PLoS ONE: metabolitter af Ginger Komponent [6] -Shogaol Remain Bioaktive i cancerceller og har lav toksicitet i normale celler: Kemisk syntese og biologisk Evaluation

Abstrakt

Vores tidligere undersøgelse viste, at [6] -shogaol en større bioaktiv komponent i ingefær, metaboliseres i cancerceller og i mus. Det er uklart, om disse metabolitter bevarer bioaktivitet. Formålet med den aktuelle undersøgelse er at syntetisere de primære metabolitter af [6] -shogaol og evaluere deres hæmning af vækst og induktion af apoptose i humane cancerceller. Tolv metabolitter af [6] -shogaol (M1, M2, og M4-M13) lykkedes syntetiseret ved hjælp af enkle og let tilgængelige kemiske metoder. Væksthæmning analyser viste, at de fleste metabolitter af [6] -shogaol havde målbare aktiviteter mod humane kræftceller HCT-116 og H-1299. Især metabolit M2 beholdt spænder de biologiske aktiviteter af [6] -shogaol, med en IC

50 af 24.43 pM i HCT-116 humane coloncancer-celler og en IC

50 af 25,82 uM i H-1299 human lungecancerceller. Også udviser en relativ høj potens var thiol-konjugat M13, med IC

50 værdier på 45.47 og 47.77 pM mod HCT-116 og H-1299-celler. Toksiciteten evaluering af de syntetiske metabolitter (M1, M2, og M4-M13) mod human normal fibroblast kolon celler CCD-18Co og menneskelige normal lungeceller IMR-90 viste en afgiftende metaboliske biotransformation af [6] -shogaol. Den mest aktive metabolit M2 havde næsten ingen toksicitet til CCD-18Co og IMR-90 normale celler med IC

50’erne i 99,18 og 98,30 uM hhv. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick ende mærkning) assay viste, at apoptose blev udløst af metabolitter M2, M13, og dets to diastereomerer M13-1 og M13-2. Der var ingen signifikant forskel mellem den apoptotiske effekt [6] -shogaol og effekten af ​​M2 og M13 efter 6 timer behandling

Henvisning:. Zhu Y, Warin RF, Soroka DN, Chen H, Sang S ( 2013) metabolitter af Ginger Komponent [6] -Shogaol Remain Bioaktive i cancerceller og har lav toksicitet i normale celler: Kemisk syntese og biologisk evaluering. PLoS ONE 8 (1): e54677. doi: 10,1371 /journal.pone.0054677

Redaktør: Joseph J. Barchi, National Cancer Institute ved Frederick, USA

Modtaget: 24 oktober, 2012; Accepteret: December 13, 2012; Udgivet: januar 30, 2013 |

Copyright: © 2013 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver CA138277 og CA138277S1 til SS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af enorme bestræbelser mod at udvikle behandlinger mod kræft i løbet af de sidste mange årtier, kræft er stadig et stort problem for folkesundheden i hele verden. Stigende beviser har vist, at behandlinger ved hjælp af specifikke stoffer eller inhibitorer, der er målrettet kun en biologisk hændelse eller en enkelt vej normalt ikke i kræftbehandling [1]. Konventionelle kemoterapeutiske midler har vist sig at være forbundet med uacceptabel toksicitet. er kritisk behov for nye metoder til kontrol af kræft. Chemoprevention er en innovativ område kræftforskning, der fokuserer på forebyggelse af kræft gennem farmakologisk, biologisk, og ernæringsmæssige interventioner [2]. Akkumulerende undersøgelser har vist, at kosten fytokemikalier findes i planter og frugter, som generelt betragtes som ikke-toksiske midler, kan aktivere eller blokere flere vigtige veje, der er impliceret i kræft celle overlevelse og vækst [1], [3], [4] . Chemoprevention af spiselige fytokemikalier er nu anses for at være en sikker, billig, let acceptabel og tilgængelig tilgang til forebyggelse af kræft, kontrol og styring.

