PLoS ONE: Cystein dioxygenase 1 Er et tumorsuppressorgen Lyddæmpet af Arrangøren Methylering i Multiple Menneskelig Cancers

Abstrakt

Den menneskelige

cystein dioxygenase 1 Hotel (

CDO1

) gen er en non-hæm struktureret, jernholdig metalloenzym involveret i omdannelsen af ​​cystein til cystein sulfinat, og spiller en central rolle i taurin biosyntese. I vores søgen efter nye methylerede genpromotorer, har vi analyseret differential RNA ekspressionsprofiler af colorektal cancer (CRC) cellelinier med eller uden behandling af 5-aza-2′-deoxycytidin. Blandt de identificerede gener, blev

CDO1

promotor sig at være forskelligt methylerede i ubearbejdet CRC væv med høj frekvens sammenlignet med normale colon væv. Desuden er en statistisk signifikant forskel i hyppigheden af ​​

CDO1

promotor methylering blev observeret mellem primære normale og tumorvæv afledt af bryst, spiserør, lunge, blære og mave. Nedregulering af

CDO1

mRNA og protein niveauer blev observeret i kræftceller og tumorer afledt af disse vævstyper. Angivelse af

CDO1

blev tæt kontrolleret af promotor methylering, tyder på, at promotor methylering og lyddæmpning af

CDO1

kan være en fælles begivenhed i menneskets carcinogenese. Desuden tvunget udtryk for fuld-længde

CDO1

i humane cancerceller markant nedsat tumor cellevækst i en

in vitro

cellekultur og /eller en

in vivo

mus model, mens knockdown af

CDO1

øget cellevækst i kultur. Vores data implicerer

CDO1

som en ny tumorsuppressorgen og en potentielt værdifuld molekylær markør for human cancer

Henvisning:. Brait M, Ling S, Nagpal JK, Chang X, Park HL, Lee J et al. (2012) Cystein dioxygenase 1 Er et tumorsuppressorgen Lyddæmpet af Arrangøren Methylering i flere kræftformer hos mennesker. PLoS ONE 7 (9): e44951. doi: 10,1371 /journal.pone.0044951

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Januar 20, 2012; Accepteret: 14. august 2012; Udgivet: 27. september 2012 |

Copyright: © Brait et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute (U01-CA84986 tidlig påvisning Research Network) og Flight Attendant Medical Research Institute (Myoung S. Kim). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Under en licensaftale mellem Oncomethylome Sciences og Johns Hopkins University, D. Sidransky er berettiget til en andel af royalty modtaget af universitetet på salget af produkter, der er beskrevet i denne artikel. D. Sidransky ejer Oncomethylome Sciences, SA bestand, der er underlagt visse restriktioner under universitetet politik. D. Sidransky er en betalt konsulent til Oncomethylome Sciences, SA og er en betalt medlem af selskabets Scientific Advisory Board. Den Johns Hopkins University i overensstemmelse med sin interessekonflikter politikker styrer vilkårene i denne aftale. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft forårsages af afvigende genregulering, herunder inaktivering af negative regulatorer af celleproliferation ( herunder tumorsuppressorgener; GTS) og aktivering af positive regulatorer (såsom oncogener). Foruden genetiske ændringer involverer mutationer af onkogener og GTS, kan kræftfremkaldende proces forekomme gennem epigenetiske ændringer i genpromotorer [1]. Epigenetiske ændringer, arvelige ændringer i genekspression, som forekommer uden ændringer i DNA-sekvensen, bidrage til udvikling og progression af tumorceller [2], og anses for at være kendetegnende for kræft. DNA methylering og histonacetylering er de hyppigste og studerede epigenetiske ændringer [1]. Der er CG-rige regioner kendt som CpG-øer, som kan være placeret i 5′-enden regionen, herunder promotor, utranslaterede region og exon 1 af eventuelle gener med TSG-aktivitet [3]. CpG-øer er normalt ikke methyleret i normale celler [3], men afvigende hypermethylering i CpG-øer, som fører til transkriptionel inaktivering og gendæmpning kan være tidlige begivenheder i carcinogenese og anses for at være en fælles mekanisme for tab af TSG funktion i humane cancere [1], [4]. I øjeblikket er det almindeligt accepteret, at epigenetiske ændringer selv prædisponere for genetiske ændringer under tumorigenese [5]. Klinisk kan TSG methylering anvendes som en epigenetisk biomarkør for tumor diagnose og prognose forudsigelse. Således kan viden om methylering mønstre hele genomet med til at identificere de vigtigste GTS inaktiveret under tumordannelse [6], [7], [8].

