PLoS ONE: Sammenligning af IHC, FISH og RT-PCR metoder til påvisning af ALK Omlejringer i 312 ikke-småcellet lungekræft Patienter i Taiwan

Abstrakt

Baggrund

For nylig pighuder microtubule- associeret protein-lignende 4- anaplastisk lymfom kinase (

EML4-ALK

) fusionsgenet er blevet en vigtig biomarkør for ALK-tyrosinkinaseinhibitoren (crizotinib) behandling i NSCLC. Men den bedste afsløring metode og betydningen af ​​

EML4-ALK

varianttyper fortsat usikre.

Metoder

Reverse transcriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og immunhistokemisk (IHC) plet blev udført på tumorvæv af 312 NSCLC patienter til påvisning af

ALK

omlejringer. Mutation analyser for

EGFR

KRAS

gener blev også udført.

Resultater

Tretten af ​​de 312 patienter (4,17%) havde

ALK Salg omlejringer detekteret ved RT-PCR. Hvis RT-PCR-data blev anvendt som guldstandarden, FISH tests havde en lav følsomhed (58,33%), men meget god specificitet (99,32%). IHC plet havde bedre følsomhed (91,67%) end fisk, men lavere specificitet (79,52%), når det afskårne off var IHC2 +. Alle de 8 patienter med høj overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv (vurderes af de signalintensiteter i RT-PCR-produkt), blev også har høj ekspression af ALK-protein (IHC3 +), og positiv for FISH, undtagen én mislykkedes i FISH. Varianter 3a + 3b (4/5, 80%) af

EML4-ALK

fusion gen blev mere almindeligt at have høj overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv end variant 1 ( 1/3, 33,3%). Meta-analyse af de offentliggjorte data for 2273 NSCLC patienter viste, at variant 3 (23/44, 52,3%) var den mest almindelige type i kinesiske befolkning, mens variant 1 (28/37, 75,7%) var mest almindelig i Kaukasus.

konklusioner Salg

Blandt de tre påvisningsmetoder, kunne RT-PCR, ikke blot at påvise tilstedeværelsen af ​​

EML4-ALK

fusionsgen og deres varianttyper, men også den overflod af

EML4-ALK

positive celler i NSCLC tumorvæv. De to sidstnævnte faktorer kan påvirke behandlingen reaktion på anti-ALK-hæmmer. anbefales herunder RT-PCR som en diagnostisk test for ALK-inhibitor behandling i det prospektive kliniske undersøgelser

Henvisning:. Wu Y-C, Chang I-C, Wang C-L, Chen T-D, Chen Y-T, Liu H-P, et al. (2013) Sammenligning af IHC, FISH og RT-PCR metoder til påvisning af

ALK

Omlejringer i 312 ikke-småcellet lungekræft Patienter i Taiwan. PLoS ONE 8 (8): e70839. doi: 10,1371 /journal.pone.0070839

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada og University of Ottawa, Canada

Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: Juni 24, 2013; Udgivet: 7. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Health Research Institutes (NHRI-A1-MG-100-PP-04, NHRI-A1-MG-101-PP-04), og National Science Council (NSC97-2320-B-400-006- MY3) til Dr. Shiu-Feng Huang. Den fluorescens in situ hybridisering (FISH) undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Pfizer (WS2084622) for Dr. Yi-Cheng Wu. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Vi har følgende interesser: fluorescens in situ hybridisering (FISH) undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Pfizer (WS2084622) for Dr. Yi-Cheng Wu. Pfizer i Taiwan kom til at besøge vores team i år 2011 for at støtte en undersøgelse af ALK omlægning i NSCLC patienter i Taiwan, hvilket var vigtigt for dem, da disse data stadig mangler i Taiwan (data fra Kina og Hong Kong er blevet offentliggjort i år 2010 og 2009, henholdsvis). De ønskede at støtte en undersøgelse, der kan omfatte mere end 300 NSCLC patienter (naive at ALK-hæmmer behandling) og herunder FISH påvisningsmetode. De primært ønskede at vide forekomsten af ​​ALK omrokeringer i NSCLC patienter i Taiwan. Pfizer meddelte, at de ikke ville blande sig med studiet design, metoder, resultater og fremtidige udgivelser. Ved udgangen af ​​den støtte, tilskud, vi behøver kun at indsende en kort rapport om undersøgelsens resultater, som var magen til andre finansieringskilder. Således besluttede vi at acceptere denne bevilling fra Pfizer efter denne aftale. I slutningen af ​​2012 har vi indsendt en to-side kort resumé rapport til Pfizer på tid (slutningen af ​​støtte tilskuddet), som kun omfattede de rå data. Efter det, behøver vi ikke at give yderligere oplysninger til Pfizer. Dr. Shiu-Feng Huang er inviteret som medlem af Pfizers rådgivende udvalg i NSCLC studiet i Taiwan. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

