PLoS ONE: Kræft Cell Invasion forstærkes af Applied Mechanical Stimulation

Abstrakt

metastatiske celler migrerer fra stedet for den primære tumor, gennem stroma, i blodet og lymfekar, endelig koloniserer forskellige andre væv til at danne sekundære tumorer. Talrige undersøgelser har været gjort for at identificere de stimuli, der driver den metastatiske kaskade. Dette har ført til identifikation af flere biokemiske signaler, der fremmer metastase. Men oplysninger om den rolle af mekaniske faktorer i cancer metastaser har været begrænset til effekten af ​​overholdelse. Interessant tumormikromiljøet er rig på mange celletyper, herunder højt kontraktile celler, som er ansvarlige for omfattende ombygning og produktion af den tætte ekstracellulære matrix omgiver cancervævet. Vi hypotesen, at de mekaniske kræfter, der frembringes ved remodeling aktiviteter af celler i tumormikromiljøet bidrager til invasionen effektiviteten af ​​metastatiske celler. Vi har opdaget en signifikant forskel i omfanget af invasion i mekanisk stimuleret vers ikke-stimuleret celle kultur miljøer. Desuden er denne mekanisk forstærket invasion afhænger substratprotein sammensætning, og påvirket af topografi. Endelig har vi fundet, at proteinet cofilin er nødvendig for at afføle de mekaniske stimuli, der forbedrer invasion. Vi konkluderer, at andre typer af mekaniske signaler i tumormikromiljøet, foruden stivhed, kan forbedre de invasive evner cancerceller

in vitro

. Vi foreslår endvidere, at

in vivo,

ikke-kræft celler beliggende inden for tumor mikromiljø kan være i stand til at yde den nødvendige mekaniske stimulus under ombygningen af ​​den ekstracellulære matrix omgiver tumoren.

Henvisning: Menon S, Beningo KA (2011) Cancer Cell invasion forstærkes af Applied Mechanical Stimulation. PLoS ONE 6 (2): e17277. doi: 10,1371 /journal.pone.0017277

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: August 15, 2010; Accepteret: 27 Januar 2011; Udgivet: 17 februar, 2011

Copyright: © 2011 Menon, Beningo. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte blev leveret af en Wayne State University Faculty Research Grant til KAB og en Wayne State University Graduate Research Award og Enhancement Funds til SM. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

afgørende øjeblik i klassificeringen af ​​en tumor som godartede eller ondartede løgne i tumorceller evne til at bryde basalmembranen. Udvidelsen af ​​invasive strukturer, såsom invadopodia, tillader tumorcellen at trænge basalmembranen og interstitiel stroma ved enzymatisk og fysiske midler [1] – [3]. Dog vil tumorcellen ikke gå langt uden den yderligere evne til at migrere. erhvervelse tumorcellerne af invasive og vandrende egenskaber giver mulighed for at komme ind og ud af lymfe eller det vaskulære system og etablere sekundære tumorer i fremmed væv, og dermed fuldføre kompleks sekvens af begivenheder inden invasionen-metastaser kaskade [4], [5] . Det er disse sekundære tumorer, der tegner sig for mere end 90% af kræftdødsfald, men vores forståelse af invasion og metastase er ufuldstændig. Meget af forskningen har fokuseret på iboende genetiske og biokemiske faktorer, der udløser primær tumordannelse og efterfølgende metastase. Imidlertid har nyere undersøgelser identificeret både fysiske og biokemiske faktorer inden tumor mikromiljø, der også bidrager til kræft progression [6], [7].