pattedyr

cystein dioxygenase

(

CDO

, EF 1.13.11.20) er et afgørende enzym for menneskers sundhed involveret i den biologiske nedbrydning af giftigt cystein og derved regulering af koncentrationen cysteinet i kroppen. Det er en ikke-hæm struktureret, jernholdig metalloenzym involveret i omdannelsen af ​​cystein til uorganisk sulfat, og spiller en central rolle i taurin biosyntese [9]. Den åbne læseramme af

CDO

gen koder for et protein på 200 aminosyrer (molekylvægt 23 kd, som binder én Fe

2

– ion pr molekyle). Mus

CDO

og rotte

CDO

har en identisk aminosyresekvens, der er 92% identisk med human

CDO

, og de fleste aminosyresubstitutioner konservative erstatninger.

CDO

gen spænder omkring 15 kb og indeholder 5 exons. 5′-flankerende region af det humane

CDO

genet indeholder adskillige formodet konsensus

cis

virkende regulatoriske sekvenser, især til binding af hepatisk nuklear faktor-3 (HNF-3) og dens homologer, som er kendt for at være involveret i lever-specifik gentranskription. Tilstedeværelsen af ​​disse konsensus bindingssteder er i overensstemmelse med det højeste niveau af

CDO

mRNA findes i lever ekstrakter sammenlignet med andre vævsekstrakter (nyre, lunge og hjerne) [10]. Der er to typer af CDO; cytosol (CDO1) og membranbundne (CDO2), og murine CDO1 er blevet postuleret at være involveret i reguleringen af ​​protein funktion og antioxidant forsvarsmekanismer gennem sin evne til at oxidere cysteinrester [11].

Den menneskelige

CDO1

gen er placeret på kromosom 5 q23.2 som ofte slettet i fremskreden lungekræft [12]. Staub et al. [13] antages, at sletning eller epigenetisk inaktivering af kromosomale område 5 q23.2 hvor

CDO1

er placeret er en hyppig mekanisme bidrager til kolorektal tumorigenese;

adenomatøs polypose coli

(

APC

) og muteret i kolorektal cancer

(

MCC

) ligger i omegnen af ​​5 q23 [12]. Det er stærkt udtrykt i leveren og placenta, og svagt i hjerte, hjerne og bugspytkirtel [14]. Cystein regulerer CDO1 omsætning gennem Ubiqutin-26S proteasom-medieret nedbrydning [15], og et højt niveau af cystein er cytotoksisk og kan forårsage reumatoid arthritis [16], [17], [18], Parkinsons sygdom [17], Alzheimers sygdom [ ,,,0],17], øget risiko for hjerte-kar-sygdomme [19], og uønskede graviditetsudfald [20]. For nylig, overekspression af CDO1 blev beskrevet for Sézary syndrom, en aggressiv kutant T-celle lymfom [21].

Vi har tidligere rapporteret et sæt kandidatgener, der omfatter en del af den nye “kræft methylome” ved hjælp af en ny promotor struktur algoritme og microarray data genereret fra 22 cancer cellelinjer afledt fra 5 store typer kræft [22], [23]. I vores tidligere undersøgelser, undersøgte vi nyligt identificerede cancer-specifikke methylerede gener i et panel af 300 primære tumorer, der repræsenterer 13 typer af kræft;

oncostatin M receptor-β Hotel (

OSMR

) og

β-1,4-galactosyltransferase-1 Hotel (

B4GALT1

) var to af de nye gener identificeret i undersøgelsen skal methyleres i primære CRC væv, men sjældent i tilsvarende normale tilstødende slimhinde og i ikke-maligne normale colon væv [23]. Desuden er en kombination af farmakologisk demaskering og oligonukleotid microarray analyse [24], [25], [26] det muligt for os at finde hidtil ukendte methylerede gener i esophageal pladecellecarcinom (ESCC) og CRC-cellelinier og primære væv.