lungekræft, især ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) har været den førende årsag til kræft dødsfald i verden, og patienten antal er stadig stigende [1,2]. Den store succes for målrettet behandling med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) -tyrosin kinase inhibitor (TKI): gefitinib og erlotinib, til behandling af lunge adenocarcinom har gjort målrettet terapi blevet den mest populære modalitet til større menneskelige kræftformer [3-7]. Søgning efter andre end EGFR i lungekræft behandling nye og effektive mål har ikke været en succes indtil år 2007, hvor Soda, et al identificeret pighuder microtubule- protein-lignende-4 og anaplastisk lymfom kinase (

EML4-ALK

) fusion gen med at omdanne evne i NSCLC patienter [8]. ALK-protein er et 200kDa receptortyrosinkinase. Dens signal vej involverer celleproliferation, differentiering og anti-apoptose [8,9]. Før identifikation af

EML4-ALK

fusion gen,

nucleophosmin

–

ALK Hotel (NPM-ALK) fusion genet blev først identificeret i anaplastisk storcellet lymfom [10]. Forskellige kombinationer af ALK med andre proteiner er blevet opdaget i forskellige neoplasmer, såsom diffust storcellet B-celle lymfom, inflammatorisk myofibroblastisk tumor, neuroblastom, pladecellecarcinom af spiserøret, og renalcellecarcinom [11-13]. Men den

EML4-ALK

fusion gen er unik for NSCLC [14]. ALK er nu anerkendt som en vigtig onkogen driver i NSCLC. Multiple

EML4-ALK

varianter i NSCLCs er blevet identificeret, alle indeholde det samme C-terminale kinasedomæne, og bibringe gain-of-function egenskaber [14]. Selvom

EML4

gen er den fremherskende fusionspartner af

ALK

i NSCLC, andre fusionspartner gener også er blevet identificeret, som omfattede

KIF5B-ALK, KLC1-ALK og TFG-ALK Salg fusionsgener [15-18]. Flertal af

ALK

omlejringer blev identificeret i adenocarcinom og ikke-rygere [8,14,18-28]. Forekomsten af ​​

EML4-ALK

fusion gen i NSCLC var omkring 1,4-11,6% med ingen signifikante forskelle mellem asiatiske og vestlige lande [8,14,18-28]. Mens

EML4-ALK

fusion blev identificeret i NSCLC, en ny ALK tyrosinkinasehæmmer (ALK-TKI): blev crizotinib udviklet på samme tid. Dette stof oprindeligt var udformet som en MET-tyrosinkinaseinhibitoren til behandling af NSCLC-patienter, men det viste sig at være en ALK-inhibitor, også. Således blev prospektive kliniske forsøg designet og hurtigt i gang på NSCLC patienter med

EML4-ALK

fusion gener. Det kliniske fase II studie blev offentliggjort i 2010, som viste dramatiske respons og længere progressionsfri overlevelse at crizotinib behandling af patienter med

EML4-ALK

fusion gen [29-31], svarende til EGFR-TKI på NSCLC patienter med

EGFR

mutationer [3-7]. Crizotinib blev godkendt af Food and Drug Administration (FDA) i USA i år 2011 for behandling af NSCLC patienter, og med en kammerat diagnostisk test, den Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit, som kunne hjælpe med at bestemme, om en patient har unormal

ALK

gen [32].