Ginger, rhizomet af

Zingiber officinale

, har været en almindeligt anvendt krydderi og medicinsk råmateriale i mange år over hele verden. Ingefær er kapret for sin lindring af kvalme, anti-inflammatoriske egenskaber, og formodede anticanceraktivitet [5] – [7]. De store farmakologisk aktive bestanddele af ingefær er gingerols og shogaoler (figur 1) [5]. Termisk behandling af gingeroler giver shogoals som de primære bestanddele af tørret ingefær [5], som ofte viser større anti-kræftfremkaldende aktivitet end deres forstadier. For eksempel vores gruppe viste, at [6] -, [8] – og [10] -shogaols udviste meget højere antiproliferativ styrke end [6] -, [8] – og [10] -gingerols mod H- 1299 human lunge og HCT-116 humane coloncancer-celler [8]. Kim

et al

. rapporterede, at [6] -shogaol udstillet meget stærkere væksthæmmende effekter i A-549 humane lunge kræftceller, HCT-15 humane colon cancerceller, SK-OV-3 humane ovariecancerceller og SKMEL-2 humane hud kræftceller end [ ,,,0],4] -, [6] -, [8] – og [10] -gingerols [9]. Sammen med vores samarbejdspartnere, har vi fundet, [6] -shogaol var mere effektivt end [6] -gingerol ved inhibering 12-

O

tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA) -induceret tumorpromotion i mus [10 ]. En nyere undersøgelse viste, at [6] -shogaol induceret apoptose, caspase aktivering, og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning i både SMMC-7721 humane hepatocellulært carcinom celler og SMMC-7721 tumorxenoplantater gennem en endoplasmatiske reticulum (ER ) stress-associeret mekanisme [11].

En nylig undersøgelse fra vores gruppe har vist, at [6] -shogaol metaboliseres i mus og i kræftceller, hvor tretten metabolitter (M1-M13 ) blev påvist og identificeret [12]. Trace mængde metabolitter M6-M12 blev oprenset fra fækale prøver indsamlet fra [6] -shogaol behandlede mus, og deres strukturer blev karakteriseret baseret på en analyse af

1 H,

13C, og 2-D NMR-data [12 ]. Strukturer af de resterende metabolitter (M1-M5 og M13) blev belyst ud fra en analyse af deres MS

n (n = 1-3) spektre og sammenligning med autentiske standarder. Med sin α, β-umættet keton struktur, fandt vi, at [6] -shogaol kan reduceres til frembringelse af metabolitter M6-M9 og M11. Vi fandt også, at [6] -shogaol er substrat for thiol konjugation gennem mercaptursyre vej til at danne metabolitter M1-M5, M10, M12, og M13. Da de fleste af [6] -shogaol metaboliseres

in vivo

i kræftceller, det kritiske spørgsmål er, om de metabolitter af [6] -shogaol er bioaktive. Selvom mindre potent end [6] -shogaol, kan de stadig bidrage til den samlede biologiske aktivitet af [6] -shogaol

in vivo

.

Den aktuelle udfordring at studere bioaktivitet af metabolitter er deres manglende kommercielle tilgængelighed. Med spormængder af metabolitter oprenset fra muse fækale prøver, var vi kun i stand til at undersøge virkningerne af de to hovedmetabolitter M9 og M11 på vækstinhibering og induktion af apoptose i humane cancerceller. Vores resultater viste, at M9 og M11 er bioaktive forbindelser, der kan inhibere væksten af ​​cancerceller og inducerer apoptose i humane lunge og colon cancerceller, omend med mindre styrke end [6] -shogaol. Derfor er det på tide at udvikle kemiske metoder til at syntetisere metabolitter af [6] -shogaol og yderligere undersøge deres anti-cancer aktiviteter. Den aktuelle undersøgelse beskriver en kemisk syntese af de tidligere identificerede metabolitter af [6] -shogaol og en bioaktivitet analyse i cancerceller. Også undersøgt er de toksiciteter af [6] -shogaol og dets metabolitter i normale humane lunge- og colon-celler, hvilket giver en sammenligning af [6] -shogaol toksicitet i en ikke-cancer model.

Resultater

kemisk syntese af metabolitterne af [6] -shogaol

Tolv metabolitter (M1, M2, og M4-M13) blev syntetiseret med succes fra [6] -shogaol hjælp af enkle og let tilgængelige semisyntetiske tilgange i det nuværende undersøgelse (figur 2 og 3). Kort fortalt omsætning af [6] -shogaol med L-cystein (Cys), N-acetyl-L-cystein (NAC) eller L-glutathion (GSH), genereret thiol-konjugater M2, M5 eller M13 henholdsvis (figur 2). Efterfølgende reduktion af thiol-konjugater M2 eller M5 af NaBH

4 førte til hydroxylerede konjugater M1 eller M4, henholdsvis (figur 2). Selektiv reduktion af [6] -shogaol ved en kombination af NaBH

