En stigning i subG1 fraktion, en funktion af apoptose, var marginal. SSHE vinder induceret død Panc-1-celler og andre humane og muse bugspytkirtelkræft cellelinjer (Fig 1B). Normale celler, såsom HUVEC og HPAEpiC var mere resistente over for SSHE sammenlignet med Panc-1-celler (Fig 1C). Ved de senere stadier af celledød af Panc-1-celler, fokal plasmamembran brud og krympning af kernen var tydelig (fig 1D). Det skal bemærkes, at fragmentering af kernen, et andet træk ved apoptose, blev sjældent observeret på dette tidspunkt. SSHE var også effektivt inducerer død Panc-1-celler under hypoxiske betingelser (Fig 1E). Den forårsagede også en signifikant væksthæmning og død i en række yderligere tumorcellelinier, såsom coloncancer, gastrisk cancer, lungecancer, brystcancer, leukæmi, osteosarkom, hepatom, livmoderhalskræft og fibrosarkom (S1 Fig).

(A) Cell cyklus. Panc-1-celler blev behandlet med vehikel alene, til 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 20 timer, fikseret, farvet med PI, og derefter underkastes cytometri. (B) Cellelevedygtighed. Pancreascancer cellelinjer blev behandlet med bærer alene eller forskellige koncentrationer af SSHE i 42 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. Bars; SD. (C) Effekt af SSHE på normale celler. HUVEC, HPAEpiC og Panc-1-celler blev behandlet med bærer alene eller 100 ug /ml SSHE til 38 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. Bars; SD. (D) Morfologi. Panc-1-celler blev behandlet med vehikel alene (venstre) eller 200 ug /ml SSHE i 40 timer (til højre). (E) Effekt af SSHE på Panc-1 celler under hypoxiske betingelser. Panc-1-celler blev behandlet med vehikel alene eller forskellige koncentrationer af SSHE i 42 timer. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved MTT-analysen.

SSHE inducerer autotic celledød snarere end apoptose eller necroptosis i Panc-1 celler

For at undersøge mekanismen hvorved SSHE inducerede død Panc -1 celler undersøgte vi forskellige markører for apoptotiske celler. Den JC-1-analysen viste en markant reduktion af mitokondrier membranpotentialet efter SSHE behandling (Fig 2A). Annexin V /PI-farvning viste også en stigning i procentdelen af ​​annexin V-positive og /eller PI-positive celler, afhængig af koncentrationen af ​​SSHE (Fig 2B). Men den pan-caspaseinhibitoren zVAD-FMK ikke forbedre celle overlevelse (fig 2C). Endvidere spaltet caspase 3 var næppe detekterbar efter behandling med 200 ug /ml SSHE i 24 timer. Efter SSHE behandling, næsten 30% af cellerne var PI positive, mens behandling af cellerne med pifithrin-μ og TRAIL aktiveret caspase-3 (fig 2D), hvilket faldt sammen med en tidligere rapport [34]. Baseret på de data, der tyder på, at SSHE hverken øget procentdel af subG1 fraktion (Fig 1A) eller induceret fragmentering af kerner (Fig 1D), kunne vi ikke skaffe konkrete beviser af apoptose i SSHE-behandlede Panc-1 celler. Derudover translokation af apoptoseinducerende faktor (AIF), en mitokondrie caspase-uafhængig død effektor, ind i kernen ikke var tydelig (S2 Fig), og necrostatin-1, en inhibitor af RIP1 kinase-medieret necroptosis kroppen for at forhindre SSHE- induceret celledød (S2 fig). Således blev hverken mitokondrier-uafhængig apoptose eller necroptosis involveret i SSHE-induceret celledød.