EML4-ALK

fusion gen bliver en ny vigtig molekylær markør for crizotinib behandling i NSCLC patienter. Men den bedste påvisningsmetode for

EML4-ALK

fusion gen stadig kontroversielt. Teoretisk, revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) er to standard metoder til påvisning af fusionsgener, men begge har store begrænsninger i klinisk praksis. RT-PCR kræver friske frosne vævsprøver til udvinding af RNA, og en pålidelig FISH analyse kræver god fluorescens omfang og teknisk ekspertise. Immunhistokemiske (IHC) plet til påvisning af ALK overekspression har været en veletableret metode til påvisning af

ALK

omrokeringer, såsom NPM-ALK, i blodkræftsygdomme årevis [33,34]. Da omkostningerne ved IHC pletten assay er meget lavere end for FISH-assayet, kunne IHC pletter være en langt mere bekvem og omkostningseffektiv screeningsmetode til

ALK Salg omlejringer i NSCLCs, sammenlignet med fisk eller RT-PCR . Men følsomheden af ​​IHC pletten forblev kontroversiel. Mange forskergrupper rapporterede gode korrelationer mellem IHC pletten og FISH til påvisning af

EML4-ALK

fusion gen [16,35-38], men nogle rapporterede, at IHC pletten var ikke-følsomme i påvisning af

EML4 alk

fusionsgen [25,39-41]. Det ville være mest ideelt at udføre alle tre metoder (IHC, FISH og RT-PCR) i en stor serie af NSCLC tumorer til direkte sammenligning af deres effektiviteter.

Tidligere har vi rapporteret en god sammenhæng mellem IHC plet for ALK og RT-PCR undersøgelse til identifikation af

EML4-ALK

fusionsgener i 64 NSCLC patienter [42]. Vi har udvidet vores undersøgelse til 312 NSCLC patienter og udførte alle tre metoder (IHC, FISH, og RT-PCR) til direkte sammenligning af sensitivitet og specificitet.

Resultater

ALK

omlejring detekteret ved RT-PCR

klinik-patologiske egenskaber ved de 312 patienter er vist i tabel S1. Blandt de 312 patienter inkluderet for RT-PCR undersøgelse, tretten patienter (13/312, 4,17%), tre mandlige (en var aldrig ryger) og ti kvindelige (syv blev aldrig rygere), viste sig at have

ALK

omlejring. Tolv havde

EML4-ALK

fusion gen og én havde

KIF5B-ALK

fusion gen. De patologiske diagnoser var adenocarcinomer (ADC) i elleve patienter, pladecellecarcinom (SCC) i en patient, og adenosquamøst carcinoma (ADSC) i en patient. Ingen af ​​de 13 patienter havde co-eksisterende

EGFR

eller

KRAS

mutationer. Forekomsten af ​​

ALK

omlægning i EGFR-vildtype, ikke-SCC patienter var 12% (12/100).

KLC1-ALK

, og

TFG-ALK

fusionsgener blev ikke identificeret. Blandt de 12 patienter med

EML4-ALK

fusion gen, tre var varianten 1, en var variant 2, fem var variant 3a + 3b med 3b fremherskende, to var variant 3a, og en var variant 3b.

ALK

omlægning kun var signifikant associeret med kvindelige køn (P = 0,0248) ved univariat analyse. Selvom flertallet (8/13, 61,5%) af patienterne med

ALK

omlægning var i fase I, og ingen var i stadie IV, foreningen med tumor etape var statistisk ikke-signifikant (p = 0,5740). Multivariat analyse for foreningen med fem klinisk-patologiske karakteristika, dvs. køn, alder, rygning historie, histologi typer og tumor fase, blev udført af binær logistisk regression test. Ud over kvindelige køn (p = 0,007), også ikke-ryger blev signifikant associeret med

ALK

omrokeringer (p = 0,022), da der var en stor forskel i rygning sats mellem mandlige og kvindelige patienter (aldrig rygere var 38% hos mandlige versus 94,4% i kvindelig, s 0,0001). Tumoren fase forblev ikke signifikante. De P-værdier for hver etape var: Fase I: P = 0,6220, fase II: P = 0,4040, Stage III: P = 0,6190, og trin IV: P = 0,9990, henholdsvis

