PLoS ONE: Kræft inducerer cardiomyocyte Remodeling og Hypoinnervation i venstre hjertekammer af Mouse Heart

Abstrakt

Kræft er ofte forbundet med kakeksi, kardiovaskulære symptomer og autonom dysregulering. Vi testede, om ekstrakardiale kræft direkte påvirker innervation af venstre ventrikel myokardiet. Mus injiceret med Lewis lungecarcinomceller (tumor gruppe, TG) eller PBS (kontrolgruppe, CG) blev analyseret efter 21 dage. Hjertefunktion (ekkokardiografi), serumniveauer af TNF-α og IL-6 (ELISA), strukturelle ændringer af cardiomyocytter og deres innervation (design-baserede stereologi) og niveauer af innervation-relaterede mRNA (kvantitativ RT-PCR) blev analyseret. Grupperne adskilte sig ikke i forskellige funktionelle parametre. Serumniveauer af TNF-α og IL-6 var forhøjet i TG. Den samlede længde af axoner i venstre ventrikel blev reduceret. Antallet af tæt kerne vesikler pr axon profil blev reduceret. Nedsat myofibrillar volumen, øget sarkoplasmiske volumen og forøget volumen af ​​lipiddråber var tegn på metaboliske ændringer i TG cardiomyocytter. I hjertet, blev mRNA-niveauet af nervevækstfaktor reduceret hvorimod den β1-adrenerge receptor blev uændret i TG. I ganglion stellatum af TG, blev mRNA-niveauer af nervevækstfaktor og neuropeptid Y nedsættes og af tyrosin hydroxylase blev forøget. Sammenfattende kræft inducerer en systemisk proinflammatorisk tilstand, en signifikant reduktion i myocardial innervation og en katabolisk fænotype af cardiomyocytter i musen. Reduceret udtryk for nerve vækstfaktor kan forklare den reducerede myokardie innervation

Henvisning:. Mühlfeld C, Das SK, Heinzel FR, Schmidt A, post H, Schauer S, et al. (2011) Cancer inducerer cardiomyocyte Remodeling og Hypoinnervation i venstre hjertekammer af Mouse Heart. PLoS ONE 6 (5): e20424. doi: 10,1371 /journal.pone.0020424

Redaktør: Gian Paolo Fadini, Padova Universitet, Italien

Modtaget: 10. februar, 2011; Accepteret: April 26, 2011; Udgivet: May 26, 2011

Copyright: © 2011 Mühlfeld et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Excellence Cluster kardiopulmonær System (WK) og af Verein zur Förderung der Krebsforschung i Gießen eV (CM). SD blev finansieret delvist af ph.d.-uddannelsen molekylær medicin af det medicinske universitet i Graz. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cancer kakeksi er et komplekst syndrom klinisk manifesterer sig som progressivt tab af kropsvægt med eller uden reducerede fødeindtagelse, og det er korreleret med en dårlig prognose [1]. Den patologiske involvering af hjertet under disse betingelser blev beskrevet som en ny enhed af Burch et al. [2] og betegnet “kakektiske hjerte”. Udover ændringer i EKG og nedsat hjertefunktion størrelse i brystet røntgenbilleder, er det kakektiske hjerte karakteriseret ved tab af epicardiale fedt, stigning i lipofuscin granulat og fald i cardiomyocyte tværsnitsareal trods generelt normal hjertefunktion [3], [4] . Derudover er proteinmasse reduceret som følge af øget proteinkatabolisme [5].