4 og CeCl

3.7H

2O resulterede i M6 (figur 3) [13]. Hydrogenering af [6] -shogaol på Pd /C gav M11, efterfulgt af behandling med NaBH

4 til frembringelse M9 (figur 3). Desuden demethylering af M11 hjælp BBR

3 gav M8 (figur 3). Michael-reaktion af [6] -shogaol med NaOMe eller NaSMe produceret methoxy adduktet M7 eller methylthio adduktet M10 henholdsvis (figur 3) [14], [15]. Heraf blev methylthio adduktet M10 behandlet med NaBH

4, hvilket gav M12 (figur 3). Da både reduktion af keton og Michael-reaktioner i denne undersøgelse anvendte er ikke-stereoselektive, metabolitter M1, M2, M4-M7, M9, M10, M12, M13 og syntetiseres som blandinger af diastereomerer. Salg

Reagenser og betingelser:. i) L-cystein, NaHCO3 (cat), MeOH /H2O, rt, 24 h; ii) NaBH4, MeOH, 0 ° C, 2 timer; iii) N-acetyl-L-cystein, NaHCO3 (cat), MeOH /H2O, rt, 72 h.; . Iv) L-glutathion reduceres, NaHCO3 (cat), MeOH /H2O, rt, 3 timer

Reagenser og betingelser:. I) H2, Pd /C (10% vægt /vægt), THF, rt, 18 h; ii) BBr3, DCM, -78 ° C-Rt, 2 h; iii) NaBH4, MeOH, 0 ° C-Rt, 2 timer; iv) aq. 15% NaSCH3, THF, rt, 6 h; v) Na, MeOH, 0 ° C-Rt, 4 h; vi) NaBH4, CeCl3.7H2O, MeOH, -78 ° C, 30 min.

Vi har fuldt karakteriseret strukturerne af M5-M12 hjælp af deres 1-D og 2-D NMR og massespektralanalyse data i vores tidligere undersøgelse [12]. Derfor blev strukturerne af disse syntetiske forbindelser bekræftes ved sammenligning af deres

1 H og

13C NMR-spektre med de autentiske standarder opnået fra mus fækale prøver. Strukturer af de resterende syntetiske metabolitter (M1, M2, M4, og M13), der tidligere udledes af etapevis massespektrometri teknikker [12], blev yderligere bekræftet af deres 1-D og 2-D NMR-spektre data for første gang.

M2 viste den molekylære formel C

20H

31NO

5S på grundlag af positive APCI-MS ved

m /z

398 [m + H]

+ og dens

1 H og

13C NMR-data. Molekylvægten af ​​M2 var 42 masseenheder mindre end for N-acetylcystein konjugeret [6] -shogaol (M5) [12], som angiver M2 var cysteinet konjugeret [6] -shogaol. Dette var i overensstemmelse med det faktum, at M2 blev foretaget af [6] -shogaol og L-cystein. Dette blev også støttet af observation af fraværet af en acetylgruppe i

1 H og

13C NMR spektre af M2. Bindingen af ​​en L-cysteinyl-delen til [6] -shogaol rest ved C-5 blev etableret af HMBC tværgående toppe mellem H

Cys-β (δ

H 3,18 og 2,84) og C-5 ( δ

C 42,3) (figur 1). Derfor M2 blev bekræftet at være 5-cysteinyl- [6] -shogaol.

M1 havde molekylformlen C

20H

33NO

5S på grundlag af positive APCI-MS ved

m /z

400 [m + H]

+ og dens

1 H og

13C NMR-data. Molekylvægten af ​​M1 var 2 masseenheder højere end den for M2, matching med det faktum, at M1 var en keton-reducerede produkt af M2, og også støttet ved fremkomsten af ​​oxygenerede methiner (to sæt protoner for diastereomererne ved δ

H 3,66 og δ

H 3,90, og δ

C 69,3) i sit

1 H og

13C NMR spektre. Vigtige HMBC korrelationer mellem H-3 (δ

H 3,66 og δ

H 3,90) til C-1 (δ

C 32,5) og C-5 (δ

C 43,8), samt H-1 (δ

H 2,68 og 2,58) til C-3 (δ

C 69,3) i M1 (figur 1), indeholder hydroxylgruppe ved C-3 på alkylsidekæden af ​​M1. HMBC tværgående toppe mellem H

Cys-β (δ

H 3,15 og 2,85) til C-5 (δ

C 43,8), og H-5 (δ

H 2,94) til C

Cys-β (δ

C 32,8) billede bindingen af ​​cysteinyl del og C-5 position M1 gennem en thioetherbinding. Således blev M1 bekræftet at være 5-cysteinyl-M6.