ALK

omlejring bestemt ved FISH

Blandt de 312 patienter, blev FISH undersøgelser ikke udføres på to patienter, eftersom ingen rest tumorvæv kunne findes i paraffinsnit. FISH undersøgelser mislykkedes i yderligere 5 patienter. Som følge heraf var tilgængelige FISH analysedata i alt 305 patienter. Ni patienter (9/305, 2,95%) var positive ved pause fra hinanden FISH undersøgelse. Alle af dem havde adenocarcinom. En var mandlig patient (nuværende ryger), og otte var kvindelige patienter (to var nuværende rygere). Kun 7 af de 9 patienter var også RT-PCR (+).

ALK proteinekspression opdaget af IHC pletten

I alt 310 patienter havde succes IHC plet til påvisning af ALK proteinekspression, siden 2 patienter uden tumor del i vævssnit blev udelukket. Alle de 78 patienter med negativ IHC plet var RT-PCR (-) og FISH (-). For de 159 patienter med IHC 1+, kun en patient var RT-PCR (+), men FISH (-), det var den eneste SCC positive for RT-PCR. For de 61 patienter med IHC 2+, tre patient var RT-PCR (+), men FISH (-), og én patienter var RT-PCR (-), men FISH (+). For de 12 patienter med IHC 3+, ni var RT-PCR (+). Syv af dem var også FISK (+), som omfattede den eneste patient med

KIF5B-ALK

fusion gen (figur S1). En anden var FISH (-) og den sidste mislykkedes i FISH. For de resterende 3 patienter med IHC3 + og RT-PCR (-), den ene var FISH (+) (figur S2), den ene var FISH (-), og én mislykkedes i FISH. Sidstnævnte 2 patienter havde også EGFR-mutationer.

EGFR mutation analyser

Blandt de 312 NSCLC patienter,

EGFR

mutation sats var 43,91% (137/312). Alle var ikke-SCC, som omfattede 133 ADC og 4 ADSC.

EGFR

mutation sats i ikke-SCC patienter var 57,81% (137/237). For ikke-SCC patienter,

EGFR

mutationer blev kun signifikant associeret med aldrig rygere (p = 0,0002), men ikke med alder eller køn. Ingen af ​​patienterne havde samtidig eksisterende

ALK

eller

KRAS

mutationer.

KRAS mutation analyser

Blandt de 312 NSCLC patienter,

KRAS

mutation sats var 5,77% (18/312), som omfattede 16 adenocarcinomer og to adenosquamøst karcinomer. Mutationen sats i ikke-SCC var 7,59% (18/237). Tolv patienter var mænd (10 var rygere) og 6 var kvinder (ingen var rygere).

KRAS

mutationer blev kun signifikant associeret med histologi typen (ikke-planocellulært karcinom) (p = 0,0091).

Sammenligning af de tre metoder til påvisning

I alt 305 patienter havde data for alle tre metoder til påvisning (RT-PCR, FISH og IHC) for direkte sammenligning. Resultaterne er vist i tabel S2. Undersøgelsens resultater af alle 17 patienter positive for enten RT-PCR, eller FISH eller høj ALK-ekspression blev opsummeret i tabel S3. De histologiske karakteristika for alle 17 patienter blev revideret. Alle adenokarcinomer positive for ALK var sammensat af blandede histologiske mønstre.

Specificiteten og følsomheden af ​​FISH og IHC henhold til RT-PCR-data

Hvis RT-PCR resultater blev anvendt som den gyldne standard for ALK omlejring, og cut-off for ALK-proteinekspression var IHC 2+, følsomheden og specificiteten af ​​IHC var 91,67% og 79,52%, henholdsvis. Den positive prædiktive værdi af IHC kun var 15,49%, og den negative forudsigelse værdi var 99,57%. Hvis cut-off var IHC 3+, følsomheden og specificiteten af ​​IHC var 66,67% og 99,32%, henholdsvis. Den positive prædiktive værdi af IHC var 80,00%, og den negative forudsigelse værdi var 98,64%. For FISH-test, selvom dens følsomhed var kun 58,33%, specificiteten var meget høj (99,32%). Den positive prædiktive værdi af fisk var 77,78%, og den negative forudsigelse værdi var 98,31%.