NEFH

[27],

DFNA5

[26],

OSMR

[23],

LIFR

[28] og

NMDAR2B

[25] var repræsentative gener, vi fandt epigenetisk inaktiveret i menneskelig ESCC og CRC ved høj frekvens. mRNA udtryk for disse gener i cancer væv var også signifikant nedreguleret i forhold til normale væv. Desuden funktionelle undersøgelser antydet tumor undertrykkende roller for disse gener i humane CRC og ESCC cellelinjer.

I denne undersøgelse rapporterer vi, at

CDO1

var en af ​​de kandidatgener identificeret ved kombinationen af farmakologisk demaskering strategi og udtryk microarray analyser. Vi observerede hyppige promotor methylering og nedregulering af

CDO1

i flere typer af human cancer. Funktionelle undersøgelser viste, at

CDO1

havne tumor undertrykkende aktivitet.

Resultater

CDO1

er epigenetisk inaktiveret i Human Colon Cancer

I vores søgen efter gener epigenetisk stumme i human CRC udførte vi en kombination af farmakologisk demaskering og efterfølgende differentiel microarray analyse under anvendelse mikroarrays indeholdende 22,284 transkripter (Affymetrix) [26]. Vi bruges demethyleringsmiddel 5-Aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) at genaktivere gener epigenetisk stumme i tre CRC cellelinier (HCT116, HT29 og DLD-1). Vi har tidligere rapporteret udvælgelseskriterier til identifikation gener ofte inaktiveret i tyktarmskræft ved DNA-promotor-methylering [26]. Vi re-analyseret kandidat tumorsuppressorgener på vores gen liste og fandt, at ekspressionen af ​​

cystein dioxygenase 1 Hotel (

CDO1

) var “fraværende” før farmakologisk behandling, men ‘nuværende’ efter 5- Aza-dC behandling i alle tre CRC testede cellelinjer. Den fraværende og re-aktiveret

CDO1

udtryk med 5-Aza-dC i fem CRC cellelinier (HCT116, HT29, DLD-1, RKO og SW480) blev godkendt af RT-PCR-analyse (fig. 1A ).

A, Angivelse af

CDO1

i CRC-cellelinjer blev undersøgt ved RT-PCR-analyse. Ingen basal udtryk for

CDO1

blev set i alle CRC-cellelinjer, og alle disse cellelinjer nærede

CDO1

methylering (M). Lyddæmpet

CDO1

blev reaktiveret efter behandling med demethyleringsmiddel, 5-Aza-dC, hvilket indikerer, at

CDO1

methylering korrelerer tæt med tab af genekspression i CRC-cellelinjer. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. m, celler behandlet med kun køretøj; a, celler behandlet med 5-aza-dC (5 uM i tre dage). L, 1 Kb Plus DNA-stige. B, Methylering status for individuelle CpG’er af øen i 5 CRC cellelinier og 21 par af primære CRC (PT) og deres tilsvarende normale colon væv (PN) er vist. I alt 38 CGs blev nummereret fra første til sidste CG i sekvenserne som angivet. Sort cirkel, methylering; hvid cirkel, unmethylation; grå cirkel, sameksistens mellem methylerede og umethylerede alleler; stiplede cirkel, ubestemt. C, Analyse af

CDO1

promoter aktivitet ved luciferase reporter assay i

CDO1

ekskluderet (HCT116) og -positive (HEK293) celler. Promotorkonstruktionerne (pGL2-

CDO1

– # 1 og – # 2) blev forbehandlet med eller uden

Sss

jeg methylase i 8 timer før transfektion. Høj aktivitet af

CDO1

promotor blev påvist i HEK293 hvor

CDO1

blev udtrykt. Data er udtrykt som fold forøgelse i forhold pGL2-grundlæggende aktivitet. Eksperimenter blev udført tre gange, og værdier angiver middelværdier ± SD. Middelværdier er vist. D. Scatter plot af

CDO1

methylering niveauer i væv og cellelinier (CL) (til venstre). TaqMan methylering værdier (TaqMeth V) er beskrevet i Materialer og metode. TaqMan-MSP blev udført i dobbeltbestemmelse format, og forsøg blev gentaget to gange. Data viste reproducerbare og overensstemmende resultater. PT, primær CRC; PN, matchede normale colon væv fra patienter med tyktarmskræft; NN, normal colon epitel fra patienter uden kræft. Linje angiver den optimale afskæringsværdi for