M4 viste den molekylære formel C

22H

35NO

6S på grundlag af positive APCI-MS ved

m /z

442 [M + H]

+ og dens

1 H og

13C NMR-data. Molekylvægten af ​​M4 var 2 masseenheder højere end M5 (5-

N

-acetylcysteinyl- [6] -shogaol), som opfylder den omstændighed, at M4 var en keton-reducerede produkt af M5. Dette blev yderligere understøttet af fremkomsten af ​​iltede methiner (to sæt protoner for diastereomererne ved δ

H 3,70 og δ

H 3,88, og δ

C 69,3) i sit

1 H og

13C NMR-spektre, forsvinden af ​​den forventede keton carbonylgruppen i [6] -shogaol, og de centrale HMBC korrelationer observeret ved H-3 (δ

H 3,70 og δ

H 3,88) til C-1 ( δ

C 32,5) og C-5 (δ

C 43,8), samt H-1 (δ

H 2,67 og 2,58) til C-3 (δ

C 69.3) i sit HMBC spektrum (figur 1). Acetylgruppen blev vist fastgjort til a-NH

2 i cysteinyl del med HMBC korrelation påvist ved H

Cys-α (δ

H 4,54) til CH

3CO (δ

C 174,0). Desuden HMBC tværgående toppe mellem H

Cys-β (δ

H 3,00 og 2,80) og C-5 (δ

C 43,8) gav kobling af en acetylcysteinyl del og den C-5-stillingen af M4. M4, deraf blev bekræftet at være 5-

N

-acetylcysteinyl-M6.

M13, der har den molekylære formel C

27H

41N

3 O

9S på grundlag af positive APCI-MS ved

m /z

584 [m + H]

+ og dets NMR-data, blev foretaget af [6] -shogaol og reduceret L-glutathion (GSH) .

1 H-

1H COSY cross-toppe findes på H

Glu-α /H

Glu-β /H

Glu-γ, i kombination med centrale HMBC korrelationer mellem H

Glu-α (δ

H 3,65) til Glu α-COOH (δ

C 174,0) samt H

Glu-γ (δ

H 2,55 og 2,51) til Glu γ-CON ( δ

C 175,2), erkendte strukturen af ​​en glutamyl rest (Glu) (Figur 1). Strukturen af ​​cysteinylrest (Cys) blev oprettet ved

1H-

1H COSY cross-toppe ved H

Cys-α /H

Cys-β i kombination med HMBC korrelation mellem H

Cys-β (to sæt protoner ved δ

H 3,05-2,95 og 2,84-2,80) til Cys α-CON (δ

C 175,2) (figur 1). Efterfølgende blev forbindelsen af ​​glutamyl-rest med cysteinyl delen etableret mellem Glu γ-COOH og Cys α-NH

2 gennem en amidbinding, ved HMBC korrelationer findes på H

Cys-α (δ

H 4,50) til Glu γ-CON (δ

C 175,2). Fastgørelsen af ​​en glycinyl del til cysteinylrest blev fundet mellem Cys α-COOH og Gly α-NH

2, ved HMBC korrelationer observeret ved H

Gly-α (δ

H 3,80) til Cys α -CON (δ

C 175,2). Således blev GSH rest utvivlsomt identificeret som γ-glutamyl-cysteinylglycine. Følgelig binding af GSH-delen til [6] -shogaol rest blev etableret ved C-5 gennem en thioetherbinding ved HMBC korrelationer fundet hos H

Cys-β (to sæt protoner ved δ

H 3.05- 2,95 og 2,84 til 2,80) til C-5 (δ

C 42.2). Derfor M13 blev bekræftet at være 5-glutathiol- [6] -shogaol.

