PLoS ONE: Metformin behandling ikke hæmme vækst af kræft i bugspytkirtlen Patient-Afledt Xenografts

Abstrakt

Der er i øjeblikket stor interesse i at udvikle antikræftmidler rettet mod celle signalveje er vigtige for både kræftcellen stofskifte og vækst. Adskillige epidemiologiske undersøgelser har vist, at diabetespatienter, der tager metformin har en nedsat forekomst af kræft i bugspytkirtlen. Dette har foranlediget en indsats for at evaluere metformin, et lægemiddel med ubetydelig toksicitet, som et terapeutisk modalitet i bugspytkirtelkræft. Prækliniske studier i cellelinje implanteret og en undersøgelse i patient-afledte xenograft (PDX) modeller var lovende, mens nyligt offentliggjorte kliniske undersøgelser viste ingen fordel at tilføje metformin til kombinationsbehandling regimer for lokalt fremskreden og metastatisk kræft i bugspytkirtlen. PDX modeller, hvor patientens tumorer er direkte transplanteret ind immunkompromitterede mus har vist sig at være fremragende prækliniske modeller for biomarkører og terapeutisk udvikling. Vi evaluerede respons fire PDX tumor linjer til metformin behandling og fandt, at alle fire af vores PDX linjer var resistente over for metformin. Vi fandt, at resistensmekanismer kan forekomme på grund af manglende vedvarende aktivering af adenosinmonophosphat-aktiveret protein kinase (AMPK) eller nedstrøms reaktivering af pattedyr mål for rapamycin (mTOR). Desuden kombineret behandling med metformin og mTOR inhibitorer undladt at forbedre reaktioner i cellelinier, hvilket yderligere indikerer, at metformin alene eller i kombination med mTOR inhibitorer vil være ineffektiv i patienter, og kan forekomme, at resistens over for metformin via flere veje. Yderligere undersøgelser er nødvendige for bedre at forstå disse resistensmekanismer og informere potentielle kombinationsbehandlinger med metformin og eksisterende eller nye lægemidler

Henvisning:. Lipner MB, Marayati R, Deng Y, Wang X, Raftery L, O’Neil BH, et al. (2016) Metformin behandling hæmmer ikke væksten af ​​kræft i bugspytkirtlen Patient-Afledte Xenografter. PLoS ONE 11 (1): e0147113. doi: 10,1371 /journal.pone.0147113

Redaktør: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, CANADA

Modtaget: Juli 25, 2014 Accepteret: December 29, 2015; Udgivet: 13 januar 2016

Copyright: © 2016 Lipner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev delvist støttet af Lineberger Comprehensive Cancer center (BHO) og CA140424 og CA193650 (JJY) fra National Cancer Institute

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest aggressive og dødelige maligniteter, med 80% af patienter med lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom, der varsler en 6-12 måneder median overlevelse og en trist 6% fem års overlevelse [1]. Kemoterapi producerer kun beskedne forbedringer i overlevelse, og nye behandlingsformer er desperat behov for at forbedre behandlingsmulighederne for denne store patientgruppe [2]. Der er i øjeblikket stor interesse i at udvikle antikræftmidler der er målrettet celle signalveje vigtige i både stofskiftet celle og cellevækst [3]. De 5 ‘adenosinmonophosphat-aktiveret protein kinase (AMPK) vej har fået stigende interesse, som AMPK fysiologisk hæmmer pattedyr mål for rapamycin (mTOR) for at opretholde homeostase i forhold af nedsat tilgængelige cellulære energikilder [4, 5]. Undersøgelser har vist, at mTOR signalering spiller centrale roller i overlevelse og spredning af maligne celler [6, 7]. Således har AMPK aktivatorer medført betydelig interesse som potentielle antineoplastiske midler, der fungerer ved at ændre stofskiftet og hæmme mTOR pathway [3].