stroma omgiver en tumor er under stadig forandring i sammensætning og struktur som primære tumorceller videre til invasion og metastase, en proces betegnet stromagenesis [8], [9]. Tumoren stroma bliver beriget i ekstracellulær matrix (ECM) proteiner og ikke-tumorceller, herunder fibroblaster, makrofager, adipocytter, og pericytes [8] – [12]. Biokemisk signalering fra stroma til tumorcellerne kan fremme proliferation og invasionsevne. For eksempel tumorassocierede makrofager etablere en EGF-CSF-1 parakrin signalering loop med tumorcellerne, der fremmer tumorcelle bevægelse [10]. De mekaniske egenskaber af stroma kan også forbedre tumorprogression. For eksempel er stroma omgiver en tumor beriget med både type I collagen og fibronectin, hvilket skaber en tættere og mekanisk stiv væv sammenlignet med normalt væv [7]. Denne forøgede stivhed forbedrer tumorcelleproliferation og formidling [13] – [15]. Nylige undersøgelser viser også, at fysisk strækker fibronectin kan udløse en mekanisk respons pathway i normale fibroblaster [16] – [18]. I betragtning af den øgede mængde af fibronectin i stroma, kan disse observationer antyder en potentiel mekanisme til mekanisk reaktion af tumorceller.

Der er en række af mekaniske kræfter, bortset fra ændringen i overensstemmelse, der kan have indflydelse på progression af cancer. En sådan kraft kan udledes af stromacellelinier bevægelser eller matrix remodeling aktivitet af de meget kontraktile celler i stroma, herunder fibroblaster og myofibroblaster. Myofibroblaster er blevet vist at skelne fra normalt væv fibroblaster, og deres produktion og ombygning af ECM forbedrer proliferation og formidling af tumorcellerne [19], [20]. Ophobning af stromale myofibroblaster er et definerende træk ved desmoplasia mest almindeligt i forbindelse med invasive kræft i bryst, mave skrifter, lunger, bugspytkirtel og planocellulært karcinom at nævne et par [9]. Ud over den høje grad af type I kollagen produktion, er myofibroblaster identificeres ved deres ekspression af alfa-glatmuskelactin [7], [9], [21], [22]. Alfa-glat muskulatur actin associeres med ikke-muskel myosin og danne meget kontraktile microfilamentous enheder, slutte ved overfladen af ​​en myofibroblastdifferentiering i en fibronexus [23]. Disse er karakteristiske træk ved myofibroblasts og danne en mekanisk-transduktion, som fungerer i inside-out og udefra-ind kraftoverførsel [23] – [25]. I remodeling ECM i stroma, de myofibroblaster producere en mekanisk stimulus, som de slæbebåd og trække på fibrene [26]. Dette fører os til det spørgsmål, vi fat i denne undersøgelse. Kunne de påførte mekaniske kræfter frembragt af ombygning af ECM og trække i ECM af stromaceller bidrage til de invasive egenskaber af en tumorcelle? Kan de giver en “kom hid” stimulus, der tilskynder tumorcellerne til at forlade tumor?

Her har vi rapportere, at en mekanisk stimulus for at trække og slippe anvendt på et kollagen matrix

in vitro

gør faktisk forbedre invasionen af ​​cancerceller i en fibronectin-afhængig måde. Denne evne synes at være unik for cancerceller, som vides at være stærkt invasive, som dårligt invasive og normale celler reagerer ikke på samme måde til denne stimulus. Endelig hjælp af gen-silencing vi konstateret, at cofilin, en normal bestanddel af invadopodia, er forpligtet til at fornemme dette mekaniske signal for øget invasion. Denne undersøgelse tyder på, at fysiske faktorer, ud over overholdelse, er involveret i at fremme eksisterende invasive adfærd i cancerceller, og at mekaniske signaler transmitteret fra den fysiske aktivitet af celler i stroma kan forstærke kræft progression.

Materialer og metoder

Cell Culture

HT 1080 humane fibrosarcomceller, B16F10 musemelanomceller og muse embryonale fibroblaster (MEF) celler anvendt i denne undersøgelse, blev købt fra ATCC og dyrkes og holdes i Dulbeccos modificerede Eagles medium – høj glucose (Sigma) og 10% FBS (Hyclone). Celler blev passeret ved trypsinisering anvendelse af 0,25% trypsin-EDTA, er reaktionen afsluttet med komplette medier. Passagen Antallet af enhver celletype aldrig overstiger otte passager.