Interessant er cancer associeret med funktionelle ændringer i det kardiovaskulære system, såsom nedsat hjertefrekvens variabilitet i akutte leukæmi patienter [6], øget hvilende hjertefrekvens, nedsat hvilende blodtryk og øget postural blodtryksfald i lungekræft patienter [7], og øget forekomst af kardiovaskulære autonom insufficiens som vurderet ved en række elektrokardiografiske og kliniske forsøg hos brystkræftpatienter [8], [9] . For nylig er en sammenhæng været en hypotese mellem kræft træthedssyndrom (en kombination af dyspnø, motion begrænsning og muskelsvaghed) og klinisk ikke-åbenlys hjertesvigt, hvilket tyder på træthed symptomer skyldes autonom dysfunktion [10]. Selv om disse undersøgelser klart peger på en inddragelse af hjertets innervation i kræft kakeksi, er systematiske undersøgelser om dette emne mangler hidtil.

innervation af hjertekamrene består overvejende af postganglioniske sympatiske axoner selv i begrænset omfang, også sensoriske og postganglioniske parasympatiske axoner er til stede [11], [12]. På lysmikroskopisk niveau, er immunhistokemi nødvendig for at visualisere umyelinerede kardiale nervefibre. Hver nerve fiber kan bestå af en eller flere axoner, hvis antal kan kun bestemmes ved elektronmikroskopi. Udover den klassiske neurotransmitter noradrenalin, sympatiske neuroner indeholder også neuropeptider der produceres i perikarya og lagres i vesikulære strukturer, der betegnes store tætte kerne vesikler (LDCV). LDCV er anterogradely transporteres gennem Axon og frigives ved briste eller højfrekvente fyring [13]. I tilfælde af kardiale sympatiske axoner, LDCV overvejende indeholder neuropeptid Y (NPY) [14].

Her har vi den hypotese, at cancer cachexia er forbundet med kvalitative og /eller kvantitative strukturelle ændringer af myocardial innervation. For at teste denne hypotese anvendte vi en musemodel for tumor kakeksi og undersøgt dens egenskaber med hensyn til serum cytokinniveauer og hjertefunktion. I denne model, udførte vi en detaljeret lys og elektronmikroskopisk analyse af den venstre ventrikel og ansat designbaserede stereologiske metoder til at kvantificere forskellige kendetegn ved cardiomyocytter og deres innervation. Derudover blev mRNA ekspressionsniveauer af forskellige proteiner relateret til kardial innervation kvantificeret i hjertet og ganglion stellatum, en større ganglion tilførsel sympatiske fibre til hjertet.

Resultater Salg

Dyr

fra det tidspunkt af tumorimplantation indtil afslutningen af ​​forsøget efter 21 dage, TG-mus tabt 2,32 ± 0,82 g mager legemsvægt mens musene i CG vundet 2,11 ± 0,37 g mager legemsvægt (p 0,001) validering musemodellen som en model for tumor kakeksi. Tumorerne selv havde en gennemsnitlig vægt på 3,3 ± 0,57 g. Der var ingen signifikante forskelle i vægten af ​​den venstre ventrikel mellem grupperne, men forholdet mellem venstre ventrikel og legemsvægt var signifikant højere i TG grund af nedsat legemsvægt (tabel 1).

ekkokardiografi

tabel 2 viser de data, der opnås ved ekkokardiografi i bedøvede, normotermiske mus. Ingen af ​​de parametre, afveg betydeligt mellem TG og CG angiver en bevaret hjertefunktion i tumoren gruppen ved hvilende betingelser.

TNF-a og IL-6 niveauer

serumniveauer af TNF-α og IL-6 blev signifikant forhøjet i TG sammenlignet med CG (tabel 3).

Kvantitativ RT-PCR

i hjertet, ekspressionen af ​​β1-adrenerge receptor var uændret i TG vs. CG. Endvidere blev ekspressionen af ​​nervevækstfaktor (NGF) faldt i TG sammenlignet med CG. Ekspressionsniveauer af begge TNF-receptorer (TNF-R1, TNF-R2) blev tredoblet eller mere, henholdsvis i TG vs. CG.