Vurdering af den overflod af EML4-ALK-positive celler i tumorvæv ved RT-PCR

Den overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv blev vurderet i henhold til de intensiteter af RT-PCR-produkter på gelelektroforese. Resultatet af hver tumor blev sammenlignet med FISH og IHC data (tabel S3). Otte af de 13 RT-PCR (+) tumorer havde stærk intensitet RT-PCR-produkter, der foreslog høj overflod

af EML4-ALK

positive celler i tumorvæv. Alle disse 8 patienter var IHC 3+, og FISH (+), undtagen én mislykkedes i FISH undersøgelse. For de 5 patienter med svag intensitet RT-PCR-produkter, som foreslået lav overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv, alle af dem var FISH (-) og kun én var IHC 3+. Sidstnævnte var en tumor tilhørte Variant 3a + 3b. Repræsentative sager blev vist i figur S3. Sammenlignet med data varianttypen, høj overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv var mere almindelige i Variant 3a + 3b (4/5, 80%) end Variant 1 (1/3, 33,3 %) (tabel S3).

Meta-analyse af etnicitet og variant typer er forbundet med

EML4-ALK

fusion gen

Meta-analyse af atten studier (herunder nærværende undersøgelse), der havde udført RT-PCR undersøgelse til påvisning af

EML4

–

ALK

fusion gen blev udført, og vist i tabel S4 og tabel S5 [8,15,16,18- 28,40,41,43]. Blandt de 2273 NSCLC patienter med tilgængelige etnicitet og varianttype data for

EML4

–

ALK

fusion gen, Variant 3 (23/44, 52,3%) var den mest almindelige type i kinesiske befolkning, mens Variant 1 (28/37, 75,7%) var mest almindelige i Kaukasus. Forskellen var statistisk signifikant for både Variant 1 (p = 0,0000) og variant 3 (p = 0,0020). Med hensyn til japanske patienter, Variant 1 (11/33, 33%) var også de mest almindelige varianter, men det var ikke så dominerende som i Kaukasus.

Diskussion

I denne undersøgelse, forekomsten af ​​

ALK

omlejringer i NSCLC-patienter i Taiwan var ret lav (4,17%) i overensstemmelse med RT-PCR-resultater. For

EGFR

-Wild type, ikke-SCC patienter, var det 12% (12/100).

ALK

omlægning kun var signifikant associeret med kvindelige køn og ikke-rygere ved multivariate analyser. Ovenstående resultater var meget lig tidligere offentliggjorte rapporter fra asiatiske eller vestlige lande. Vi fandt, at scenen distribution i NSCLC patienter med

ALK

omrokeringer var alle meget ens, dvs. største antal i fase I, og ingen eller meget få i stadie IV, mellem vores undersøgelse og 4 offentliggjorte rapporter [21,24, 25,27], grunden det ikke var signifikant associeret med tumoren etape var, at patienter uden

ALK

omlejringer havde også højeste patient nummer i fase i og lavest i stadie IV i alle disse 5 undersøgelser (kun 2 til 14 patienter i stadium IV). Denne ulige etape fordeling var sandsynligvis på grund af tilgængeligheden af ​​friske frosne væv til RT-PCR, som var mere tilgængelig i operable patienter (fase I-III), og vanskeligt for trin IV patient. Interessant Forekomsten af ​​

ALK

omrokeringer i fase III-patienter var alle højere end de andre led i vores undersøgelse og 3 i de ovennævnte 4 rapporter [21,24,27]. Det ville kræve et stort sagsnummer at afgøre, om forekomsten af ​​

ALK

omlejringer ville øge med tumoren scenen, da forekomsten af ​​

ALK

omrokeringer var ret lav.