Invasion Matricer

For at skabe en kultur godt for tykke (1 mm) matricer, en aktiveret dækglas [27] blev fastgjort med vakuum fedt til bunden af ​​en dyrkningsskål (Nunclon), i hvilken en 20 mm hul var blevet boret.

matricen var sammensat af 2,5 mg /ml (eller 4,5 mg /ml, fig S2) type i-collagen (PureColl og Nutragen, Advanced Biomatrix), 20 ug /ml fibronectin (Sigma) og 4 pi 1-2 um carboxylerede paramagnetiske kugler (Polysciences Inc.). PH af blandingen blev indstillet til 7,4 ± 0,2 med 0,1 N NaOH og 10X PBS. For “Kollagen only” substrater, alt undtagen fibronectin sættes til matrixen mix. Alle komponenter blev kølet og blandet ved 4 ° C. 500 pi af matrix-opløsning blev tilsat til en afkølet kultur godt, og en 25 mm dækglas blev dryppet på gelen blandingen til opnåelse af en flad overflade. Til polymerisation, blev matrixen opløsningen anbragt ved 37 ° C i 30 minutter. Efter polymerisationen blev 3 ml medium tilsat til substraterne og den øverste dækglas fjernedes. Substraterne blev derpå steriliseret i en kultur hætte under ultraviolet lys i 15 minutter i en afstand på 25 inches fra lyskilden.

Invasion Assay

Celler blev podet ved 1,5 x 10

4 celler /ml onto steriliseret matrix og lades adhærere i 1 time ved 37 ° C /5% CO

2. For hvert eksperiment blev en podet matrix inkuberet ved 37 ° C /5% CO

2 1,5 cm over en sjælden jordart magnet af 12.100 Gauss (25 mm i diameter og 5,5 mm i tykkelse). En anden podet matrix blev inkuberet uden for det magnetiske felt. Magneten blev roteret under kulturen ved 160 rpm (2,6 Hz) i en orbital område på 2 cm på en orbitalryster (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-type 50800). Denne rotation frekvens blev holdt ens for alle beskrevne assays. Invasionen assay blev også udført med magneten roteres ved lavere frekvenser (8 og 90 rpm (0,13 og 1,5 Hz)) som angivet. Den cellulære respons blev registreret for 25 tilfældigt udvalgte mikroskopfelter på 24 timer ved hjælp af en 10X fase mål på et Olympus IX81 Microscope. Celletællinger blev registreret ved otte intervaller på 100 pm /trin i z-planet af matrixen. Procent invasion blev beregnet som procent af invaderede celler i sammenligning med den totale celletal. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af tohalede studerende T-test

peptidinhibitor eksperimenter blev udført som ovenfor.; 1,5 × 10

4 celler /ml blev podet på substraterne efterfulgt af 100 ug /ml GRGDS peptid eller GRGES (kontrol) peptid (Bachem Americas Inc.) suspenderet i vand. Procent invasion blev beregnet 24 timer efter start af stimuleringen.

Opadgående Invasion Assay

Kultur brønde uden substraterne blev fremstillet som beskrevet ovenfor. Celler blev først podet direkte på dækglas overtrukket med et tyndt lag af type I collagen (200 pg /ml) og fibronectin (62,5 ug /ml) før overlejring af matrixen. Cellerne fik lov at adhærere natten over i medier ved 37 ° C og 5% CO

2. Medierne blev fjernet, og celler blev derefter overlejret med upolymeriserede collagen /fibronectin matrix som beskrevet ovenfor. Medier blev udskiftet følgende polymerisering. For hvert eksperiment, en podet overlejret matrix var dyrkede 1,5 cm under en sjælden jordart magnet af 12.100 Gauss (25 mm i diameter og 5,5 mm i tykkelse) og en anden blev holdt uden for det magnetiske felt. Magneten blev roteret over kulturen holdes i en stand placeret på rysteapparat (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-type 50800) og roteret med 160 rpm (2,6 Hz) i en orbital område på 2 cm. Procent invasion og statistisk analyse blev beskrevet ovenfor.