I stjerneformet ganglier af TG, ekspressionen af ​​NPY blev signifikant reduceret henviser udtryk for tyrosinhydroxylase, det hastighedsbegrænsende enzym til noradrenalin syntese, blev tredoblet. NGF var signifikant nedreguleret i tumor-bærende mus men ændringerne var mindre omfattende end ændringerne i senderen udtryk. Begge TNF-receptorerne blev væsentligt forbedret i TG vs. CG (tabel 4).

cardiomyocyte morfologi

På det lys mikroskopisk niveau, myokardiet optrådte normale med velbevarede cardiomyocytter, bredt åbnet kapillærer grund perfusion fiksering og glat bindevæv i interstitium. Der var ingen tegn på hjerte-atrofi eller interstitiel fibrose. Denne observation blev støttet af den samlede mængde og antal cardiomyocytter, som ikke adskiller sig væsentligt mellem grupperne (Figur 1). På elektronmikroskopisk niveau, de to grupper viste bemærkelsesværdige forskelle med hensyn til deres myofibriller og deres sarcoplasm. Som vist ved de repræsentative mikrografier og stereologiske data, blev den del af myofibriller volumen signifikant reduceret henviser fraktion det sarkoplasmiske volumen blev signifikant forøget i TG (figur 2). Den absolutte mængde af sarcoplasm blev væsentligt forbedret mens faldet i den samlede myofibrillære volumen ikke nåede statistisk signifikans (p = 0,06), sandsynligvis fordi andre faktorer som cardiomyocyte volumen og venstre ventrikel volumen indføre en højere variabilitet i dataene. Der blev ikke observeret nogen forskel i den nukleare og mitokondrie-tæthed eller volumen volumen (data ikke vist). Endvidere i TG et højere antal større størrelse lipiddråber i sarcoplasm var bemærket som afspejles i en højere samlet volumen på lipiddråber i den venstre ventrikel (figur 2). Denne stigning i lipiddråber er imidlertid alt for lav til at forklare stigningen i den samlede sarcoplasmic volumen.

Semithin tværsnit (1 um tykkelse) farvet med toluidinblåt ikke viste nogen forskel i dimensionerne af cardiomyocytter mellem kontrol (A) og tumorbærende mus (B). Men den subcellulære tilrettelæggelse af cardiomyocytter optrådte mindre tæt i tumoren gruppen. Paraffin langsgående sektioner (5-7 um tykkelse) farvet med Masson-Goldner trichrom ikke beviser for en øget collagenaflejringen i tumor-bærende mus (D) i forhold til at styre mus (C). Scale bar for A og B = 10 um. Scale bar for C og D = 20 um.

Electron mikrografier af myocardium fra kontrol (A, C, E) og tumorbærende mus (B, D, F). A og B demonstrere den øgede mængde af sarcoplasm og tab af myofibriller i mere eller mindre i længderetningen udskåret myocytter. Scale bar = 5 um. C og D viser tydeligt stigningen i lipid dråbe (LD) størrelse og antal i tumoren gruppen i diagonalt sektionerede myocytter. Scale bar = 1 um. E og F viser nervefibre, der indeholder tre axoner (stjerne) hver. Der var ingen synlige forskelle i morfologi. De omkringliggende myocytter er mere eller mindre på tværs skæres. Forkortelser:. Cap = kapillar, mf myofibriller, mi = mitokondrier

Lipotoxicity

De biokemiske analyser af triglycerid indhold bekræftede stigningen i lipider i cardiomyocytter. Malondialdehyd og andre thiobarbitursyrereaktive stoffer er meget reaktive forbindelser, der anvendes som markører for oxidativt stress. Brug to tests til måling af disse stoffer, har vi ikke finde en signifikant forskel mellem CG og TG (tabel 5). Endepunktet for den toksiske virkning af lipider i hjertet er cardiomyocyte apoptose. Men caspaseaktivitet ikke forskellig mellem grupperne (tabel 5). Derudover fandt vi ikke nogen morfologiske beviser for cardiomyocyte apoptose ved elektronmikroskopi.

Samlet længde og morfologi myokardie axoner

Figur 3 viser morfologi myokardie innervation og stereologiske data af Axon karakterisering. Den samlede længde af axoner ramifying mellem cardiomyocytter blev reduceret til mindre end halvdelen i TG sammenlignet med CG. Men den relative hyppighed af nervefibre med et bestemt antal axoner ikke variere mellem grupperne. Der var også nogen forskelle i størrelsen af ​​nerve fiber diametre selv om der var en tendens til en mere hyppige forekomst af axoner med mindre diametre i tumor mus. Interessant nok blev antallet af neuropeptid lagring LDCV pr axon profil reduceret med ca. 50% i TG sammenlignet med CG.