Separation af M13 isomerer på præparativ HPLC resulterede i to diastereoisomere, M13-1 og M13-2, som havde meget ens

1H og

13C-NMR-spektre. De store forskelle var den

1H signaler for H

Cys-pB (δ

H 2,73 i M13-1 vs. 2,81 i M13-2) og H-4a (δ

H 2,76 i M13 -1 vs. 2,70 i M13-2) og

13C signaler for C-4 (δ

C 49,9 i M13-1 vs. 49,6 i M13-2) og C-5 (δ

C 42.0 i M13-1 vs. 42,4 i M13-2) (figur 4). I deres NOESY spektre, observerede vi korrelationerne mellem H

Cys-pB (δ

H 2,73) og H-5 (δ

H 3.10) i M13-1 og H

Cys-βa ( δ

H 2,97) og H-5 (δ

H 3.10) i M13-2, hvilket antyder, at H-5 i M13-1 havde den samme konfiguration som den i H

Cys-pB og H- 5 i M13-2 havde den samme konfiguration som den i H

Cys-βa (figur 4). Det vides, at H

Cys-α i GSH rest har

R

konfiguration (figur 4). Koblingen konstant (

J

= 5,0 Hz) af H

Cys-βa (δ

H 2,97) med H

Cys-α (δ

H 4,49) er meget mindre end (

J

= 8,7 Hz) af H

Cys-pB (δ

H 2,81) med H

Cys-α, hvilket tyder på, at H

Cys-βa (δ

H 2,97) har den samme

R

konfiguration som for H

Cys-α og H

Cys-pB har

S

konfiguration. Derfor blev konfigurationer af H-5 i M13-1 og M13-2 forsøgsvis tildelt som

S

og

R

henholdsvis (figur 4).

væksthæmmende effekter mod human kræft og normale celler

To menneskelige kræftceller, HCT-116 og H-1299, blev behandlet med [6] -shogaol eller dets syntetiske metabolitter M1, M2, og M4-M13 , med koncentrationer i området fra 0 til 80 uM. Cell levedygtighed analyser udnytte MTT resulterede i otte aktive metabolitter, M2, M5, M6, M8-M11 og M13, mod tyktarmskræft celler HCT-116, med IC

50 værdier på 24,43, 54,26, 68,77, 58,76, 82,22, 78.16, 83,97 og 45.47 uM (figur 5), og otte aktive metabolitter, M2, M5, M6, og M9-M13, i lungecancerceller H-1299 med IC

50 værdier på 25,82, 72,62, 61,28, 82,50, 60,63, 66,50, 69,91, og 47,77 uM (figur 6). Blandt dem, M2, cysteinet konjugeret metabolit af [6] -shogaol, viste sig at være mest potente mod både HCT-116 og H-1299 celler med IC

50 værdier på 24,43 og 25,82 uM, som var sammenlignelig til den forælder [6] -shogaol, med en IC

50 af 18,20 uM i HCT-116 celler og en IC

50 af 17,90 uM i H-1299 celler. Den anden mest aktive metabolit var 5-glutathionyl- [6] -shogaol (M13), med IC

50 værdier på 45.47 og 47.77 uM i HCT-116 og H-1299-celler. 5-

N

-acetylcysteinyl- [6] -shogaol (M5) også udstillet mærkbar bioaktivitet med IC

50 værdier på 54,26 uM i HCT-116 celler og 72,62 uM i H-1299 celler. Denne metabolit imidlertid vist nedsat aktivitet i sammenligning med den for 5-cysteinyl- [6] -shogaol (M2), hvilket antyder acetyleringen på α-NH

2 i cysteinyl delen formindsker aktiviteten af ​​M2. Endvidere reduktion af en ketongruppe på alkylsidekæden resulterede i ringe til ingen aktivitet mod cancerceller HCT-116 og H-1299 som observeret fra M1 og M4 versus M2 og M5, samt M6, M9, og M11 versus [6] -shogaol, med angivelse af reduktive biotransformation af [6] -shogaol og dets metabolitter primært inaktivering.

Bar

, standardafvigelse (n = 6).

Bar

, standardafvigelse (n = 6).

Bedømmelse af cytotoksicitet i humane normale fibroblast kolon celler CCD-18Co og menneskelige normal lungeceller IMR-90 viste, at alle syntetiske metabolitter (M1, M2, og M4-M13) var mindre toksiske end forælder [6] -shogaol, og de fleste af dem havde lidt til ingen inhibitorisk virkning (figur 5 og 6), hvilket indikerer en afgiftende metabolisk biotransformation af [6] -shogaol. Vigtigere, metabolitten M2, der har den største styrke mod både HCT-116 og H-1299 cancerceller, viste næsten ingen toksicitet over normale colonceller CCD-18Co og normale lungeceller IMR-90 med IC

50 værdier på 99,18 og 98,30 uM, sammenlignet med dem af forælder [6] -shogaol med en IC

50 af 43.91 pM mod normal colon cellelinie CCD-18Co og en IC

50 af 36,65 pM mod normal lunge cellelinie IMR -90. Desuden M13, med IC

50 værdier på 75,50 og 57,54 uM mod celler CCD-18Co og IMR-90, henholdsvis vises også lavere toksicitet i forhold til forælder [6] -shogaol.

