PLoS ONE: Transkriptionel Regulering af hTREX84 i Human Cancer Cells

Abstrakt

Trex (transskription /eksport) er en multiproteinkompleks, der spiller en central rolle i den transskriptionelle forlængelse og transport af mRNA fra kernen til cytoplasmaet . Vi har tidligere rapporteret oprensningen af ​​det humane Trex protein og fandt, at ekspression af et medlem af dette kompleks, p84N5 (benævnt hTREX84 eller hHPR1), en RB-bindende protein, korreleret med bryst tumorstørrelse og metastase. Her undersøger vi mekanismerne for afvigende ekspression af hTREX84 i bryst- og ovariecancer celler og vurdere dens rolle i tumorigenese. Vi viser, at ovarietumorceller overudtrykker hTREX84 4 gange og 10 gange sammenlignet med udødelige, ikke-tumorigene og primære ovariale overflade epitelceller henholdsvis. Reduktion af hTREX84 niveauer ved små interfererende RNA resultere i hæmning af celleproliferation og G

2 /M anholdelse. Selvom vi observeret, at hTREX84 blev induceret ved behandling med en demethylering middel, 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC), natriumbisulfit DNA sekventering og methylering specifikke PCR fandt ingen tegn på ændringer i DNA-methylering i den CpG øer i regulator-regionen i

hTREX84

. Vi efterfølgende udpege flere transkriptionelle faktorer, herunder NF-KB bindingssteder i

hTREX84

gen promotor og demonstrere ved kromatin immunopræcipitation (chip) og mutagenese at RelA /p65 binder NF-kB bindingssteder og inducerer

hTREX84

udtryk. Endelig viser vi ved immunhistokemi (IHC), som RelA /p65 rigeligt udtrykkes i maligne celler, afvigende udtrykker hTREX84 indikerer, at RelA /p65 kan spille en central rolle i reguleringen hTREX84 udtryk i kræft. Vores resultater viser, at overekspression af

hTREX84

er associeret med transformation kræftcellen, proliferation og kan reguleres ved RelA /p65

Henvisning:. Guo S, Liu M, Godwin AK (2012) Transkriptionel regulering af hTREX84 i humane cancerceller. PLoS ONE 7 (8): e43610. doi: 10,1371 /journal.pone.0043610

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA

Modtaget: June 12, 2012; Accepteret: 23, 2012; Udgivet: 27 august, 2012 |

Copyright: © Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Institutes of Health, R01 CA140323 og 5U01CA113916, Department of Defense Breast Cancer Research Program for den amerikanske hær Medical Research, DAMD17-03-1-0312, og æggestokkene Cancer Research Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Trex (transkription /eksport) kompleks spiller en central rolle i den transskriptionelle forlængelse og transport af mRNA fra kernen til cytoplasmaet [1]. Dette kompleks er konserveret fra gær til menneske. I gær er Trex kompleks består af THO kompleks og mRNA eksport faktorer Sub2 og Yra1 [2], [3], [4], [5]. THO Komplekset indeholder heterotetramere underenheder, ThO2, Hpr1, Mft1 og THP2 [6], [7]. Derudover Tex1, et protein med ukendt funktion, blev fundet at co-oprenses med THO komplekset, omend i substøkiometriske mængder [3], [5]. Trex komplekse komponenter er også forbundet med Gbp2 og Hrb1 [5], [8]. Disse to proteiner er kendetegnende for serin-arginin-rige familie af splejsningsfaktorer og rekrutteres til nascente mRNA’er gennem en fysisk interaktion med Trex kompleks under transkription forlængelse [9]. Funktionelt, den THO kompleks spiller en rolle i transskription-afhængig rekombination og transkription [6]. Det er blevet vist, at THO komplekset rekrutteres til aktivt transkriberede gener [5] og nødvendig for effektiv transkription forlængelse [4]. Null mutationer i hver af de gener, der koder for underenheder af THO komplekse fører til et mRNA eksport defekt [5], [10].