(A) mitokondriemembranen potentiale. Panc-1-celler blev behandlet med vehikel alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 20 timer og derefter underkastet JC-1 assay. Sunde celler med funktionelle mitokondrier, der indeholder røde JC-1 J-aggregater og apoptotiske eller usunde celler med sammenklappede mitokondrier, der indeholder hovedsagelig grønne JC-1-monomerer blev detekteret ved cytometri. (B) Annexin V /PI-farvning. Panc-1-celler blev behandlet med vehikel alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 24 timer og derefter udsat for annexin V /PI-farvning. (C) Effekt af zVAD-FMK (zVAD) på SSHE-induceret celledød. Panc-1-celler blev inkuberet i 42 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. Bars; SD. (D) Caspase-3-aktivering. Panc-1-celler blev inkuberet med 200 ug /ml SSHE for forskellige tidsperioder eller behandlet med 10 pM pifithrin-μ og 100 ng /ml TRAIL i 60 timer (tjente som positiv kontrol). Cellelysaterne blev underkastet Western blot-analyse med anti-caspase 3-antistof.

På den anden side, SSHE markant øgede LC3-II /LC3-I-forholdet, en indikator for autophagosome dannelse, i en dosis- og tidsafhængig måde. SSHE faldt også SQSTM1 /P62 protein niveauer, en af ​​de specifikke substrater nedbrydes gennem autofagi-lysosomale pathway, i Panc-1-celler (Fig 3A og 3B). SSHE aktiveret AMPK, en positiv regulator af autophagy, og hæmmede mTOR, en negativ autophagic regulator (Fig 3C og 3D). De autophagy inhibitorer 3-methyladenin og chloroquin delvist forhindret celledød (figur 3E). Morfologisk viste SSHE-behandlede celler massiv vakuolisering af cytoplasmaet ca. 24 timer efter behandling (fig 4A). Disse cytoplasmatiske vakuoler var sandsynligvis autophagosomes fordi GFP-LC3 puncta optrådte efter behandling med SSHE (Fig 4B). Nogle LC3 puncta blev co-lokaliseret med MitoTracker-positive mitokondrier i cellerne behandlet med 100 ug /ml SSHE i 20 timer, hvilket tyder på forekomsten af ​​mitophagy (Fig 4C). Således SSHE-induceret celledød syntes at være autophagic celledød. Men TEM analyser 28 timer efter SSHE behandling viste elektron-tætte mitokondrier, tomme vakuoler og fokal perinuklear hævelse (Fig 4D), som ikke er observeret i klassisk form autofagi [35]. Vi konkluderede derfor, at SSHE-induceret celledød var caspase-uafhængig og lignede autofagi celledød. Denne form for celledød falder sammen godt med AutoSIS, et nyligt karakteriseret Na

+, K

+ – ATPase-regulerede form for celledød [36]. Desværre, fordi den hjerteglykosid digoxin, en antagonist af Na

+, K

+ – ATPase, der er rapporteret at inhibere AutoSIS [36], var for cytotoksisk for Panc-1-celler, kunne vi ikke vurdere dets virkning på SSHE-induceret celledød.

(A) Effekt af SSHE på ekspressionen af ​​autofagi-relaterede proteiner. Panc-1-celler blev behandlet med vehikel alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 24 timer. Cellelysaterne blev underkastet Western blot-analyse med anti-SQSTM1 /P62 eller anti-LC3 antistof. p-actin tjente som en loading kontrol. (B) Time-kursus af konverteringen af ​​LC3-I til LC3-II. Panc-1-celler blev behandlet med 200 ug /ml SSHE til de angivne tidspunkter. (C) AMPK og mTOR ekspression. Panc-1-celler blev behandlet med 200 ug /ml SSHE i forskellige tidsrum. Cellelysaterne blev underkastet Western blot-analyse med anti-AMPK, anti-phospho-AMPK-antistof, anti-mTOR, eller anti-phospho-mTOR. p-actin tjente som en loading kontrol. (D) AMPK aktivering og mTOR inhibering med SSHE. Intensiteten af ​​båndene i (C) blev kvantificeret af Image J software. (E) Effekt af 3-methyladenin (3-MA) ​​og chloroquin (CQ) på SSHE-induceret celledød. Panc-1-celler blev behandlet med SSHE ved den angivne koncentration i fravær eller nærvær af 10 uM 3-MA (venstre) eller 40 uM CQ i 42 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. Western blot billeder (A-C) er blevet beskåret til præsentation. Fuld størrelse billeder præsenteres i S13 Fig Bars; SD.