For at undersøge indflydelsen af ​​stereokemi på aktivitet, metabolit M13, som en blanding af diastereomerer blev adskilt ved omvendt fase prep-HPLC i to individuelle isomerer, M13-1 og M13-2. Cancerceller HCT-116 og H-1299 blev behandlet med M13 eller dens stereoisomerer (M13-1 og M13-2) individuelt, med koncentrationer i området fra 0 til 80 uM. Vi fandt begge isomerer havde lignende, men lidt mindre aktivitet end M13, og M13-2 at være lidt mere effektivt end M13-1, med en IC

50 værdi på 54.90 uM i HCT-116-celler og 63,77 uM i H-1299 celler, versus 71,20 um og 74,39 uM i de samme respektive cellelinier (figur 7). Rekonstitueret M13 af enkeltpersoner M13-1 og M13-2 med et omtrentligt forhold på 01:02 (molær /molær), som svarer til forholdet i original M13, vises den tilsvarende aktivitet, med IC

50 værdier på 46,46 pM i HCT-116-celle og 41,98 uM i H-1299 celle, sammenlignet med den oprindelige M13 med IC

50 værdier på 45.47 pM i HCT-116-celler og 47.77 uM i H-1299 celler. Dette antydede, at den observerede vækst hæmmende effekt af M13 ikke kunne tilskrives den ene isomer eller den anden.

Bar

, standardafvigelse (n = 6).

M2 og M13 inducere apoptose i humane cancerceller

i mange tilfælde celledød er resultatet af aktiveringen af ​​de store lovgivningsmæssige vej kaldes apoptose, eller programmeret celledød. Vi havde til formål at bestemme, om apoptose blev udløst efter udsættelse for [6] -shogaol og dets metabolitter ved hjælp af en TUNEL-assay, som detekterer DNA-brud karakteristisk for celler, der undergår apoptose. I denne undersøgelse testede vi de to mest aktive metabolitter mod cancercellevækst, M2 og M13, såvel som en af ​​de mest udbredte metabolitter, M6, sammen med [6] -shogaol. Vi inkuberede H-1299 og HCT-116 celler med dem i forskellige koncentrationer for at bestemme den aktive område af disse forbindelser versus DMSO alene. Resultaterne er opsummeret i figur 8. Efter 24 timers inkubation, havde metabolit M6 ikke udviser nogen apoptotisk virkning i HCT-116 og H-1299 cellelinier. Signifikant apoptose blev observeret for M2 og M13 i begge cellelinier, bortset fra M2 i H-1299 celler for 20 pM koncentration. Induktionen af ​​apoptose efter [6] -shogaol var signifikant overlegen i forhold til både M2 ​​og M13 ved samme koncentration (20 uM). I H-1299 celler, [6] -shogaol kunne opnås en tilsvarende apoptotisk virkning hvis koncentrationen af ​​M2 og M13 var to gange (40 uM) end [6] -shogaol. Lignende resultater blev opnået i HCT-116 celler, bortset fra, at M2 apoptotiske induktion var signifikant højere ved 40 uM. I alle cellelinjer, en stigning i koncentrationen af ​​[6] -shogaol, M2, M13, M13-1, M13-2 eller M6 gav en tilsvarende stigning i apoptotisk niveau i kræftceller (figur 8A og 8B).

TUNEL positive celler er blevet observeret ved 400X magt. 10 felter pr slide er blevet talt og gennemsnit.

Bar

, standard fejl; o, ikke signifikant; +, P 0,05; *, P 0,01; **: P 0,0001. Alle statistiske tests er uparret Student t-test, to tailed, sammenlignet med DMSO eller tilsvarende [6] -shogaol koncentration.