Metformin er første-line middel til behandling af type 2-diabetes mellitus. Metformin inhiberer mitokondriel oxidativ fosforylering, hvilket øger forholdet mellem AMP til ATP [8, 9]. Høje niveauer af AMP aktivere AMPK, som derefter inhiberer energiforbrugende veje såsom proteinsyntese, delvist ved nedregulering mTOR signalering ved direkte phosphorylering af tumor suppressor TSC2 og mTOR bindingspartneren Raptor [9-13]. Staten energibesparelse fremkaldt af metformin er blevet foreslået til at forklare den cytostatiske effekt af metformin på kræft [9], og den tilsyneladende beskyttende virkning observeret i diabetiske patienter behandlet med metformin som efterfølgende udvikle kræft i bugspytkirtlen [14].

Flere epidemiologiske undersøgelser har vist, at patienter med diabetes tager metformin har en nedsat forekomst af kræft i bugspytkirtlen [14-17]. Dette har foranlediget en stor spænding at evaluere metformin, et meget anvendt lægemiddel med ubetydelig toksicitet, som et terapeutisk modalitet i bugspytkirtelkræft. Der er i øjeblikket 3 kliniske forsøg til evaluering metformin i kombination med forskellige kemoterapier i bugspytkirtelkræft (cancer.gov/clinicaltrials). Prækliniske studier i cellelinje xenotransplantater og en nylig undersøgelse i patient-afledte xenograft (PDX) modeller har vist lovende [18-22].

PDX modeller, hvor patientens tumorer er direkte transplanteret ind immunkompromitterede mus har vist sig at rekapitulere primær tumor arkitektur og genetiske karakteristika, selv efter passage og udvidelse af tumorer i successive generationer af mus [23, 24]. Endvidere PDX modeller er overlegen i forhold til traditionelle cellelinje xenotransplantater, som er tilpasset til in vitro-vækst og mangler den heterogenitet patientens tumorer til vurdering reaktioner på behandlinger og nye biomarkører [23-27]. Indtil for nylig har der været meget begrænsede studier af PDX svar på mange foreslåede onkologiske agenter, og resultater for metaboliske behandlingsformer som metformin er stadig alvorligt mangler [27]. Således er formålet med denne undersøgelse var at vurdere respons af kræft i bugspytkirtlen PDX-modeller til metformin og undersøge metformin virkningsmekanisme og kompenserende modstand veje.

Materialer og metoder

Narkotika og reagenser

metforminhydrochlorid (Spectrum, New Brunswick, NJ, USA) blev opløst i phosphatbufret saltvand (PBS) for både in vitro og in vivo undersøgelser. Rapamycin (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) og BEZ235 (Center for Integrativ Chemical Biology and Drug Discovery, UNC Eshelman Farmaceutiske Højskole, Chapel Hill, NC, USA) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) til in vitro kombinationsterapi studier . Antistoffer mod phosphoryleret AMPKα (Thr172), AMPKα, AMPKa1, AMPKa2, phosphoryleret mTOR (Ser2448), mTOR, phosphoryleret p70S6K (Thr389), p70S6K, phosphoryleret 4E-BP1 (Thr37 /46), og 4E-BP1 var fra Cell Signaling (Beverly , MA, USA). Anti-glyceraldehyd phosphat dehydrogenase (GAPDH) og peberrodsperoxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Pierce® ECL Western Blotting Substrate var fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Apo-ONE Homogen Caspase-3/7 assay kit var fra Promega (Madison, WI, USA).