Hverken mængden af ​​cardiomyocytter (A, åbne cirkler) eller volumenet af det interstitielle rum (A, fyldte firkanter) var forskellig mellem grupperne. Desuden er antallet af cardiomyocytter var ens blandt grupperne (B). Mængden af ​​sarcoplasm (C, fyldte firkanter) blev øget betydeligt i tumoren gruppen mens mængden af ​​myofibriller (C, åbne cirkler) tendens til at være mindre. Et større volumen af ​​lipiddråber blev fundet i cardiomyocytter af tumorbærende end af kontrolmus (D). Bemærk den logaritmiske skala på y-aksen (D). Den samlede længde af axoner blev reduceret til halvdelen i tumoren gruppen (E), mens den relative hyppighed af nervefibre med et vist antal axoner der ingen forskel på grupperne (F). Antallet af LDVC pr axon profil blev reduceret i tumoren gruppen (G), mens diameteren af ​​axoner var ens i begge grupper (H). Hver cirkel eller firkant repræsenterer dataene for et individuelt dyr. De vandrette bjælker demonstrerer gruppen betyder.

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse testede hypotesen om, at kronisk eksponering for en stor ekstrakardiale tumor forårsager strukturelle og funktionelle ændringer af myokardie innervation i mus. Hypotesen var baseret på flere rapporter om funktionelle ændringer i hjertet hos patienter, der lider af forskellige former for kræft [6] – [9], og observation af degenerative strukturelle læsioner af cardiomyocytter i kræft kakeksi [2]. Efter aftale med vores hypotese, observerede vi en markant reduktion af den samlede længde af axoner innerverer venstre ventrikulære cardiomyocytter, og antallet af neuropeptid opbevaring organeller, LDCV, i disse axoner. Desuden observerede vi et fald på myofibrillar volumen men steg sarcoplasm og lipid dråber volumen inde cardiomyocytter. De strukturelle ændringer var ledsaget af reducerede ekspressionsniveauer af NGF i hjertet og stjerneformet ganglion, reduceret ganglie NPY-ekspression, men forbedret tyrosinhydroxylase ekspression.

musemodel for Lewis lungecarcinom anvendt i denne undersøgelse er blevet veletableret for mange år [15] og er kendt for at forårsage en væsentlig tumor kakeksi [16]. I denne undersøgelse tiden mellem implantation af tumorceller og aflivning af dyrene var 21 dage; denne varighed var tilstrækkelig til at inducere en tumorbyrde på 12-15% af den samlede kropsvægt og en kakektiske tilstand simulerer klinisk scenarie af cancer kakeksi. Trods ændringerne i kropsmasse hjerter Tg mus havde en lignende våd masse som de CG-mus, som står i kontrast til andre undersøgelser under anvendelse af faste tumorer [17]. Disse forskelle kan skyldes lavere tumorbelastning, varighed af eksperimentet musestamme eller tumor celletype. Som diskuteret nedenfor er stereologiske resultater klart angive en katabolisk fænotype af cardiomyocytter selvom cardiac atrofi i betydningen reducerede masse ikke skete. Den funktionelle ydeevne af hjertet blev vurderet ved ekkokardiografiske parametre under hvilende betingelser. Samlet set havde hjertefunktion ikke variere mellem CG og TG. Dette er i modsætning til en nylig undersøgelse om mus inokuleret med colon-26 adenocarcinomaceller af Tian og medarbejdere [17] som rapporterede et signifikant fald i fraktioneret afkortning i tumorbærende mus sammenlignet med kontrolmus. Men deres undersøgelse viste, også en anden myokardie morfologi, herunder fibrose og forvaltningsmæssigt mitokondrie cristae, som ikke blev observeret i den foreliggende undersøgelse. Derfor synes der at eksistere generelle forskelle i dyremodeller mellem deres og vores undersøgelse. I overensstemmelse med andre undersøgelser under anvendelse af Lewis-lungecarcinom [18], observerede vi en systemisk pro-inflammatorisk tilstand som karakteriseret ved forhøjede serumniveauer af IL-6 og TNF-α. I human cancer kakeksi, er en række cytokinniveauer forhøjet med TNF-α er nøglen cytokin [19]. De overskydende cytokiner kan stamme både fra tumorceller og fra immunceller bliver stimuleret af direkte eller indirekte signaler af tumoren [19]. Pro-inflammatoriske cytokiner, især TNF-α, er kendt for at interagere med nervesystemet og kan således påvirke neuronal metabolisme og overlevelse [20] – [22], men vores data giver ikke en årsag og virkning mellem inflammation og neuronal fænotype som andre patofysiologiske begivenheder er til stede i tumoren kakeksi model, der kan påvirke myokardie innervation (f.eks vægttab).