For at afgøre, om den apoptotiske effekt observeret i figur 8A og 8B var konstant over tid, vi inkuberes [6] -shogaol, M2 og M13 i HCT-116 celler for kun 6 timer (figur 8C). Efter 6 timers inkubation med [6] -shogaol eller metabolitter M2 eller M13, var vi i stand til at opdage betydeligt højere niveauer af apoptose for alle 3 forbindelser sammenlignet med DMSO i HCT-116 celler. Interessant var der ingen signifikant forskel mellem den apoptotiske virkning af [6] -shogaol og virkningerne af M2 ved 20 og 40 pM og M13 ved 40 uM. M13 var signifikant mere potent end [6] -shogaol ved 20 uM. Eksponering af HCT-116 celler til M13 isomerer M13-1 og M13-2 viste også en højere grad af apoptose, men isomererne ‘apoptotisk virkning var signifikant ringere sammenlignet med [6] -shogaol for begge anvendte koncentrationer. Disse resultater viser, at apoptose udløses af [6] -shogaol metabolitter M2, M13, M13-1 og M13-2, og er den mekanisme ansvarlig, i det mindste delvist, for celledød observeret tidligere.

Diskussion

det er nu godt accepteret, at naturlige forbindelser giver mulighed for at blande sig i tidlige stadier af kræft eller forhindre dens udvikling helt [16]. Men disse forbindelser har deres begrænsninger, såsom hurtig

in vivo

omsætning, begrænsede mængder i fødevarer, og deres eventuelle toksicitet ved højere doser [17]. Det er bemærkelsesværdigt, at anti-cancer effekt for disse forbindelser kan observeres i kohortestudier trods en kort halveringstid og hurtigt metabolisme når de indtages [18]. Ofte kan tilstedeværelsen af ​​forbindelsen kun vurderes ved kvantificering af metabolitter, antyder, at disse metabolitter findes i kroppen i en vis tid og potentielt interagere med biologiske processer [19]. Følgelig ene hypotese forklarer bioaktiviteten af ​​naturlige forbindelser er, at metabolitterne selv fastholde og bære en del af eller hele den oprindelige forbindelses bioaktivitet. Nærværende undersøgelse udforskede denne mulighed med [6] -shogaol, den vigtigste komponent i tørret ingefær, og dets metabolitter.

Vores tidligere undersøgelse har vist, at [6] -shogaol udstrakt metaboliseres i mus og i cancerceller og mere end 90% af [6] -shogaol omdannes til dets metabolitter [12]. Vi bemærkede også, at human normal celle IMR-90 til en vis grad metaboliseres [6] -shogaol på lignende måde at cancerceller (data ikke vist). Som et resultat, kan hurtig metabolisme af [6] -shogaol giver mulighed for sine stabile nedbrydningsprodukter at blive involveret i biologiske processer, hvis de besad bioaktiviteter. For at verificere denne hypotese, er det afgørende at opnå metabolitterne i en stabil form. Isolation fra deres native miljø ville ikke være praktisk og sandsynligvis ikke ville give de mængder, der kræves for eksperimentel biologi. En kemisk syntese er meget mere ønskeligt, reproducerbar og effektiv. Vi har renset M6-M12 i meget begrænsede mængder (0,5-17 mg) fra fækale prøver indsamlet fra [6] -shogaol behandlede mus [12]. For at have tilstrækkelig mængde til yderligere at undersøge bioaktiviteten af ​​[6] -shogaol metabolitter, beskriver vi de kemiske trin der tillader syntesen af ​​de primære metabolitter af [6] -shogaol i denne undersøgelse. Tolv metabolitter af [6] -shogaol (M1, M2, og M4-M13) blev syntetiseret med succes af praktisk anvendelige metoder. Strukturerne af syntetiske metabolitter blev verificeret under anvendelse af 1-D og /eller 2-D NMR data samt massespektre.

Vi sammenlignede væksthæmmende effekter af de syntetiske metabolitter med [6] -shogaol i to humane cancerceller og to humane normale celler. Vores resultater viste, at to metabolitter, M2 og M13, besad de mest sammenlignelige væksthæmmende effekter til [6] -shogaol mod kræftceller. Vigtigst er det, M2 udstillet en diskriminerende virkning, da det ikke synes at være toksisk over for normale celler. Denne effekt blev ikke påvist med [6] -shogaol. M13 viste også mindre toksiske virkninger over for normale celler sammenlignet med [6] -shogaol. Desuden M5, M6 og M8-M12 havde også visse potens mod vækst af cancerceller, men viste ingen toksicitet over normale celler med IC

50 værdier større end 100 pM (figur 5 og 6). Vores resultater viser tydeligt, at metabolitter af [6] -shogaol forblive bioaktive mod kræftceller, men er langt mindre toksiske end [6] -shogaol til normale celler. Dette bekræfter vores hypotese om, at metabolitterne selv fastholde og bære en del af eller hele den oprindelige forbindelses bioaktivitet.