Cell kultur og transduktion med lentivirus

bugspytkirtelkræft cellelinjer Capan-2, CFPAC- 1, blev HPAF-II, og SW1990 opnået fra American Type Culture Collection (ATCC), autentificeres via korte tandem repeat (STR) profilering (Genetica, Burlington, NC, USA), og testet negative for mycoplasma ved indirekte farvning. Cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 atmosfære.

puromycin domæne AMPKα1-859 pLKO.1 reporter plasmid (generøst doneret af laboratoriet Channing Der, PhD ved University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) blev erstattet med en blasticidin domæne ved restriktionsenzymfordøjelse med BamHI og KpmI. Anden generation replikation-inkompetente lentivirus blev genereret i 293T-celler med en fire-plasmid-system: reporterplasmidet, pMDL gag /pol RRE, pRSV-Rev, og pCMV VSV-G. For transduktion med lentivirus, 1 x 10

6 CFPAC-1 og HPAF-II-celler blev podet i 100 mm plader med lentivirus og en endelig polybren koncentration på 8 pg /mL. Efter 24 timer blev mediet erstattet, og cellerne blev dyrket i yderligere 4 dage med 2 ug /ml puromycin eller 10 dage med 10 ug /ml blasticidin. Cellerne blev trypsiniseret og analyseret ved western blotting for at bestemme gen knockdown.

Ekspressionsvektoren for myc-mTOR transient overekspression blev opnået fra Addgene (plasmid 1861 Cambridge, MA, USA). Transfektion af 5×10

5 CFPAC-1 eller HPAF-II-celler blev udført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) ved hjælp af producentens retningslinjer. Følgende 24 timers inkubation, blev transficerede celler behandlet med 5 mM metformin i yderligere 24 timer, på hvilket tidspunkt cellerne blev vasket med PBS, høstet ved skrabning og opbevaret ved -80 ° C indtil protein isolation.

MTT assay for celleproliferation

for at bestemme cellelevedygtighed efter medicinsk behandling, 5×10

3-celler blev udpladet i fire eksemplarer i 96-brønds plader i 200 pi RPMI 1640 medium og dyrket natten over. Mediet blev derefter erstattet med frisk medium indeholdende enten PBS som en vehikelkontrol, metformin (0-5 mM) eller metformin plus enten rapamycin (0-80 uM) eller BEZ235 (0-1 uM). Efter yderligere 48 timers inkubation, 50 pi 5 mg /ml 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) opløst i PBS ved pH 7,4 blev tilsat til hver brønd. Efter inkubation i 1 time, blev dyrkningsmediet og MTT-reagens aspireret og 200 pi dimethylsulfoxid blev tilsat til hver brønd og blandet grundigt. Absorbansen ved OD560 nm blev målt under anvendelse af en Synergi 2 pladelæser (BioTek, Winooski, VT, USA). Relativ spredning ved hver koncentration lægemiddel blev beregnet efter formlen: 100% * (eksperimentel OD560 /køretøj OD560). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en-vejs ANOVA-analyse med Dunnetts multiple sammenligninger test. Til kombinationsterapi undersøgelser blev synergi vurderet ved anvendelse Compusyn software anvender princippet Chou-Talalay median virkning (ComboSyn, Inc. Paramus, NJ, USA). Alle assays blev udført tre gange.

Western blot betingelser Salg

Efter den angivne inkubationstid med metformin blev cellerne vasket med PBS, høstet ved skrabning og derefter lyseret i 200 pi RIPA puffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 1 mM NaF, og 0,25% Na-deoxycholat og proteasehæmmere. Proteinekstrakter (30 ug) blev elektroforesebehandlet på 10% SDS polyacrylamidgeler og elektrooverført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Til bestemmelse af knockdown af AMPKa1 og AMPKa2 blev membranerne blokeret med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med 1: 1000 fortyndinger af anti-AMPKa1, anti-AMPKa2, og anti AMPKα antistoffer. For celler og væv lysater isoleret efter metformin behandlinger blev membraner inkuberet ved 4 ° C natten over med 1: 1000 fortyndinger af anti-phospho-mTOR, anti-mTOR, anti-phospho-p70S6K, anti-p70S6K, anti-phospho-4e BP1, anti-4E-BP1, anti-phospho-AMPKα, og anti-AMPK antistoffer. Membraner blev derefter vasket og inkuberet med en 1: 5000 fortynding af peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Immunreaktive bånd blev påvist ved kemiluminescens under anvendelse af Pierce® ECL Western Blotting Substrate. Intensiteten af ​​hver immunreaktive bånd blev kvantificeret ved densitometri hjælp af Image J software (NIH, Bethesda, Maryland, USA), og udtrykt i forhold til de PBS-behandlede celler eller mus. GAPDH blev brugt til at sikre tilsvarende protein belastning. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af Students

t

-tests for to sample sammenligninger og envejs ANOVA analyse med Dunnetts multiple sammenligninger test for tre eller flere eksempler sammenligninger.