CDO1

beregnet ud fra ROC-analyse. Sample tal, der viser TaqMeth V over cut-off er angivet. Den overordnede TaqMeth V detekteret i PT signifikant højere end den PN (højre). TaqMan værdi på to NN (22%, 2/9) var over afskæringsværdien (24.56 og 17.86 hver), hvilket antyder, at et lavt niveau af CDO1 methylering kan være forårsaget af andre ukendte mekanismer. E, ROC kurve analyse af TaqMeth V

CDO1

i CRC. Arealet under ROC (AUROC) formidler nøjagtigheden skelne matchet normal kolon (PN) fra CRC (PT) i form af sin sensitivitet og specificitet (

P 0,001

). Solid linje,

CDO1

; stiplet linje, ingen diskrimination. F, methylering niveauer af normal (PN) og tumorvæv (PT) i de enkelte patienter.

For at undersøge, om

CDO1

udtryk er reguleret af promotor methylering, søgte vi efter CpG øer i

CDO1

promotor ved at bruge online tilgængelig software Methprimer (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html).

CDO1

huser et CpG ø i promotoren proximalt til transkriptionsstartsitet (TSS) (fig. S1A). Vi analyserede status for methylering af CpG ø i 5 CRC cellelinier (HCT116, HT29, DLD-1, SW480 og RKO) og 4 tumor-tilgrænsende normalt udseende væv (PN) ved bisulfit-sekvensering. CpG island blev tæt methyleret i CRC cellelinier, men ikke i normale colon væv (Fig S1B . 1B). Delvis demethylering af CpG øen efter 5-aza-dC behandling i cellelinier også blev bekræftet ved bisulfit-sekvensanalyse (data ikke vist). Vi udførte også COBRA parallelt med bisulfit-sekventering til at bekræfte

CDO1

methylering i 10 par tilfældigt udvalgte matchede tumor (PT) og normale colon væv (PN) (fig. S1c). Hyppigheden af ​​

CDO1

methylering i tumorer (7/10, 70%) var højere end i tilsvarende normale væv (1/9, 11,11%). For at analysere

CDO1

status methylering i primære tumorer, vi undersøgte 21 par PT og PN ved bisulfit-sekventering. Ifølge vores kriterier for at afgøre,

CDO1

methylering i cellelinjer og væv ved bisulfit-sekventering (beskrevet i materialer og metoder), hyppigheden af ​​

CDO1

methylering i tumorer var 100% (21 /21), og at de ved normal methylering var 0% (0/21), hvilket indikerer, at

CDO1

er hypermethyleret i CRC (fig. 1B). Repræsentant hydrogensulfit-sekventering resultater af

CDO1

er vist i figur S1D.

For at belyse den rolle af DNA methylering i reguleringen af ​​

CDO1

udtryk, vi gjorde to luciferase reporter konstruktioner (pGL2-

CDO1

– # 1 og – # 2), der indeholder forskellige dele af

CDO1

promoter sekvenser (position -1100 bp til 104 bp for # 1, og -430 bp til +104 bp for # 2) (fig. 1C, øvre). Tomme pGL2-luciferase-plasmider blev transficeret til mock aktivitet. Transficerede vi disse konstruktioner i to cellelinier;

CDO1

-negative HCT116 celler og

CDO1

-positiv HEK293 celler. Aktivitet af

CDO1

promotor var minimal i HCT116-celler, men blev detekteret et højt promotoraktivitet i HEK293 (fig. 1C, lavere). Desuden har både pGL2-

CDO1

– # 1 og – # 2 konstruktioner havde lignende niveauer af

CDO1

promotor-aktivitet i HEK293 celler, men induktion af CpG methylering med

Sss

jeg methylase før transfektion nedsat aktivitet til et minimalt niveau. Disse resultater indikerer, at DNA-methylering af CpG øen spiller en stor rolle i gen-silencing af

CDO1

.