Et vigtigt mål med denne undersøgelse var at sammenligne følsomheden og specificiteten blandt de tre påvisningsmetoder (IHC, FISH, og RT-PCR). Det afslørede, at FISH havde en lav følsomhed (58,33%), men med meget god specificitet (99,32%). I modsætning hertil IHC pletten syntes at have bedre følsomhed (91,67%) end fisk, men specificiteten (79,52%) var meget lavere, når snittet off var IHC2 +. For at forstå, om de anvendte ville påvirke IHC resultater eller ej, har vi udført IHC pletter på alle RT-PCR-antistoffer (+) tumorer med yderligere ALK antistoffer fra forskellige virksomheder, som omfattede 5A4 (Histofine, Nichirei), 5A4 (ABCAM), 5A4 (Novocastra), og D5F3 (Cell Signaling), til at sammenligne deres følsomhed og specificitet. Alle de ovennævnte ALK-antistoffer er blevet anvendt i publicerede rapporter [15,25,35,36,38-40]. Det fremgik, at når tumorerne havde høj ALK-ekspression (IHC 3+) af anti-ALK-antistof vi bruges (ZAL4), ville de også være positive med høj intensitet af alle andre anti-ALK-antistoffer (data ikke vist). Hvis der derimod tumorerne havde kun moderat ALK-ekspression (IHC 2+) ved ZAL4, ville disse tumorer være helt negative for ALK af de øvrige anti-ALK-antistoffer. Som vist i tabel S3, fire RT-PCR (+) eller FISH (+) tumorer i denne undersøgelse var IHC 2+. Således ZAL4 syntes at have højere sensitiv til påvisning af ALK-ekspression end andre anti-ALK-antistoffer, men med lavere specificitet.

Vi har undersøgt alle de gelelektroforese billeder af RT-PCR (+) tumorer til at kontrollere hvis det kunne være korreleret med ALK proteinekspression niveau i IHC pletten. Til vores overraskelse, RT-PCR resultater havde god korrelation, ikke kun med ALK-proteinekspression, men også fisk data. Alle de 8 tumorer med stærk intensitet af PCR-produkterne (tyder høj overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv) havde også høj ekspression af ALK protein ved IHC pletter og alle positive for FISH test, på nær én mislykkedes i FISH (tabel S3). Denne korrelation er aldrig blevet rapporteret før. Da vi kun evalueret 100 tumorceller i FISH-test for hver tumor, det var rimeligt, at høj overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv vil have større chance for at være positivt for FISH. Da FISH er blevet godkendt som en pålidelig diagnostisk test for crizotinib (ALK-hæmmer) behandling [32], kan vores resultater tyder på, at høje overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv kan også være relateret til behandlingen reaktion på ALK-hæmmere.

Det var også interessant at konstatere, at høje overflod af

EML4-ALK

positive celler i tumorvæv var mere almindelige i Variant 3a + 3b (4/5, 80% ) end Variant 1 (1/3, 33,3%). High ALK-proteinekspression (IHC3 +) var også mere almindelig i Variant 3a + 3b (5/5, 100%) end Variant 1 (1/3, 33,33%). Dette svarede til rapporten fra Wallander, et al. De fandt, at der var 100% konkordans til påvisning af

EML4-ALK

variant 3a + 3b af alle 3 metoder til påvisning (RT-PCR, FISH og IHC), men ikke for variant 1 i et studie med 46 kaukasiske patienter [41]. Da den mest almindelige variant af kaukasisk NSCLC patienter var Variant 1, kan det være en af ​​grundene til IHC metoder blev fundet at være ikke-følsomme i rapporterne fra nogle af de vestlige undersøgelsesrapporter [25,40,41], men havde god korrelation med FISH i undersøgelsen rapporterer fra asiatiske lande [35,36,38]. For nylig

EML4-ALK

varianter blev også fundet at have forskellig følsomhed over for ALK-inhibitor af in vitro-undersøgelse. Variant 1 var den mest følsomme for ALK-inhibitor, efterfulgt af variant 2 og variant 3b (lige følsomme), og den sidste var variant 3a [44]. Det ville være interessant at undersøge, om de variant typer af

EML4-ALK

patienternes etnicitet kan påvirke den terapeutiske respons på ALK-hæmmer eller ej.