de vigtigste resultater af den foreliggende undersøgelse er en reduktion i myokardiets innervation og et fald i LDCV pr axon profil til ca. 50% af kontrolværdier. Disse morfologiske data er godt understøttet og suppleret af QRT-PCR analyse, der viser en nedsat ekspression af NPY i neuronerne i ganglion stellatum mens mRNA-niveauer af tyrosin hydroxylase optimeres med TG. Desuden blev NGF mRNA ekspressionsniveauer reduceret i hjertet og stjerneformet ganglion. Faldet i den samlede længde af axoner ramifying mellem cardiomyocytter er tegn på atrofiske forandringer i det autonome nervesystem af hjertet. Denne nye fund bekræfter vores hypotese og støtter inddragelse af hjerte-autonome nervesystem i kræftsygdommen. En reduktion i den samlede længde af axoner kan stamme i) fra et tab af neuroner i ganglion, ii) fra et tab af arborisation af hver neuron eller iii) fra tabet af individuel Axon længde. Vores undersøgelse viser, at reduktionen af ​​den samlede axon længde skyldes hovedsageligt et fald i nerve fiber tæthed, ikke på grund af et reduceret antal axoner pr nerve fiber. Imidlertid iagttoges den formindskede nerve fiber tæthed i hele ventrikel uden pletter af komplet denervering. Således kan resultatet enten stammer fra en degenerativ proces, der starter i periferien af ​​Axon grene eller er baseret på en strukturel og /eller metabolisk lidelse i nervecelle kroppen. Undersøgelser i homozygote mus med null mutationer i NGF eller NGF-receptor-tyrosinkinase-gen har vist, at opretholdelsen af ​​neuronerne og deres arborisation i det sympatiske nervesystem afhænger af udbud med NGF fra målvævene [23]. Den reducerede udtryk for NGF i hjerte og stjerneformet ganglion gør det meget sandsynligt, at en mangel på NGF spiller en kausal rolle i reduktionen af ​​myocardial innervation. Interessant er der også tegn på, at de metaboliske funktioner af neuronerne forstyrres som indikeret ved reduktionen i antallet af LDCV og den nedsatte NPY-mRNA-ekspression. I modsætning til catecholamin-holdige små vesikler, disse LDCV indeholder neuropeptider som syntetiseres i soma af neuronerne og anterogradely transporteres til periferien af ​​axonerne. I hjertet, LDCV primært indeholde NPY som har vasoconstrictory effekter og serverer trofiske funktioner på cardiomyocytter [24]. Det inducerer cardiomyocyte proteinsyntese [25] og stimulerer hypertrofi [26]. Reduktionen af ​​NPY-holdige LDCV kan i det mindste delvis ansvarlig for reduceret indhold af myofibriller inde i cardiomyocytter. Interessant selvom NPY blev anset for at spille en stor rolle i anoreksi og kakeksi baseret på dens centrale reduktion i disse betingelser [16], målinger af NPY plasmaniveauer i humane kontrol- og kræftpatienter afslørede ikke forskelle [27]. Ikke desto mindre er det stadig diskuteret, om at påvirke dette system kan svække kræft kakeksi [28]. Den vigtigste neurotransmitter af de sympatiske neuroner (noradrenalin) syntetiseres ud fra tyrosin gennem forskellige trin, der enzymatisk katalyserede. Det hastighedsbegrænsende enzym, tyrosinhydroxylase, blev fundet at være opreguleret i ganglion stellatum i TG som synes at være en kontra-reguleringsmekanisme til den reducerede innervation af myokardiet. Reduktionen af ​​axon filialer i venstre ventrikel kan derfor opvejes af forbedret catecholamin produktionen og dermed kan forklare, hvorfor vi ikke afsløre eventuelle funktionelle forskelle under hvile betingelser. På den anden side, en helt denerveres hjerte præsenterer en meget konstant slagfrekvens men ingen funktionel svækkelse under hvile [29], således at funktionelle ændringer forbundet med tab af eller forstyrret myocardial innervation kan snarere blive tydelige under stressbetingelser eller ved analyse af specifikke parametre sådanne som hjertefrekvens variabilitet. Desværre, på grund af kompleksiteten af ​​modellen (cardiomyocyte atrofi, skeletmuskelatrofi, anæmi) er det næppe muligt at udføre en stresstest, der klart ville skelne mellem ændringer i myokardie innervation og andre ekstrakardiale karakteristiske faktorer.