At studere promotor methylering af

CDO1

ved kvantitativ TaqMan-MSP analyse, vi designet primere og en sonde specifikt rettet mod CpG ø i

CDO1

promotor (fig. S1A). Vi øgede prøven numre til 100 par primære CRC (PT) og tilsvarende normale colon (PN) væv. Ni normale kolon mucosa væv fra patienter ikke-cancer (NN) blev inkluderet for at sammenligne methylering specificitet mellem kræft og ikke-kræftpatienter. Vi inkluderede også 5 CRC cellelinjer, der tidligere blev analyseret i TaqMan-MSP analyse. Fordelingen af ​​methylering værdier (TaqMan methylering værdier, TaqMeth V) udviser en klar kræft bestemt mønster; være statistisk forskellige mellem PT og PN (fig. 1D, venstre). På grund af heterogene klonede patches kendt for at ekspandere ud over tumor grænser, blev et lavt niveau af methylering i PN også almindeligt forekommende. Det samlede methylering niveau

CDO1

detekteret i PT (38,42 ± 22,97, middelværdi ± standardafvigelse, n = 100) var signifikant højere end i PN (5,00 ± 6,51, middelværdi ± standardafvigelse, n = 100) (

P 0,0001, Wilcoxon-Mann-Whitney test

) (fig 1D, højre).. Methylering af

CDO1

gen i væv viste særdeles diskriminerende receiver-operator karakteristiske (ROC) kurve profiler, klart skelne PT fra PN (fig. 1E). Areal under ROC (AUROC) var 0,962 ± 0,0138 (

P 0,001

). For at maksimere sensitivitet og specificitet, den optimale cut-off for methylering af

CDO1

gen blev beregnet ud fra ROC-analyse (værdi, 12,50) (PT

vs

. PN). På dette cut-off, den optimale specificitet var 93%, og følsomheden var 91% (

P 0,001

,

Fishers eksakte

test). Ud over en enkel frekvens, sammenligning af methylering niveauer af PN og PT fra de samme individuelle patienter viste, at størstedelen af ​​PT nærede langt højere værdier end PN (

P 0,0001, Wilcoxon matchede-par logget rækker

test) (fig. 1F). Et højt niveau af

CDO1

promotor methylering blev også fundet i CRC cellelinier (5/5, 100%), i overensstemmelse med den bisulfit-sekventering og COBRA resultater. Disse resultater viser, at

CDO1

er kræft-specifikt methyleres i CRC med høj frekvens.

CDO1

methyleres i flere typer af kræft hos mennesker

Til undersøge status for methylering af

CDO1

i andre vævstyper, udførte vi TaqMan-MSP i

CDO1

promotor i primære væv hidrørende fra bryst, spiserør, lunge, blære og mave. Som vist i figur 2A,

CDO1

promotoren blev stærkt methyleret i tumorer i alle vævstyper testet. Breast prøver bestod af et ikke-tumorgene (MCF-12A) og 5 cancercellelinier (BT20, MDA-MB-231, MCF-7, Hs748.T, Hs578.T), og 3 typer af primære væv (34 PT, 10 PN, og 10 NN). Twenty-syv ud af 34 (79%) breast PT nærede værdier over den optimale afskæringsværdi på 10 og ingen normale brystvæv fra patienter med (PN) eller uden (NN) kræft lå over værdien (0%). Niveauet af

CDO1

methylering i MCF-12A var under cut-off.

CDO1

promotor blev også meget methylerede i blærekræft. Fyrre-tre ud af 55 (78%) blære PT nærede værdier over den optimale afskæringsværdi af 5, og kun to prøver ud af 32 (6,2%) normal blære væv lå over afskæringsværdien. ROC kurve analyse genereret de optimale afskæringsværdier (Fig. 2B) samt maksimal sensitivitet og specificitet for hver type kræft. Gennemsnittet af TaqMeth V, AUROC, cut-off værdier,% sensitivitet og specificitet, og p-værdier for statistisk analyse i hver type af prøver er vist i tabel 1. sensitivitet og specificitet af

CDO1

var forbi 78% i PT og over 90% i PN henholdsvis i alle vævstyper testet. Disse resultater viser, at

CDO1

er almindeligt methyleres i flere typer af human cancer. De klinisk-patologiske træk ved de analyseret i denne undersøgelse patienter var ikke tilgængelig.