PDX kohorte ekspansion

pancreas duktalt adenokarcinom væv fra de identificerede patienter med lokaliseret bugspytkirtelkræft, som gennemgik helbredende kirurgisk resektion blev opnået fra University of North Carolina Institutional Review Board (IRB) godkendte tissue Procurement Facility efter IRB godkendelse (08-1153). Tumorvæv blev indpodet subkutant i flankerne af NSG /NOD-mus, ekspanderet, og passeret over tid, som tidligere [28, 29] beskrevet. 7-8 uger gamle nu /nu-mus med en gennemsnitsvægt på 18-20 g blev anvendt i alle eksperimenter. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med det amerikanske National Institutes of Health (NIH) Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr under protokoller, der er godkendt af University of North Carolina Institutional Animal Care og brug Udvalg (12-314).

Metformin behandling af PDX kohorte

behandlingen blev startet efter indpodede tumorer voksede til en median tumorstørrelse på 108 mm

3. Mindst fem mus blev inkluderet i hver behandlingsgruppe for hver PDX tumor linie. Mus blev behandlet med metformin (200 eller 400 mg /kg) eller PBS (20 pl /g) ved én daglig oral sondeernæring. Den første behandlingsdag blev betegnet som dag 0 og behandling blev fortsat i 28 dage. Tumorvolumen (V) blev målt to gange om ugen under anvendelse af skydelære, og beregnet som (længde x bredde

2) /2. Animal legemsvægte blev målt en gang om ugen. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en-vejs ANOVA-analyse med Dunnetts multiple sammenligninger test. Tumorvæv blev opsamlet to timer efter den sidste behandling og skæres i to dele: én del var snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil protein isolation, mens den anden del blev fikseret i 10% formalin og paraffin indlejret ( FFPE). FFPE væv blokke blev snittet og farvet med hematoxylin og eosin til histopatologisk vurdering.

Resultater

Metformin hæmmer ikke væksten af ​​PDX tumorer

Vi evaluerede respons fire kræft i bugspytkirtlen PDX tumorlinier til metformin (200 og 400 mg /kg) i 28 dage. Disse doser blev valgt som højere doser er blevet vist at være nødvendige i mus for at producere et fald i blodglucose hos diabetiske dyr [19, 30, 31]. Desuden har højere doser af metformin (0,1% vægt /vægt) blevet vist at forøge levetiden af ​​mus [32]. Nr tumorvækst inhibering eller regression blev set i nogen af ​​de fire PDX tumorlinier på ethvert tidspunkt målt (Fig 1). Ingen ændring i kropsvægte indtraf i løbet af undersøgelsen og tumor arkitektur forblev groft uændret efter 28 dages behandling som vurderet ved hematoxylin og eosin-farvning (S1 Fig).

Ingen signifikant vækstinhibering blev observeret i fire forskellige bugspytkirtelkræft PDX tumor linjer på et hvilket som helst tidspunkt i løbet af en 28 dage behandlingsforløb med 200 mg /kg eller 400 mg /kg metformin administreret ved daglig oral sondeernæring.