cardiomyocyte rum i tumoren mus blev hovedsageligt kendetegnet ved en reduktion af myofibriller, og en stigning i sarcoplasm og lipiddråber. Undersøgelser af patologien for human myocardium, opnået fra hjerter fra patienter, som var døde af cancer kakeksi, havde vist formindsket tværsnitsareal af cardiomyocytter og en stigning i lipofuscin granulat [2], [3]. Delvis som følge af artsforskelle, disse resultater afviger fra dem, der opnås i den foreliggende undersøgelse. For eksempel, i modsætning til mennesker, hvor alder er relateret med en stigende mængde af lipofuscin, dette ikke forekommer i vid udstrækning i murine cardiomyocytter, sandsynligvis på grund af den korte levetid af mus. Den reducerede tværsnitsareal af cardiomyocytter, som beskrevet af Burch et al. [2] er tegn på kardial atrofi. Men i vores model var der ingen fald i det samlede volumen eller antal cardiomyocytter. Dette kan skyldes en mere avanceret sygdomstilstand hos de humane hjerter, at tidsforløbet mellem sygdom begynder og analyse (21 dage i mus i forhold måneder eller år hos mennesker) og selvfølgelig som følge af forskelle i kompleksiteten af ​​sygdom (ingen metastase i mus, kun mild kakeksi). Hos kaniner udsat for cancer kakeksi, var der ingen apoptotiske cardiomyocytter i modsætning til andre organer, hvor en stor mængde celler undergik apoptose [30]. På ultrastrukturelle niveau, dog et tab af myofibriller observeret, hvilket blev ledsaget af en stigning i sarkoplasmatiske volumen. Faldet i myofibriller er indikativ for en ubalance mellem nedbrydningen protein og syntese begunstige proteinkatabolisme [5]. På grund af den uændrede volumen af ​​cardiomyocytter ændringerne i myofibrillar /sarcoplasmic volumen ikke kan induceres ved cellulær ødem. En interessant strukturel observation var stigningen i lipid dråber, som blev bekræftet af biokemiske målinger af triglycerider. I tumor kakeksi, er fedtsyrer frigjort fra fedtvæv og opkoncentreres i andre celletyper, hvor de kan forårsage lipotoxic virkninger [31], [32]. Cardiac lipotoxicity involverer dannelse af reaktive oxygenarter og påbegyndelsen af ​​apoptotiske veje [33]. I den aktuelle analyse blev lipidperoxidation vurderes ved måling malondialdehyd og associerede forbindelser, og apoptose blev vurderet ved en caspaseaktivitet assay og morfologisk evaluering. Da ingen af ​​disse parametre var signifikant forskellig mellem TG og CG, konkluderer vi, at observationerne af denne undersøgelse ikke er relateret til lipotoxicity. Selv om den nøjagtige funktionelle betydning af de observerede ultrastrukturelle ændringer af cardiomyocytter mangler at blive undersøgt, er det meget sandsynligt, at disse ændringer er i direkte forhold til den manglende trofiske NPY stimulus via NPY Y5 receptoren [34] og kan blive funktionelt relevant, hvis iltbehov hjertet stiger. På grund af den relativt store hjerte-plasticitet disse ændringer ikke nødvendigvis føre til en betydelig forringelse af hjertefunktionen [35].