, kvantitative methylering niveauer af

CDO1

blev bestemt i primære væv afledt af bryst, spiserør, lunger, blære, og mave. TaqMan methylering værdier (TaqMeth V) er beskrevet i Materialer og metode. PT, primær tumor; PN, matchede normale væv; NN, normale væv fra patienter uden kræft; CL, cellelinier. Linjer angiver den optimale cut-off værdi for hvert væv. Arrow, MCF-12A, en ikke-tumorigen cellelinie, rummede et lavt niveau af

CDO1

methylering (TaqMeth V, 6.2). Alle assays blev udført in duplo format, og forsøg blev gentaget to gange. Data viste reproducerbare og overensstemmende resultater. B, ROC-analyse (PT

vs

. PN) af

CDO1

i flere kræftformer hos mennesker. Solid linje,

CDO1

; stiplet linje, nogen forskelsbehandling.

CDO1

er Lyddæmpet i kræftcellelinjer og Re-aktiveret af Farmakologisk Demethylering

Vi derefter undersøgt transkriptionsniveauet af

CDO1

ved RT-PCR og QRT-PCR-analyser i cancercellelinier afledt fra bryst, spiserør, lunge, blære, og maven, og i ikke-tumorigene cellelinjer (HEK293 og MCF-12A). Basal udtryk for

CDO1

var knap påvises i kræftceller, men blev observeret stærkere udtryk i HEK293 og svagt i MCF-12A cellelinjer (Fig. 3A). Vi undersøgte også methylering status for

CDO1

promotor i hver cellelinje ved bisulfit-sekventering, og fandt, at kræft cellelinjer med

CDO1

tab nærede en tæt methylering i

CDO1

promotor (angivet som M).

CDO1

methylering blev ikke observeret i HEK293 celler (U), og både methylerede og umethylerede alleler blev fundet i MCF-12 celler (M /U). Desuden 5-Aza-dC behandling genaktiveres

CDO1

udtryk i de fleste kræft cellelinjer (undtagelser var A549 og H1828), hvilket indikerer, at transskriptionel udtryk for

CDO1

stramt korrelerer med promotor methylering.

, Angivelse af

CDO1

i cellelinjer blev undersøgt ved RT-PCR eller QRT-PCR-analyser. m, mock behandling. a, 5-aza-dC behandling (5 uM i tre dage). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Methylering status

CDO1

promotor i hver cellelinje blev undersøgt, og angivet som M for methylering, U for unmethylation, og M /U for sameksistens mellem methylerede og umethylerede alleler.

CDO1

var helt methyleret i alle cancer cellelinjer da kun cytosin toppe blev observeret i CpG’er sekventeret (100% methylering), mens det ikke blev methyleret i HEK293 da kun thymidin toppe blev observeret (0% methylering).

CDO1

var delvist methyleret i MCF-12A da både methylerede og umethylerede alleler blev observeret i 10 CpG’er af

CDO1

initiativtagere undersøgt. Når en cytosin toppen, blev sammenlignet med en thymidin top i hvert CpG af de 10 CpG’er, cytosin toppe var dominerende (methyleret), men da disse “methylerede CpG’er” blev fundet i mindre end 50% af de samlede CpG’er (10/34), det blev betragtet som “methylering-negative” ifølge kriterierne beskrevet i Materialer og Metoder. B. QRT-PCR blev udført i cDNA’er afledt fra patienter med colon, bryst, spiserør, blære og mavekræft (T) og patienter uden cancer (NN) (øvre). Relativ ekspression (Fold) blev beregnet ved at sammenligne forholdene mellem mRNA-ekspression af

CDO1

til en intern kontrol-gen, β-actin.

CDO1

udtryk niveau blev bestemt i 10 lungekræftpatienter og 10 patienter uden kræft (lavere). 2 -? () * 100, ekspressionen af ​​

CDO1

forhold til p-actin beregnet baseret på tærsklen cyklus (C

t) som 2

-ΔCt (ACt = C

t,

CDO1

– C

t, β-actin). Eksperimenter blev udført in duplo, og værdier angiver middelværdier ± SD. *,

P 0,05

i

T-

test. C,

CDO1

udtryk niveau blev undersøgt i fem par (A ~ E) af matchede cDNA fremstillet ud fra patienter med colon og lungekræft. PT, primær tumor; PN, matchede normale væv.