En anden konklusion værdig til diskussion var de to patienter med EGFR mutationer og høj ekspression af ALK-protein (IHC3 +), men negativ i RT-PCR forsøg. En af dem var FISH (-) og en anden mislykkedes i FISH. Da sameksistens af

ALK

EGFR

mutationer var meget sjældne, en anden mulig forklaring på denne forening er, at høj ekspression af ALK kan fremkaldes af

EGFR

mutationer gennem interaktion mellem disse to kinaseproteiner. Samtidig aktivering af ALK og EGFR signalveje er blevet rapporteret i lungen cancercellelinier, og disse cellelinier kunne kun undertrykkes ved dobbelt inhibering af både ALK og EGFR [21,45].

Sammenfattende blandt de tre metoder til påvisning af ALK omlejringer, kunne RT-PCR, ikke blot at påvise tilstedeværelsen af ​​

EML4-ALK

fusionsgenet og varianttyper, men også den overflod af

EML4-ALK

positive celler i NSCLC tumorvæv. De to sidstnævnte faktorer kan påvirke behandlingen reaktion på anti-ALK-hæmmer. Herunder RT-PCR som en diagnostisk test for ALK-hæmmer behandling i prospektive kliniske undersøgelser anbefales.

Materiale og metoder

Patienter og væv

Friske frosne tumor prøver af 328 NSCLC patienter (274 patienter fra maj 2002 til april 2006, og 54 patienter fra oktober 2009 til maj 2012), der fik kirurgisk resektion på Chang Gung Memorial Hospital og med underskrevet informeret samtykke blev opnået fra vævet bank af Chang Gung Memorial Hospital til RNA ekstraktion og molekylær biomarkør undersøgelser. Ingen af ​​patienterne har modtaget ALK-inhibitor behandling før. Frosne snit blev udført på hver friske frosne lungekræft væv til bestemmelse af tumor% af en patolog (SFH) forud for undersøgelsen. Kun patienter med en tumor% højere end 70% blev inkluderet til denne undersøgelse. Nogle tumorvæv med lav tumor% og rigelige fibrøst stroma blev mikrodissekeres manuelt under mikroskop for at opnå højere tumor%. Alle patienterne omfattede også nødt til at have til rådighed paraffinsnit i lungerne tumor for ALK IHC pletten og FISH undersøgelse. Endelig i alt 312 patienter havde tilstrækkelige prøver at komme ind i denne undersøgelse. Den kliniske data og rygevaner blev indhentet fra de medicinske journaler. Ingen af ​​patienterne har modtaget crizotinib behandling før. Denne undersøgelse protokol var blevet revideret og godkendt af Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital og National Health Research Institutes. Blandt de 312 patienter, har ALK omlejring og IHC undersøgelsens resultater af 64 patienter de tidligere offentliggjorte [42].

RNA ekstraktion og komplementært DNA-syntese

Friske frosne tumorvæv blev brugt som udgangsmaterialer for total RNA-ekstraktion af Trizol-fremgangsmåden (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). RNA kvalitet blev verificeret ved gelelektroforese. To ug totalt RNA blev anvendt som startede materiale til komplementært DNA (cDNA) syntese ved ansat SuperScript III revers transkriptase (200 U /pl, Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Efter revers transkription reaktion var færdig, blev et samlet volumen på 40 pi cDNA opnået. Én pi resulterende cDNA blev anvendt til yderligere PCR-reaktioner.

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) til påvisning af forskellige ALK omlægning med forskellige partnere

EML4-ALK

fusion gen.

RT-PCR kombineret med Sanger sekventering af PCR-produkter blev udført. To primer sæt (vist i tabel S6) blev udformet i henhold til de offentliggjorte rapporter til at identificere

EML4-ALK

Variant 1 og Variant Non-1 henholdsvis [8,26,46]. Sidstnævnte kunne registrere

EML4-ALK

Variant 2 til 7. De termiske forhold cyklus var anderledes for Variant 1 og Variant Ikke-1. For

EML4-ALK

Variant 1, de termiske forhold cyklus blev præinkubering i 4 minutter ved 95 ° C for den indledende aktivering, efterfulgt af 35 cykler denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primer annealing i 30 sekunder ved 55 ° C, og forlængelse i 2 minutter og 30 sekunder ved 72 ° C. for

EML4-ALK

Variant Non-1, den termiske cyklus var: 15 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 35 cykler denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primer annealing i 30 sekunder ved 66 ° C, og forlængelse i 1 minut ved 72 ° C. Anslået PCR produkt størrelse (basepar) af hver variant blev opført som følgende: variant 1 (247 bp) , variant 2 (2303 bp), variant 3a (728 bp), variant 3b (761 bp), variant 4 (1664 bp), variant 5a (269 bp), variant 5b (386 bp), variant 6 (1619 bp) og variant 7 (1688 bp).