Aktivering af AMPK og hæmning af p70S6K fosforylering i PDX tumorer ikke opretholdes efter en 28 dages behandling med metformin

for at afgøre, om metformin behandling ændret AMPK og mTOR signalering, vi evalueret alle fire PDX tumor linjer for fosforylering af AMPK (Thr172) og p70S6K (Thr389) ved ende af den 28-dages behandling (figur 2A og 2B og S2 fig). I denne langtidsbehandling kohorte, blev ingen ændring i phosphorylering af AMPK og p70S6K ses i metformin sammenlignet med køretøjets behandlede tumorer. Vi derefter evaluerede effekten af ​​metformin på to PDX tumorer efter kun 3 dages behandling. I modsætning til de langsigtede behandling tumorer, viste de kortsigtede behandling tumorer øget phosphorylering af AMPK og nedsat fosforylering af p70S6K (Fig 2C og 2D).

Phosphorylering af AMPKα og p70S6K i (A) P505 og (B) P710 PDX tumorer efter 28 dage behandling med 400 mg /kg metformin. Phosphorylering af AMPKα og p70S6K i (C) P505 og (D) P710 PDX tumorer efter 3 dages behandling med 400 mg /kg metformin (* p 0,05).

Metformin hæmmer væksten og ændrer AMPK og mTOR signalering i bugspytkirtelkræft cellelinjer

Da manglen på vedvarende respons i vores PDX-modeller var overraskende, vi næste undersøgt virkningerne af metformin på spredning af fire bugspytkirtelkræft cellelinier (Capan-2, CFPAC-1 , HPAF-II, og SW1990). Metformin inhiberede celleproliferation på en dosis-afhængig måde i alle fire cellelinjer (Fig 3A). Metformin behandling aktiveret AMPK som bestemt ved phosphorylering af AMPK på Thr (172) i alle testede cellelinier, med en top-aktivering forekommer ved 4-8 timer efter behandling (fig 3B). I betragtning af, at AMPK-aktivering er kendt for at hæmme mTOR, vi yderligere analyseret effekten af ​​metformin behandling på phosphorylering status mTOR og dens downstream mål p70S6k og 4E-BP1. Interessant, observerede vi en forsinket hæmning af mTOR og nedstrøms target fosforylering, med nadir af observerede fosforylering af p70S6K og 4E-BP1 forekommer ved 48 timer i både CFPAC-1 og HPAF-II-celler (Fig 3C og 3D).

(a) Celler blev udpladet i fire eksemplarer i 96-brønds plader ved en densitet på 5×10

3 per brønd, inkuberet natten over og derefter behandlet med medium indeholdende enten PBS som en vehikelkontrol eller forskellige koncentrationer af metformin (0 -5 mM). Efter 48 timer blev proliferation indeks bestemt ved anvendelse af MTT-assayet og normaliseret til de af de vehikelbehandlede celler. Alle assays blev udført tre gange. (B) Phosphorylering af AMPKα og total AMPKα på forskellige tidspunkter efter behandling med 5 mM metformin. Behandlingen begyndte ved 0 timer (timer). (C) Phosphorylering af mTOR, p70S6K, og 4E-BP1 på forskellige tidspunkter efter behandling med 5 mM metformin. (D) Densitometri af phosphoryleret AMPKα, mTOR, p70S6K, og 4E-BP1 forhold til de samlede niveauer, der vises i (B) og (C).

AMPK kun delvis nødvendig for antiproliferativ virkning af metformin

anti-proliferative effekt af metformin er blevet primært tilskrives dets evne til at aktivere AMPK pathway. Vi antager, at den manglende vedvarende AMPK aktivering set i alle fire PDX tumorlinier kan forklare den manglende tumorvækst respons. Således udførte vi shRNA-induceret knockdown af en eller begge af de katalytiske underenheder af AMPK i pancreas cancercellelinier at bestemme, om de anti-proliferative virkninger af metformin ville blive påvirket. Vi fandt, at knockdown af AMPK α1 og /eller AMPK α2 delvist men ikke fuldstændigt vendt metformin evne til at inhibere celleproliferation (Fig 4A og 4B).