For at undersøge ekspressionen af ​​

CDO1

i primær cancer, vi udførte QRT-PCR-analyse med cDNA’er afledt fra patienter med colon, bryst, spiserør, blære og mavekræft (T, n = 1 for hver tumor) og patienter uden cancer (NN, n = 1 for hver normal).

CDO1

var dramatisk nedreguleret i T i forhold til NN (fig. 3B, øvre). Den samlede middelværdi af

CDO1

udtryk niveau i 10 patienter uden kræft var omkring 2,5 gange højere (19,14 ± 21,56) end at der i 10 lungekræftpatienter (8,03 ± 9,20) (fig. 3B, lavere). Vi udførte også QRT-PCR i 5 par matchede cDNA fremstillet fra tumor (PT) og tilsvarende normalt væv (PN) af tyktarmen og lungekræft. Alle fem tumor tilfælde af colon væv udstillet

CDO1

nedregulering, og 3 af 5 tilfælde af lungevævet de viste reducerede niveauer af

CDO1

i PT forhold til PN (fig. 3C). Disse resultater tyder på, at specifik reduktion af

CDO1

mRNA er en almindelig begivenhed i udviklingen af ​​menneskelige cancer.

CDO1

udtryk blev også undersøgt ved hjælp af kræft Profilering Array II, som omfatter normaliseret cDNA af tumor og de matchede ikke-kræft (normale) væv til 19 forskellige typer af kræft. Som vist i figur 4,

CDO1

ekspression blev tydeligt detekteret i de fleste tilsvarende normale væv (N) i opstillingen, og nedreguleret i tumorer hos mere end 50% af patienter med colon, mave, bugspytkirtel, skjoldbruskkirtel , hud, nyre, blære, lunge, bryst, ovarie, uterus, cervix og vulva cancer. Omvendt er en stigning på

CDO1

i tumorer blev observeret i mindre end 20% af patienter med disse typer af kræft (tabel 2). I lungekræft, alle tumorer (100%, 10 ud af 10), der vises nedregulering af

CDO1

(fig. 4, øvre), mens ekspressionen af ​​

CDO1

i lever var for høj at sammenligne mellem normale og tumorvæv (ikke bestemt, n /d). Desuden er en høj frekvens af

CDO1

nedregulering ( 80%). Der blev observeret hovedsagelig i prøver afledt af kvindelige kræftpatienter (bryst, æggestok, livmoder, livmoderhals og vulva) (Fig 4, lavere ). Således

CDO1

nedreguleres i flere humane kræftformer, især i kræft fra kvindelige organer.

Kræft profilering arrays II blev udført for at sammenligne

CDO1

udtryk mellem tumor (T) og matches normal kontrol (N) væv af flere vævstyper. Grupperingen blev hybridiseret med

CDO1

cDNA-probe mærket med

32P-α-deoxycytidintriphosphat ifølge fabrikantens protokol. Tissue type og antallet af sager med nedregulering af

CDO1 vs.

samlede sager er angivet. Pil, nedregulering af

CDO1

i tumor i forhold til normalt væv. Ubiquitin cDNA (Ubi) blev anvendt som kontrol. n /d, ikke bestemt.