Sammenfattende denne undersøgelse for første gang viser, at kræft kakeksi er forbundet med markante strukturelle ændringer af det autonome innervation af hjertet, herunder både svækkelse af den strukturelle integritet af neuron (formindsket total axon længde) og organel tab. Samtidig er de mængden af ​​lipid og antallet og omfanget af lipid dråber steg i cardiomyocytter og myofibrillar volumen faldt, hvilket er i overensstemmelse med begrebet en kontinuerlig trofisk støtte af cardiomyocytter ved autonome neuroner.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle forsøgene dyr blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen (GZ 66,010 /0085-II /10b /2009) blev godkendt af den østrigske udvalg om etik dyreforsøg (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung).

Dyr

Female C57BL /6J mus blev holdt på en regelmæssig lys-mørke-cyklus (12 timer lys, 12 h mørk) og holdt på en standard laboratoriefoder diæt (4,5% vægt /vægt fedt). Mus anvendt til injektion af tumorceller samt kontroldyr var 8-9 uger gamle. Under forsøgene fødeindtagelse samt kropsvægt blev overvåget dagligt

Tumor implantation

Mus blev tilfældigt opdelt i to grupper:. Styre ikke-tumor-bærende mus (CG, n = 18) og mus, som blev injiceret med Lewis lungecarcinomceller (TG, n = 18). Carcinomaceller blev opretholdt i cellekultur i DMEM høj glucose medium suppleret med 10% (vol /vol) FBS, 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. Efterfølgende 2 × 10

6 LLC-celler, opnået fra en eksponentielt prolifererende celle-kultur blev injiceret subkutant under dyrets hals. Søskende mus blev injiceret med PBS på samme sted for at tjene som skinkontroller. Både kontrol- og tumorbærende mus blev aflivet efter 21 dage. I separate sæt af eksperimenter blev musene anvendt (i) til ekkokardiografi (n = 4 i tumor, n = 5 i kontrolgruppen) og stereologi (n = 5 i tumor, n = 6 i kontrolgruppen), (ii ) til måling cardiac lipidindhold, caspaseaktivitet, lipidperoxidation og serum cytokinniveauer (n = 6 i hver gruppe), og (iii) til måling organ, venstre ventrikel og tumorvægt og for polymerase kædereaktion af venstre ventrikel og stjerneformet ganglion ( n = 6 i hver gruppe). Forskelle i antallet af dyr, der anvendes til ekkokardiografi og stereologi er forårsaget af udelukkelse af dyr, der holdt op med at trække vejret spontant under anæstesi (ekkokardiografi), eller at der ikke er korrekt fastsat af vaskulær perfusion (stereologi).

Ekkokardiografi

2D guided M-mode ekkoer (30 MHz) blev opnået fra synspunkter på kort og lang akse på niveau med den største LV-diameter ved anvendelse af en VS-VEVO 770 High resolution Imaging System (Visualsonics, Toronto, Canada) udstyret med en 30 MHz RMV (Real tid microvisualization) scanning hoved. Mus blev bedøvet let med 2% isofluran og fik lov til at ånde spontant. Brystet blev barberet, akustisk gel blev påført, og en opvarmning pad blev anvendt til at opretholde normotermi. Mus blev afbildet i et lavvandet venstre lateral decubitus position. Venstre ventrikel ende-diastolisk og end-systoliske dimensioner blev målt fra originale tracings ved hjælp af forkant konventioner American Society of Ekkokardiografi. Venstre ventrikel procent fraktioneret afkortning blev beregnet som tidligere beskrevet [36].