Actin depolymerisering

HT1080 celler blev podet på collagen /fibronektin substrater. Efter at cellerne havde adhæreret og spredes på substraterne, 2 uM cytochalasin B (Sigma) resuspenderet i DMSO eller et tilsvarende volumen af ​​DMSO blev sat til separate plader. Disse blev derefter direkte anvendt til invasion assay.

Cofilin Knockdown

CFL1 siGENOME SMARTpool og Off-target siRNA (Dharmacon RNAi Technology, Thermo Scientific) blev anvendt til at lukke munden udtryk for Cofilin og som kontroller , henholdsvis. RNA’erne blev indført i celler ved nucleofection anvendelse af en Amaxa Nucleofector II og løsninger fra Kit T. Proteiner blev ekstraheret for western analyse fra tavse og kontrol HT1080-celler under anvendelse af en tredobbelt detergent lysis buffer (100 mM Tris-CI, 300 mM NaCl, 0,5% natrium deoxycholat, 0,2% SDS, 2% Nonidet P 40) indeholdende Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) ved 24, 48 timer og 72 timer efter nucleofection at bekræfte knockdown. Anti-cofilin monoklonalt antistof, ab54532 (Abcam) og anti-muse HRP-mærket antistof (Amersham) blev anvendt til at probe Western blots og påvist med ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham).

Invasion assay under anvendelse af Cofilin siRNA og Cytochalasin B behandlet HT1080 celler

invasion assay blev udført ved hjælp af kontrol siRNA og Cofilin siRNA behandlet HT1080 celler. Da cofilin knockdown er effektiv 48 timer efter nucleofection blev de behandlede celler podedes på substraterne ved 48 timers tidspunktet. Efter at cellerne havde adhæreret, blev en podet matrix for hver af betingelserne anbragt over magneten roterer ved 160 rpm (2,6 Hz), mens den anden blev anbragt uden for det magnetiske felt. Analysen blev også udført under anvendelse Cytochalasin B eller DMSO behandlede celler. I hvert tilfælde blev en podet matrix billede magnetisk stimulation ved 160 rpm (2,6 Hz), hvorimod det andet matrix blev anbragt uden for det magnetiske felt. Den cellulære respons for hver af de fire betingelser blev målt 24 og 48 timer efter påbegyndelsen af ​​stimulation. Procent invasion blev beregnet og statistisk analyse blev udført under anvendelse af en to-halet Student t-test.

Western blot af fibronectin sekretion med HT1080 Celler

1,5 × 10

4 celler /ml HT1080 celler blev dyrket i serumfrit DMEM-medium og podet på collagen-only matrixer, fremstillet som beskrevet ovenfor, og standarden invasion assayet blev udført. Efter 24 timers stimulering blev kulturerne skrabet over i et mikrocentrifugeglas indeholdende 2 mg /ml collagenase type 4 (Worthington Biochemical Corporation) i Hanks balancerede saltopløsning (Gibco, Invitrogen). Kollagenmatrixen blev solubiliseret i 10 minutter ved forsigtigt at ryste røret ved 37 ° C, og celler blev pelleteret ved centrifugering ved 2000 rpm i 5 min blev supernatanten anvendt til analyse. Celleekstrakter af HT1080 celler og MEF celler dyrket på 100 mm polystyren dyrkningsskåle til 80% konfluens over 48 timer er også fremstillet. ekstraktion cellelysis og protein blev udført som beskrevet ovenfor. Standard SDS-PAGE blev udført ved anvendelse af 30 ug totalt protein fra MEF og HT1080 celleekstrakter og 35 pi collagenase suspension. Western blots blev fremstillet og undersøgt med monoklonalt muse [IST-9] til fibronectin (1:300), ab6328 (Abcam) i 5% mælk i TBS, efterfulgt af en HRP ged anti-mus Ig (BD Pharmingen) sekundært antistof (1: 1000) og påvist som ovenfor.