(A) shRNA knockdown af AMPKα underenheder i CFPAC-1 og HPAF -II cellelinier. (B) Proliferation af CFPAC-1 og HPAF-II cellelinier med stabil knockdown af AMPKα underenheder efter behandling med forskellige koncentrationer af metformin (0-5 mM). (C) Phosphorylering af mTOR og p70S6K i CFPAC-1 og HPAF-II cellelinjer med stabil knockdown af AMPKα underenheder.

Metformin synes at handle på mTOR i en AMPK-uafhængig måde

Derefter undersøgte vi, hvorvidt manglen på vedvarende p70S6K inhibering ses i P710 PDX tumor linje trods tegn på en vis vedvarende AMPK aktivering kan have været på grund af en AMPK-uafhængig mekanisme. Vi evaluerede effekten af ​​metformin på fosforylering af mTOR og p70S6K efter knockdown af AMPK α1 og /eller AMPK α2. CFPAC-1 og HPAF-II cellelinier med stabil knockdown af NS, AMPK α1 og /eller AMPK α2 (Fig 4A) blev behandlet med 5 mM metformin (Fig 4B og 4C). I begge cellelinier, havde knockdown af en eller begge underenheder ikke redde evne metformin til at inhibere vækst eller phosphorylering af mTOR og p70S6K, hvilket antyder, at evnen af ​​metformin til at inhibere mTOR og p70S6K er i det mindste delvis uafhængig af AMPK aktivering i disse celler linjer.

mTOR overekspression er tilstrækkelig til at overvinde de anti-proliferative virkninger af metformin, men kombinatorisk behandling med metformin og mTOR-hæmmere ikke producerer synergi

Fordi metformin undladt at opretholde hæmning af mTOR pathway som målt ved p70S6K fosforylering i vores langsigtede metformin behandlede PDX tumorer, og på grund af vores resultater, at metformin-induceret mTOR hæmning var i det mindste delvist AMPK-uafhængig, vi næste afgøres, om mTOR aktivering alene var tilstrækkelig til at ophæve virkningerne af metformin. Vi fandt, at overekspression af mTOR anvendelse af en myc-mTOR-konstruktionen var tilstrækkelig til at frembringe fuldstændig resistens væksthæmning og begrænse faldet i p70S6K phosphorylering efter metformin behandling (fig 5A og 5B). For at bestemme om at kombinere metformin med målrettede mTOR-hæmmere kan være en logisk terapeutisk strategi, behandlede vi cellelinier med konstant-forholdet doser af metformin og enten allosterisk mTOR inhibitor rapamycin eller den katalytiske mTOR inhibitor BEZ235, som vides at inhibere pankreatisk cancercellelinie vækst. Væksthæmning blev ikke forbedret på noget dosiskombination forhold til enkelt lægemiddel behandling, og ingen synergi mellem metformin og enten mTOR-hæmmer blev beregnet på et dosis ved hjælp af Chou-Talalay median effekt ligning (Fig 5C og 5D).

(a) Phosphorylering af p70S6K i og (B) proliferation af HPAF-II-celler efter behandling med 5 mM metformin efter transient ekspression af et transficeret myc-mTOR-konstruktionen. Brug af medianen virkning ligning beregning for kombination (CI) følgende 3 dages behandling med konstant-forholdet doser af metformin og enten (C) den allosteriske mTOR inhibitor rapamycin eller (D) den katalytiske mTOR inhibitor BEZ235 ikke producerede synergi (CI 1 ) ved enhver kombination dosis. Cl-værdier på 50% vækstinhibering: (C) CFPAC-1 1,54, HPAF-II 1,43; (D) CFPAC-1 1.30, HPAF-II 1.29. (* P 0,050, ** p 0,005, *** p 0,001).