For at undersøge protein udtryk for

CDO1

, vi udførte immunhistokemiske (IHC) farvning hjælp af både tyktarm og spiserøret væv arrays med normal og kræft væv. I multipelt organsvigt normalt væv array, der omfatter ikke-maligne væv (NN) afledt af spiserør, mavesæk, lever, colon, lunge og bryst (# BN00011) blev ekspressionen af ​​CDO1 protein observeret i alle ikke-maligne væv; CDO1 ekspression var positiv i 6 ud af 6 tilfælde for alle vævstyper med kun én undtagelse i bryst (4 ud af 6 tilfælde) (data ikke vist). Figur 5A og Figur S2A viser repræsentative resultater af tre positive tilfælde af ikke-maligne kolon (NN1 ~ NN3). Desuden blandt 36 grupper af prøver bestående af adenocarcinomer (AD), matchede cancer tilstødende normalt udseende væv (NAT) og matches cancer tilstødende væv (tilstødende) i hver gruppe, som blev afledt fra 36 individuelle patienter tyktarmskræft (# BC05021 og # BC05022 ), nedregulering af CDO1 blev observeret i 25 tilfælde af AD sammenlignet med NAT eller tilstødende væv (69%) (fig 5B .. figur S2B). Fem tilfælde af 36 AD vises opregulering af CDO1, men de andre seks tilfælde udviste ingen forskel blandt AD, NAT og tilstødende væv (data ikke vist). Den høje frekvens af nedsat CDO1 ekspression blev også observeret i 33 ud af 40 tilfælde af ESCC (PT) sammenlignet med matchede normalt udseende væv (PN) (82%) (fig 5C . Figur S2C). Kun to tilfælde af ESCC udviste forøget CDO1 udtryk, og fem tilfælde viste ingen forskel mellem PT og PN (data ikke vist) (# ES801). CDO1 udtryk blev derefter analyseret i colon adenocarcinom med forskellige tumor kvaliteter og NAT (# BC05118 og # CO1922). CDO1 protein blev påvist i 41 ud af 41 tilfælde (100%) af NAT, mens AD viser CDO1 positivitet var ca. 40% (37% 44%, henholdsvis) (Fig 5D . Tabel 3). Svag eller fraværende udtryk for CDO1 i AD var statistisk signifikant i forhold til NAT i begge arrays (

P 0,001

), og den fraværende udtryk for CDO1 i mucinøs AD (84%, 32/38) var også statistisk signifikant (

P 0,001

). CDO1 ekspression blev påvist i 30 ud af 30 tilfælde (100%) af ikke-maligne esophageal væv (normal, betændelse og hyperplasi), mens fraværende eller svag udtryk for CDO1 blev observeret i 35 ud af 49 tilfælde (71%) af neoplastiske væv (tabel 4) (# ES804). Sammenlignet med normal esophagus væv, den negative udtryk for CDO1 i esophageal AD (80%, 16/20) (

P 0,001

), SCC (55%, 9/20) (

P 0,001

), og metastatisk cancer (89%, 8/9) (

P 0,001

) var statistisk signifikant, men dette var ikke tilfældet i hyperplasi (100%, 10/10) (fig. 5E).

, Stærk udtryk for

CDO1

i ikke-maligne kolon væv. Ekspressionen af ​​

CDO1

protein var positiv i 6 ud af 6 patienter. NN1, en patient uden cancer, og yderligere to tilfælde er vist i figur S2A. B, var en gruppe af prøver stammer fra en enkelt patient består af kolon adenokarcinomer (AD), matchet cancer tilstødende normalt udseende væv (NAT) og matches cancer tilstødende væv (tilstødende).

CDO1

udtryk blev undersøgt i alt 36 grupper af prøver. Patienterne blev nummereret vilkårligt (Pt1 ~ Pt3). CRC Pt1, en patient med CRC. Yderligere to tilfælde er vist i figur S2B. C,

CDO1

udtryk i ESCC. PT, ESCC; PN, matchede normalt udseende væv. ESCC Pt1, en patient med ESCC. Yderligere tre tilfælde er vist i figur S2C. D,

CDO1

udtryk i colon adenocarcinom (AD) med forskellige tumor kvaliteter. Mu-AD, mucinous adenokarcinomer. E,

CDO1

udtryk i ESCC med forskellige tumor kvaliteter. EAD, esophageal adenokarcinomer; Me-ESCC, metastatisk ESCC.

CDO1

Controls tumorfremkaldende i humane cancerceller

in vitro

in vivo

for at få indsigt i funktionen af ​​

CDO1

og konsekvensen af ​​et tab af

CDO1

aktivitet, vi først undersøgt væksten egenskaber kræft cellelinjer med eller uden tvungen udtryk for

CDO1

. HCT116 og DLD-1 cellelinjer, som ikke udtrykker

CDO1

gen ved baseline, blev udvalgt til forbigående

CDO1

genlevering. Vi udførte MTT assay for at sammenligne cellevækst med eller uden udtryk for

CDO1

. Kontrolcellerne, som ikke havde

CDO1

konsekvent voksede i 3 dages inkubation, men væksten i

CDO1

udtrykke HCT116 og DLD-1-celler faldt til 42% og 27% af kontrollen celler, (fig. S3A). Men ektopisk udtryk for

CDO1

havde nogen effekt på celle morfologi (data ikke vist). β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

P

-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.