Resultater

Strukturel design af mekaniske invasion Assay

målet med denne undersøgelse var at bestemme, hvis de anvendes mekanisk stimulation, som dem simulerer re-modellering af den ekstracellulære matrix, kunne forbedre processen med invasion. For at løse vores hypotese, vi designet en ny assaysystem hvor mekanisk stimulering kunne anvendes i fravær af udskilte biokemiske faktorer. Vores hensigt var at skabe en analyse, der bruges kommercielt tilgængelige komponenter, krævede standard udstyr, forudsat kontrol af biokemiske og mekaniske parametre, alt sammen i en ramme, der var optisk kompatibel med en almindelig fluorescerende mikroskop. Vi valgte at anvende en type I collagen matrix almindeligvis anvendes til invasion assays betragtninger, at stroma er højt beriget i denne ekstracellulære matrix protein. Carboxylerede fluorescerende paramagnetiske mikro-perler blev indlejret i matrixen for at tilvejebringe mekanisk stimulering. At frembringe en forbigående magnetiske tiltrækningskraft, uden behov for en mikron størrelse elektromagnet, vi roteret en sjælden jordart magnet på en roterende mixer under kultur, mens kulturen blev ophængt over magneten (figur 1A). Hele dyrkningssystem kan holdes inden for et standard vævskultur inkubator (figur 1B, C).

A) En brønd er skabt i en 60 mm dyrkningsskål og fyldt med en type I-kollagen /fibronectin matrix indeholdende 2 um paramagnetiske perler. Celler podes på overfladen af ​​matrixen og enten dyrket uden for et magnetfelt eller dyrkede 1,5 cm over en roterende sjældne jordarters magnet. Ved stimulering, celler invaderer matrixen. B) 60 mm plade med en 20 mm hul bores i det, med et aktiveret dækglas limet til bunden, skaber en brønd til matrixen. C) Kulturen suspenderes 1,5 cm over en sjælden jordart magnet placeret på en orbitalryster i en typisk cellekultur inkubator. Se afsnittet metoder for detaljer.

For at kontrollere, at magneten var stand til at producere nok magnetisk kraft, og at de indlejrede perler reagerede på kraft i en forbigående måde, vi brugte en magnometer til at måle den magnetiske kraft ved definerede eksperimentelle afstande. Vi opdagede en magnetisk perle på et fast sted i midten af ​​kulturen kunne underkastes en området fra 500 til 80 Gauss som sjældne jordarters magnet roterer 1,5 cm under dyrkningsskålen mens færdiggøre en bane på 2 cm ved 160 rpm (2,6 Hz) (figur 2A). Simulering på disse afstande under lup resulterede i perle forskydninger på ca. 0,5-5 um (figur 2B, Movie S1, Film S2). Perler blev observeret til at springe tilbage til deres oprindelige position i x-y-planet efter magneten blev fjernet, hvilket indikerer deres binding til collagen matrix og vedligeholdelse af integriteten af ​​gelen netværk. For at bestemme den fysiologiske betydning af denne forskydning, vi erkendt, at vi kunne beregne mængden af ​​kraft, der blev påført på perlen af ​​magneten imidlertid en mere konkret test vil være at observere MEF-celler udstrække og tilbagetrække udvidelser inden for vores kontrolleret dyrkningssystem. Vi indspillede bead forskydninger i x-y-planet fra cellulære udvidelser af MEF celler, der spænder fra 0.08-5.1 um (figur 2C, Film S3). Dette er en konservativ sammenligning med de typer af forskydninger, der kan opstå i stroma eftersom mest kontraktile celletype fandt der, myofibroblaster, producere betydeligt større kraft end en MEF [28], [29].