Diskussion

Epidemiologiske undersøgelser i diabetespatienter har fundet, at patienter behandlet med metformin har en nedsat forekomst af multiple cancere, herunder pancreascancer [14-17]. Adskillige prækliniske studier af metformin som en anti-cancer terapeutisk har været lovende, demonstrerer imponerende tumor væksthæmning [20, 22, 33] og apoptose [34] af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. Imidlertid har cellelinje xenotransplantater generelt været upålidelige prædiktorer for narkotika reaktioner hos mennesker. Lonardo et al. evalueret effekten af ​​metformin på fire Bugspytkirtelkræft PDX tumor linjer og ligner tidligere cellelinje xenografundersøgelser, fundet betydelig vækst hæmning [21]. I modsætning hertil nye kliniske forsøg evaluering metformin bugspytkirtelkræft har hærdet den optimisme skabt af denne prækliniske arbejde. En dobbeltblind, randomiseret, placebokontrolleret fase II undersøgelse til evaluering af metformin i kombination med gemcitabin og erlotinib hos patienter med fremskreden kræft i bugspytkirtlen viste ingen forskel i resultatet som følge af metformin behandling [35]. En anden fase II forsøg kombinerer metformin med paclitaxel hos patienter med gemcitabin-refraktær sygdom undladt at opfylde sin primære endepunkt sygdomskontrolrate [36].

I denne undersøgelse observerede vi en ensartet manglende respons på metformin i fire PDX tumorlinier at vi evalueret. Flere potentielle årsager findes for de forskellige resultater mellem tidligere prækliniske arbejde i forhold til vores undersøgelse og de seneste kliniske forsøg. Først PDX tumorer er i sagens natur meget heterogene, fordi PDX tumorer passeres i bulk og er repræsentative ‘biopsier “af tilsvarende heterogene kilde patient tumorer. For det andet, selv om dosisintervallet i vores undersøgelse overlapper tidligere undersøgelser, farmakokinetik metformin optagelse er stadig uklart, [37]. Tumor mikromiljø og stromale indhold synes at påvirke metformin adgang til tumorceller, som kan føre til forskellige resultater mellem undersøgelser [21]. For det tredje, tumor volumen, hvor behandlingen blev indledt varierer mellem undersøgelser, der kan påvirke tumor sammensætning, specielt kræft stamceller byrde. Lonardo et al. og andre har vist, at kun dette stamceller subpopulation undergår apoptose som et resultat af metformin behandling, mens det store flertal af tumorceller oplever reversibel vækststandsning [18, 21]. Interessant, selvom Lonardo et al. fandt, at metformin var i stand til at begynde at bremse PDX tumorvækst, bemærkede de, at alle PDX tumorer til sidst skred på terapi [21], hvilket tyder på, at metformin monoterapi vil ikke være effektiv i patienter.

For at få indblik i mulige mekanismer modstand, vi evalueres yderligere to af vores fire PDX linjer og fandt, at resistens over for metformin kan være multifaktoriel og tumor-afhængig. For eksempel i P505, AMPK aktivering blev ikke opretholdt mens i P710, fortsatte tumorvækst skete trods nogle vedvarende AMPK aktivering. Vores efterfølgende resultater i cellelinier antyder, at dette kan være af to grunde. Først lader virkningen af ​​metformin på celleproliferation for kun delvist AMPK-afhængig. For det andet synes evnen af ​​metformin til at inhibere mTOR pathway i bugspytkirtelkræft også for kun delvist AMPK-afhængig. Tværs kræfttyper, i hvilken grad metformin afhængig AMPK aktivering til at inhibere væksten og ændre mTOR /p70S6K signalering er uklar og sandsynligvis celletype-afhængig. Hæmning af AMPK udtryk via lyddæmpning af den katalytiske AMPK α subunit hjælp specifikke inhibitorer af AMPK eller knockout af LKB1, opstrøms signal til AMPK aktivering, vendes de anti-proliferative virkninger af metformin i bryst- og ovariecancer celler [38-40]. Omvendt Ben Sahra et al. viste, at nedregulering af AMPK havde ingen virkning på metformin evne til at inhibere prostatakræft cellevækst og mTOR signalering [41]. I stedet fandt de, at metformin medførte mTOR hæmning og celle-cyklus anholdelse ved at aktivere mTORC1 inhibitor REDD1 [42]. Andre undersøgelser i bryst- og æggestokkræft cellelinier har også fundet, at virkningerne af metformin kan måske kun delvist afhængig af AMPK aktivering [43, 44]. Den anti-proliferative effekt af metformin blev opretholdt i æggestokkene cancercellelinie A2780 trods siRNA silencing af AMPKa1. Desuden metformin behandling var i stand til at dæmpe proliferation af både AMPKa1 /2 vildtype- og AMPKa1 /2 deficiente mus embryonale fibroblaster (MEF’er), skønt AMPKa1 /2 deficiente MEF’er var lidt mindre følsom over for metformin [43]. I brystcancercellelinier blev inhibering af HER2 ved metformin sig at være helt AMPK-uafhængig [44]. Nylige undersøgelser i bugspytkirtelkræft cellelinjer fandt, at metformin kan hæmme væksten uafhængigt af AMPK gennem opregulering af miR-26a [45], mens metformin virkninger på kræft i bugspytkirtlen stamceller kan medieres gennem reexpression af specifikke miRNA [18]. Disse resultater antyder, at modulering af miRNA ekspression kan være endnu en vigtig mekanisme bag de biologiske virkninger af metformin.