KIF5B-ALK

,

KLC1-ALK

TFG-ALK

fusionsgener.

Den mulige eksistens af

KIF5B-ALK

,

KLC1-ALK

TFG-ALK

, blev også undersøgt i alle patienters tumorer, der var negative for

EML4-ALK

fusionsgen. Primersættene (vist i tabel S6) og PCR tilstand blev designet i henhold til de tidligere offentliggjorte rapporter [15-18]. Betingelserne for termisk cyklus

KIF5B-ALK

var 95 ° C i 4 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 50 ° C, og 2 minutter 30 sekunder ved 72 ° C i 40 cykler. For

KLC1-ALK

, var 95 ° C i 4 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C og 3 minutter ved 72 ° C i

TFG-ALK

, det var 4 minutter ved 94 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 45 sekunder ved 94 ° C, 45 sekunder ved 65 ° C, og 1 minut og 30 sekunder ved 72 ° C

efter PCR-reaktionen var færdig, blev total PCR-produkt (20 pi) i hvert tilfælde anvendt til DNA gelelektroforese. Hvis nogen PCR-produkt med forventet størrelse blev opnået, blev nukleotid sekventering (Applied Biosystems PRISMR 3730 DNA Analyzer Sequencer) udføres. Nucleotidsekvenserne opnåede blev verificeret ved BLAST program på NCBI. Alle positive resultater blev gentaget af en anden tekniker for bekræftelse.

ALK

omordning bestemt af pause fra hinanden FISH undersøgelse

Påvisning FISH blev udført på ufarvet 5-um tyk paraffinindlejrede formalin-fikserede vævssnit. Ifølge hematoxylin og eosinfarve af det samme væv blok, blev tumoren del på hvert objektglas udvælges og omgivet af en patolog (SFH) inden fisken undersøgelse.

ALK

sonde anvendte var Vysis ALK Break Apart FISH Probe (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). De afparaffinerede vævssnit blev først forbehandlet med 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,0 opløsning i 92 ° C i 15 minutter, efterfulgt af phosphatpufret saltvand (PBS) vask, derefter fordøjet med 300 pi Digest-all (Zymed, Inc., South San Francisco, CA) ved 37 ° C i 90 til 120 minutter afhængig af størrelsen af ​​de vævssnit. Fordøjelsen blev standset ved 10% neutral formalin ved stuetemperatur i 1 minut og vasket med PBS igen. Ti pi

ALK

probe blev anvendt til hver dehydreret og lufttørret objektglas, og denatureret ved 94 ° C i 4 minutter, derpå hybridiseret natten over ved 37 ° C i Vysis HYBrite (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). Post-hybridisering vask blev udført med 2 x standard saltvand-citrat ved 72 ° C i 5 minutter og derefter skyllet i PBS med 0,25% Tween 20 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Objektglassene blev derefter monteret med 10 pi Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) med 0,1 pg /ml 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindol. undersøgelsens resultater Fiskene blev evalueret med Leica DMR fluorescens mikroskop (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Tyskland). Fisken signaler først evalueret af to erfarne teknikere uafhængigt (THW, YTC) og kontrolleres igen af ​​én patolog (SFH) for de FISK positive tumorer. Mindst 100 ikke-overlappende og intakte tumor kerner blev evalueret. De tumorceller blev anset for at være positiv for FISH undersøgelse i overensstemmelse med producentens retningslinier, dvs. når de røde og grønne signaler var langt fra hinanden i mere end 2 kerner eller haft tab af den parrede grønne signal (individuel rødt signal, IRS). Kun tumorer med mere end 15% af tumorcellerne har positive break-apart FISH signaler blev anset for at have

ALK

omlejringer.