a) en sjældne jordarters magnet placeret 1,5 cm under en matrix frembringer en gradient felt i området fra 500G og 80g i matrixen, når den roterer i en 2 cm kredsløb. En paramagnetisk kugle i position X ville modtage en magnetisk kraft 500G, ~300G og ~200G når magneten i kredsløb ved positionerne P1, P2 og henholdsvis P3. B) Serie af fire billeder der viser forskydningen af ​​perler af magneten, når den holdes i stationære positioner i kredsløb. Klynger af perler reagerer på mekaniske stimulus og viser en positionel skift er blevet afgrænset ved hjælp af en cirkel, en firkant og en pil. Fra venstre mod højre, billede ene er uden for det magnetiske felt, mens den anden og tredje billeder blev taget med magneten holdes i positioner P1 og P2 hhv. Det endelige billede viser perlerne vende tilbage til deres oprindelige position efter magneten fjernes. C) MEF cellulære udvidelser forårsage fluorescerende vulst forskydning. Fire billeder (0, 15, 30 og 60 minutter) fra en enkelt fokalplan blev udvalgt fra en serie af 30 fase billeder taget hver 2 minutter af en MEF celle i et kollagen /fibronectin matrix. Cell konturer og tilsvarende fluorescerende perle billeder skal vises. En perle undergår forskydning er skitseret ved hjælp af en hvid rektangulær kasse. Området inden i feltet alle fire billeder er blevet udvidet og vises med indsat lineal til at vise perlen forskydning mere tydeligt. Kontrasten af ​​det forstørrede billeder er blevet ændret for bedre at afspejle positionen af ​​perlen i hvert enkelt tilfælde. Mag. Bar = 10 um.

Mekanisk stimulation Forbedrer Invasion af kræftceller

Invasive strukturer er tidligere blevet beskrevet i både natur normale invasive celler og i dem, der har erhvervet deres invasive kapacitet under cancer progression [30]. Vi ræsonnerede, at det var usandsynligt, at mekanisk stimulering ville fremkalde en hidtil ikke-invasiv celletype til at invadere og dermed vi testede celler vides at være meget invasive i vores analysesystem. Vi valgte at teste den humane fibrosarcom-cellelinie HT 1080 og muse melanomacellelinie B16F10, hvorimod ikke-invasiv MEF cellelinie tjente som kontrol.

Disse celletyper blev testet individuelt for deres evne til at reagere på den mekaniske stimulation tilvejebragt i assayet. Kort fortalt blev celler podet på tilberedte matrixer, som beskrevet i fremgangsmåder, og fik lov at adhærere i 30 minutter, før stimulering. Celler dyrket på matricer af identisk sammensætning, men som ikke udsættes for magnetisk stimulation, fungerede som kontroller. Celler dyrket på matricer mangler magnetiske perler, men udsat for magnetisk stimulation tjente som yderligere kontroller. Invasion blev observeret under mikroskopet begynder ved 5 um fra overfladen til en dybde på 800 um i matrixen (figur 3A). Antallet af invaderende og ikke-invaderende celler blev talt efter 24 timers stimulering og beregnet som procent invasion.

A) HT1080 fibrosarcomceller podedes på type I collagen /fibronectin matricer indeholdende paramagnetiske perler og dyrkes enten under magnetisk stimulering eller uden stimulering. En kombineret fase og fluorescerende billede af en mekanisk stimuleret kultur blev overlejret. De solide pilen peger på en celle, der har invaderet. Den stiplede pil viser en anden celle i et andet brændplanet. De tomme pilen peger på en fluorescerende paramagnetisk perle. Mag. Bar = 50 um. B) Invasion af HT1080 celler under mekanisk stimulerede og ikke-stimulerede betingelser blev udført i matricer indeholdende enten type I collagen (2,5 mg /ml) eller både type I collagen og fibronectin, eller collagen /fibronectin i nærvær eller fravær af RGD peptid. 25 felter af celler blev talt 24 timer efter podning på flere dybder i hver matrix begynder 5 um under overfladen af ​​matricen og virkeliggøre det fjerneste dybde på 800 um. Procenten af ​​invaderende celler var 2 gange højere i stimulerede kulturer i sammenligning med kontroller (

P

0,05) i matricer indeholdende begge ECM-proteiner. Lignende resultater blev opnået, når kontrol- peptid GRGES blev tilsat til mediet. Den procentvise invasion var næsten det samme med eller uden stimulering, når fibronectin var til stede. Tilsætning af GRGDS-peptid resulterede også i inhibering af forøget invasion ved mekanisk stimulering. C) En 20-fold forskel i hyppigheden af ​​stimulation påvirker ikke procent af celleinvasion. Procenten af ​​invaderende celler 24 timer efter stimulering på magnetiske rotationshastigheder på 8, 90 og 160 rpm (0,13, 1,5 og 2,6 Hz). En ubetydelig forskel blev fundet mellem celler stimuleret ved 8 og 160 rpm (