Apoptose er en mekanisme ofte ansvarlige for induktionen af ​​celledød som respons på interne eller eksterne stress. For at få indsigt i virkningsmekanismen af ​​metabolitterne, vi udførte en TUNEL assay i HCT-116 celler ved hjælp af M2, M6, M13 og dens to isomerer, M13-1 og M13-2 og sammenlignet deres aktiviteter til den i [ ,,,0],6] -shogaol. Den viste, at både M2 ​​og M13, men ikke M6, er i stand til at inducere cancercelle apoptose i både HCT-116 human colon cancerceller og H-1299 humane lungecancer-celler (figur 8A og 8B). For M13, apoptose induktion kunne ikke fast tilskrives en isomer eller det andet, hvilket antyder, at stereo konfiguration er ikke vigtig for bioaktiviteten af ​​denne forbindelse. Vi observerede, at både M2 ​​og M13 kunne udløse apoposis i HCT-116-celler på et niveau svarende til den i [6] -shogaol ved 6 timers tidspunktet (figur 8C). Men efter 24 timers eksponering for metabolitterne, procentdelen af ​​TUNEL-positive celler var for det meste uændret på 20 uM for både M2 ​​og M13, mens effekten af ​​[6] -shogaol blev bemærkelsesværdigt forøget. Induktionen virkning M2 på apoptose ved en koncentration på 40 uM steget dramatisk efter 24 timers tidspunktet sammenlignet med de 6 timers tidspunktet, hvilket var betydeligt højere end den for M13 ved en 40 uM koncentration. Vi observerede også en koncentrationsafhængig virkning [6] -shogaol og metabolitter på cancercelle apoptose, hvor en stigning i koncentration af en forbindelse resulterede i en tilsvarende forøget procentdel af apoptotiske celler. Tilsammen disse resultater antyder, at det er sandsynligt, at aktiveringen af ​​andre mekanismer er involveret i udløsning cancercelledød synes imidlertid apoptose at være en af ​​de største aktiverede veje til [6] -shogaol metabolitter at inducere celledød.

Det er altid en udfordring at adskille stereoisomerer. Blandt alle de syntetiserede metabolitter, M13 var den eneste diastereomere blanding, vi var i stand til at adskille ved hjælp af ikke-chiral præparativ HPLC-kolonne. Vores resultater viste, at M13 som blandingen af ​​M13-1 og M13-2 havde lidt bedre væksthæmmende virkning på kræftceller end de to diastereomere alene og M13-1 og M13-2 havde lignende aktivitet, selvom M13-2 var lidt mere potent end M13-1. Hvad vigtigere er, vi observere M13 som metabolit af [6] -shogaol i form af en blanding af M13-1 og M13-2 i HCT-116 humane coloncancer-celler (data ikke vist). Det ville være hensigtsmæssigt at adskille de to diastereomerer af M2, den mest aktive metabolit af [6] -shogaol, under anvendelse af en chiral søjle og yderligere bestemme virkningen af ​​stereokonfigurationen på aktiviteten af ​​denne forbindelse i fremtidige undersøgelser. Vi har for nylig identificeret M2 som en metabolit af [6] -shogoal hos mennesker (upublicerede data). Således er det vigtigt at fastslå, om M2 eksisterer som en blanding af to diastereomerer i mus og i mennesker.

Som konklusion den foreliggende undersøgelse tilladt os at vise, at metabolitter af [6] -shogoal kan redegøre for den bioaktivitet af stamforbindelsen, og specifikt udløser molekylære veje, der er ansvarlige for kræft celledød på en tilsvarende måde. Det tyder på, at anti-cancer aktivitet tilskrives forbindelser, såsom [6] -shogoal kunne have været delvist fordrejet i fortiden. Hvad blev oprindeligt anset for at være en virkning af naturlig forbindelse kunne have været det direkte resultat af en hurtig metabolisme af forbindelsen, som gør dem mindre i stand til at udløse molekylære mekanismer. Imidlertid ville genfærd af dets metabolitter i målvæv derefter supplere, opretholde eller erstatte helt det bioaktive virkning af den oprindelige forbindelse. Supplerende

in vivo vil være behov

undersøgelser for at få et endeligt svar på det spørgsmål, men allerede nu undersøgelsen præsenteres her åbner nye forskningsmuligheder til undersøgelse af bioaktive metabolitter af [6] -shogaol.

Materialer og metoder Salg

Materialer

[6] -Shogaol blev oprenset fra ingefær ekstrakt i vores laboratorium [8].