Taget sammen med de ovennævnte undersøgelser, vores resultater, at knockdown af AMPK subunits ikke redde de inhiberende virkninger af metformin på mTOR /p70S6K phosphorylering men at mTOR reexpression kunne vende de anti-proliferative virkninger af metformin, tyder på, at aktiveringen af ​​AMPK og inhibering af mTOR /p70S6K pathway af metformin er selvstændige begivenheder, der kan både bidrager til cancer cellevækst hæmning. Desuden kan regulering af AMPK ved metformin være celletype afhængig, og i bugspytkirtelkræft, kan de anti-proliferative virkninger af metformin være delvist eller stort set AMPK-uafhængig.

Samlet set vores undersøgelse viser, at selv om metformin hæmmer pancreas cancercellelinie proliferation, vil dens virkning på patientens tumorer sandsynligvis være forbigående og meget mere kompleks. Mens resistensmekanismer sandsynligvis involvere mTOR pathway aktivering, kan samtidig behandling med metformin og mTOR-hæmmere gøre meget for at forbedre effekten af ​​hverken terapi. er behov for yderligere undersøgelser for at afgøre, om metformin en dag kan give fordele til bugspytkirtlen kræftpatienter ved at udnytte dens komplekse metaboliske og signalering effekter i kombination med kemoterapeutika eller målrettede behandlinger.

Støtte Information

S1 Fig. Langsigtet metformin behandling påvirker ikke musen vægt eller tumor histologi.

(A) Vægt af mus over en 28 dage behandlingsforløb med enten 200 mg /kg eller 400 mg /kg metformin vist i forhold til baseline vægte. Hematoxylin og eosin-farvning af (B) P505 og (C) P710 patient-afledt xenotransplantattumorer efter 28 dage behandling med vehikel (venstre paneler) eller 400 mg /kg metformin (højre paneler) viser ingen forskel i tumor arkitektur, duktalt dannelse, eller stromal indhold. Scale barer er 300 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147113.s001

(TIF)

S2 Fig. Aktivering af AMPK og hæmning af p70S6K fosforylering i PDX tumorer ikke opretholdes efter 28 dages metformin behandling.

Phosphorylering af AMPKα og p70S6K i (A) P722 og (B) pt4 PDX tumorer efter 28 dage behandling med 400 mg /kg . metformin

doi: 10,1371 /journal.pone.0147113.s002

(TIF)

anerkendelser

forfatterne takker Charlene M. Santos ved University of North Carolina (UNC ) Lineberger Omfattende Cancer center Animal Studies Core, UNC PDX Program, Tissue Procurement Facility UNC, og UNC Translationel Pathology Laboratoriet for teknisk bistand.