P

0,05). Data repræsenterer tre uafhængige forsøg, af 25 felter. D) Type I kollagen /fibronectin matricer indeholdende paramagnetc perler blev præ-stimuleret i 24 timer. Disse matricer blev derefter podet med HT1080-celler og talt 24 timer efter podning i denne periode både før-stimulerede og kontrolpladerne blev ikke stimuleret (venstre panel). Disse kulturer blev derefter enten vedvarende eller placeres over magneten (højre panel), data opnået 24 timer efter stimulering. Data repræsenterer to uafhængige assays af 15 områder af celler i en dybde intervallet 800 um. To-halet analyse under anvendelse student t-test.

Vi oprindeligt podet vores celler på matricer bestående kun af type I collagen. Ved stimulation vi ikke observere forbedret invasion (varierende mellem 5 og 10% invasion i stimulerede og ikke-stimulerede kulturer). Men ikke kun er type I collagen rigelige i stroma, men kollagen bindende ECM protein fibronectin beriges også [7], [31]. Således har vi sammenlignet matricer sammensat af collagen alene til dem i både collagen og fibronectin, med og uden stimulering. Under disse betingelser har vi observeret en signifikant forskel i antallet af invaderende celler i mekanisk stimuleret vers ikke-stimulerede kultur miljøer for de invasive celletyper når collagen /fibronektin matricer blev anvendt (figur 3B). En to-fold stigning i procentdelen af ​​invaderende celler i stimulerede (23%) sammenlignet med den ikke-stimulerede matrix (10%) blev konsekvent observeret i disse kulturer (P 0,05). Disse resultater indikerede, at en anvendt stimulus var stand til at forøge invasion af cancerceller, men kræves i nærvær af fibronectin til mekanisk reaktion. Endvidere fandt vi, at ikke-invasive MEF celler undladt at invadere både i nærvær eller fravær af mekanisk stimulering i collagen /fibronektin matricer, hvilket antyder behovet for en celle at have en foruddefineret evne til invasion.

for at bekræfte betydningen af ​​fibronectin til mekanisk reaktion, vi inhiberede celle-fibronectin interaktioner med RGD inhiberende peptider. Celler blev behandlet med GRGDS peptid eller et kontrol GRGES peptid efter podning onto collagen /fibronektin matricer. Den procentvise invasion var normal i nærvær af kontrol GRGES peptid (28% med stimulering og 13% uden stimulation), mens mekanisk stimuleret invasion blev inhiberet af RGD peptid (9% med stimulering og 11,5% uden stimulering, P 0,05). Disse resultater ikke kun støtte det faktum, at fibronectin er nødvendige for mekanisk stimuleret invasion, men foreslår den “basale” niveau på -10% invasion observeret i collagen /fibronectin (ikke-stimuleret) og kollagen (stimuleret og ikke-stimuleret) kulturer er fibronectin uafhængige. Derudover tyder disse resultater på, at enhver fibronectin udskilles af HT1080 celler i matricerne (selvom påvises ved western blot, figur S1). Lidt har indflydelse på den mekaniske respons

På grund af heterogeniteten af ​​celletyper og celler numre inden stroma det var uklart på hvilken frekvens stimulus bør anvendes. For at bestemme om frekvensen af ​​vulsten stimulering var en faktor i forøget invasion, vi justeret hastigheden af ​​den roterende magnet, som roterer ved hastigheder på 8, 90 og 160 omdrejninger i minuttet eller 0,13, 1,5 og 2,6 Hz, hhv. Den procent af invasionen ikke signifikant forskellig mellem kulturerne stimuleret ved 8 og 160rpm (

P

0,05, figur 3C). Disse resultater viste, at inden for en 20-fold vifte af frekvens, forstærket invasion i respons på mekanisk stimulation er upåvirket.