(A) Fase kontrast. Panc-1-celler blev behandlet med bærer alene eller 100 ug /ml SSHE i 40 timer. Bars; 100 um. (B) LC-3 puncta. Panc-1-celler transficeret med pCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP-vektoren blev behandlet med bærer alene eller 100 ug /ml SSHE i 24 timer og blev observeret under et konfokalt laser mikroskop. Bars; 20 um. (C) Dobbelt farvning med MitoTracker og anti-LC3 antistof. Panc-1-celler blev behandlet med vehikel alene, 100 ug /ml eller 200 pg /ml SSHE i 24 timer, farvet med 100 nM MitoTracker Red i 10 minutter, fikseret og derefter bearbejdet for LC3 immunfarvning. Bars; 20 um. (D) ultrastruktur. Panc-1-celler behandlet bærer alene eller med 200 pg /ml SSHE i 28 timer blev forarbejdet til TEM-analyse. Original forstørrelse, x2,500. PC, perinukleære plads.

mitokondrie ROS generation er involveret i SSHE celledød

Ændringer i ROS generation, som vurderet af H2DCFDA farvning, efter behandling af Panc-1 celler med SSHE viste en bifasisk mønster. På de tidlige stadier (ca. 10 h), blev ROS generation hæmmet af SSHE (S3 Fig). Men langvarig behandling resulterede i en robust stigning i ROS-generering (Fig 5A og 5B). MitoSOX Red-farvning viste også øget produktion af mitokondrie superoxid (S4 Fig). Antioxidanten N-acetylcystein (NAC) signifikant svækket celledød induceret af SSHE som vurderet af trypanblåt udelukkelse test (Fig 5C). Disse resultater tydede ROS-generering som en årsag til SSHE-induceret celledød.

(A) Panc-1-celler behandlet med bærer alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 20 timer blev farvet med 10 uM H2DCFDA i 10 minutter og straks observeret under et konfokalt laser mikroskop. (B) Panc-1-celler behandlet som i A blev underkastet cytometri. (C) Effekt af NAC på SSHE-induceret celledød. Panc-1-celler blev behandlet med 200 ug /ml SSHE i nærvær eller fravær af 10 mM NAC i 42 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved en trypanblåt udelukkelse test. Bars; SD.

Mitokondrier rapporteres at være den primære kilde til ROS kræves for autophagy induktion [37]. For at undersøge, om mitokondrie ROS spille en rolle i SSHE-induceret autotic celledød, vi udnyttet mitokondrie-DNA (mtDNA)-mindre ρ

0P29 celler, der er afledt af Lewis lunge carcinom P29 celler og P29mtP29 celler, der blev fastlagt ved at genindføre Wild- skriv mtDNA i ρ

0P29 celler. Når ρ

0P29 celler blev behandlet med SSHE de knap produceret ROS, mens P29mtP29 celler tilstrækkeligt produceret ROS (S5 Fig). Interessant, ρ

0P29 celler blev afsløret at være resistente over SSHE sammenligning med P29mtP29 celler (S5 Fig).

SSHE forsinker tumorvækst af bugspytkirtelkræft

Når Panc02-Luc-ZsGreen celler (5 x 10

5 celler) intraperitonealt transplanteret ind C57BL /6-mus, de tendens til dannelse formidles knuder fortrinsvis omkring bugspytkirtlen og på den peritoneale overflade, og musene udviklede ascites (ca. 2,4 ml /mus, når moribunde) ( S6 fig). Vi undersøgte den terapeutiske effekt af SSHE i denne peritoneal formidling model.