TNF-α og IL-6 ELISA

Blodprøver blev taget fra bedøvede kontrol og tumorbærende mus ved retro-orbital punktering. Serummet blev frosset ved -20 ° C. Serumniveauer af TNF-α og IL-6 blev målt ved anvendelse af TNF-a-ELISA ReadySETGo (88-7324, eBiosciences, San Diego, USA) og muse-IL-6-ELISA ReadySETGo (88-7064), eBiosciences, San Diego, USA) . Pladen blev endelig aflæst ved 450 nm.

Triglycerid måling

triglycerider blev ekstraheret fra hjertevæv kontrol- og tumor-bærende mus ved anvendelse hexane:isopropanol og forsæbes ved anvendelse af 1% Triton-x opløst i chloroform. De organiske opløsningsmidler blev fordampet ved hjælp N

2 gas og triglycerid indhold blev målt ved hjælp af triglycerid FS kit (DIASYS, Tyskland) i henhold til leverandørens manual. Triglyceridniveauer blev normaliseret til vævet vægt.

Måling af lipidperoxidation og caspaseaktivitet

At evaluere forekomsten af ​​lipotoxic virkninger på cardiomyocytter, lipidperoxidation blev bestemt ved måling malondialdehyd og apoptose blev bestemt ved måling caspaseaktivitet.

hjertevæv blev vasket grundigt med heparin-PBS-opløsning indeholdende 1 mM EDTA og homogeniseret i 500 pi homogeniseringsbuffer (0,25 M saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM deferoxaminmesylat , 1 mM PMSF) ved 4 ° C. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse RC-DC-proteinassay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) fra supernatanten. Lipidperoxidation blev målt i supernatanten ved hjælp af Oxiselect MDA adduktet ELISA-kit (STA-332, Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) og TBARS-assay (STA-330, Cell Biolabs) ifølge fabrikantens protokol.

til måling af caspase 3/7 aktivitet, blev 15 til 25 mg hjertevæv homogeniseret i 300 pi homogeniseringsbuffer (25 mM Hepes pH 7,5, 5 mM EGTA, 1 mM Pefabloc SC, 1% protease inhibitor cocktail [v /v ]) (P8340, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ° C. Lysatet blev centrifugeret ved 13.000 g i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev opsamlet, og proteinindholdet blev målt ved anvendelse af DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Caspase-aktivitet blev bestemt ved at inkubere 50 ug protein i 100 pi caspase-Glo®3 /7-reagens (Promega, Madison, WI, USA) i 1,5 timer ved 20 ° C, og luminescens blev bestemt ved anvendelse af et luminometer (LUMIstar Optima BMG Labtec, Offenburg, Tyskland).

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra hjerter og stjerneformet ganglier af kontrol og tumorbærende mus (n = 6 hver) af Trizol-reagens (Invitrogen , Carlsbad, Californien, USA) ifølge producentens protokol. Et mikrogram totalt RNA blev transkriberet omvendt til cDNA under anvendelse af de høj kapacitet cDNA revers transkription kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført under anvendelse af genspecifikke primere købt hos MWG-Biotech (Ebersberg, Tyskland) (tabel 6). 18 s RNA blev anvendt som intern kontrol. Alle reaktioner blev udført i triplikater. Kvantitativ RT-PCR blev udført på en 7900T standard rea-ltime PCR-system (Applied Biosystems) under anvendelse af SYBR green som påvisning Fluorofor. Resultaterne er præsenteret som relative ekspressionsniveauer efter beregning baseret på delta delta C

metode T [37].

vævsfiksering, prøvetagning og forarbejdning

Efter ekkokardiografi, mus blev antikoaguleret med 500 IE heparin ip, bedøvet med isofluran og dræbt ved cervikal dislokation 3 min senere. Hjertet blev derefter udskåret, monteret i et Langendorff apparat, perfunderet med 4% paraformaldehyd i phosphatpuffer retrogradt via aortaen i 10 minutter og holdes i paraformaldehyd ved 4 ° C indtil yderligere forarbejdning. Scale bar = 50 um.