Invasive celler støder fysiske barrierer inden bindevævet eller tumor stroma og vil sandsynligvis følge den vej mindst modstand [32]. Desuden vil de sandsynligvis invadere langs stier, hvor matrix associeret opløselige faktorer er blevet frigivet [19], [33] – [36]. Baseret på denne viden, var det vigtigt at sikre, at ingen af ​​disse faktorer bidrog til den forbedrede invasion observeret i vores analyse.

En måde, hvorpå vores matrix kunne generere stier af mindst modstand for celle invasion ville være gennem en permanent remodeling skabt af bevægelsen af ​​de indlejrede perler. For at teste denne mulighed, vi pre-stimulerede matrixerne over roterende magnet for 24 timer før podning af cellerne. Efter 24 timers kultur på de præ-stimuleret matricer, men uden for det magnetiske felt, vi ikke observere forbedret invasion (figur 3D, venstre panel). Desuden blev mediet af præ-stimuleret matrix ikke ændret før podning af cellerne. Dette elimineret det potentiale, opløselige faktorer i matricen blev frigivet af tugging af perler på matricen og bidrage til forbedret invasion. Men når disse samme cellekulturer dyrket på den præ-stimuleret matrix blev derefter givet magnetisk stimulation, øget invasion blev igen observeret (figur 3D, højre panel). Tilsammen disse resultater tyder på, at enhver remodeling eller frigivelse af opløselige faktorer fra matricen som følge af flytning af de magnetiske perler ikke bidrager til den forbedrede invasion vi observerer på mekanisk stimulering.

Kisses Response Forbedret hvorvidt de Stimulus leveres fra toppen eller bunden

dimensionalitet af miljøet er kendt for at påvirke cellulære adfærd. Konkret har HT1080 celler vist sig at ændre deres migration hastighed og vedholdenhed i tre dimensioner [37]. I vores indledende forsøg podes cellerne på toppen af ​​matrixen, invaderende fra toppen og nedefter, således begynder i to dimensioner, og bevæger sig ind i tre. For at løse indflydelsen af ​​dimensionalitet på mekanisk invasion vi ændret orienteringen af ​​stimulus, således at cellerne vil invadere opad. For at gøre dette, vi først seedede cellerne på collagen /fibronectincoatede dækglas før overlejring og polymerisering kollagen /fibronektin /magnetiske perle løsning over dem (figur 4A). Magnetfeltet blev derefter påført på toppen af ​​kulturen ved at rotere magneten over den stationære kultur (figur 4B). Efter 24 timers stimulering, fandt vi cellerne invaderet lige så godt som de gjorde, da de blev podet på toppen af ​​matrixerne forud for stimulation (6% invasion i ikke-stimulerede og 13% i stimulerede kulturer) (figur 4B). Men vi fundet ved 48 timer forskellen mellem ikke-stimulerede invasion og stimuleret invasion var endnu større, således at 12% af cellerne invaderede i ikke-stimulerede versus 41% invasion i de stimulerede kulturer. Således en endnu større forøgelse af invasion forekommer i responset til anvendt mekanisk stimulering, når cellerne begyndte i et tredimensionelt miljø.

A) HT1080 fibrosarcomceller podedes på en collagen /fibronectin coatede dækglas i bunden af brønden. Efter at cellerne havde adhæreret, en type I collagen /fibronectin indeholdende paramagnetiske mikroperler blev overlejret på cellerne og fik lov til at polymerisere. Kulturer blev enten udsat for magnetisk stimulation eller dyrkes uden for det magnetiske felt. B) Magneten roteres oven over kultur som celler begynder at invadere op i matrixen. C) HT1080-celler podet på en collagen-fibronectin belagte dækglas og overlejret med en collagen /fibronectin matrix blev dyrket enten i nærvær eller fravær af et magnetfelt. Procent invasion blev beregnet 24 og 48 timer efter stimulering fra tre uafhængige forsøg (15 felter blev talt pr kultur).