For nylig,

Drosophila

og menneskelige Trex komplekser blev karakteriseret af flere grupper, herunder vores [5], [11], [12], [13]. Menneskelig TREX komplekse omfatter ThO2 (gær komponent ThO2), HPR1 (gær Hpr1), UAP56 (gær Sub2) og ALY (gær Yra1). Derudover indeholder den menneskelige Trex kompleks andre komponenter, TREX90 (fSAP79), TREX40 (fSAP35) og TREX30 (fSAP24), som har modparter i

Drosophila

(THOC5, 6 og 7, henholdsvis), men ikke i gær [1], [11], [14]. Både

Drosophila

og de menneskelige Trex kompleks mangler homologer af Mft1 eller THP2. Alligevel

Drosophila

og menneskelige studier af ThO2 og /eller Hpr1 RNA-interferens viser, at metazo og menneskers THO kompleks, ligesom dens gær modstykke, funktioner i mRNA eksport [11], [13]. TREX84 /HPR1 forbinder med forlængede RNA-polymerase II, hvilket indikerer menneskelig THO kompleks også fungerer i transkriptionel forlængelse [12].

Vores interesser i human HPR1 resulterede fra vores observation, at p84N5 afvigende blev udtrykt i human brystcancer [15] . p84N5 blev opdaget som et bindende protein, som associerer med retinoblastoma tumor suppressor protein (RB) [16]. I lang tid, det tjente som en nuklear protein markør [17], [18]. Overraskende har vi erkendt, at p84N5 er humant Hpr1, en gær modstykke, i Trex komplekset [11]. Dette resultat blev yderligere bekræftet af andre grupper uafhængigt [12], [14] og omtales som hTREX84 /HPR1.

Mekanismen for regulering af den menneskelige Trex komplekse, herunder hTREX84 i normal og transformerede celler er ikke godt undersøgt. Vi rapporterer, at hTREX84 afvigende udtrykkes i både bryst- og ovariecancer og dens udtryk er reguleret delvist af RelA /p65.

Resultater

Over-ekspressionen af ​​hTREX84 i Human ovariecancerceller

Tidligere vi rapporterede, at ekspressionen af ​​hTREX84 i brysttumorer omvendt er relateret til hormon receptor status [11]. Desuden, når vi sammenlignet hTREX84 mRNA-ekspression i 6 repræsentative reduktion mammoplasty prøver og herunder 3 har født præmenopausale og 3 af tomme præmenopausale kvinder,

hTREX84

mRNA ekspression blev signifikant forhøjet i de barnløse prøver [11] [data ikke vist]. Disse resultater viser, at hTREX84 ikke kun dereguleret i brysttumorer, men også stærkt reguleret under normal human bryst luftrør differentiering og kan modificeres ved visse hormoner, såsom human choriongonadotropin (hCG). Vi spurgte derfor, om hTREX84 også udtrykkes afvigende i andre hormonafhængige tumorer, såsom kræft i æggestokkene. Vi observerede, hTREX84 blev højt udtrykt i alle 30 tilfælde af ovarieepitelceller carcinomer (data ikke vist). Yderligere bestemte vi hTREX84 ekspression (hTREX84 /beta-actin-forhold) i primære humane ovarie overflade epithelial (slange) cellekulturer (n = 10), SV40 Tag udødelige, ikke-tumorigene SLANGE cellelinier (n = 10) og ovarie tumorcelle linjer (n = 11) ved Western blotting-analyse. Vi fandt, at hTREX84 ekspression er signifikant forhøjet i udødelige cellelinjer (gennemsnit, 0,51) sammenlignet med primære epitelceller (gennemsnit, 0,125; p = 0,00024) og når sin højeste niveau i cancercellelinier (gennemsnit, 2,10; p = 0,0022) (Figur 1a, b).

A,

hTREX84 proteinekspression i repræsentative æggestokkene kræft cellelinier (OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289), udødelige epitelial cellelinjer (HIO- 118, HIO-102, HIO-104, HIO-113), primære epitelceller (ROE). Proteinprøver blev adskilt på en SDS-polyacrylamidgel immunblottet under anvendelse af anti-hTREX84 eller ß-actin monoklonale antistoffer.

B,

hTREX84 /ß-actin-forholdet i primære ovarieepitelceller cellekulturer (epitel), udødelige epiteliale cellelinier (Hio) og kræft cellelinjer (kræft).

For yderligere belyse den biologiske betydning af hTREX84 i æggestokkene cancerceller blev siRNA mod

hTREX84

transficeret i en OVCAR10 celler. RT-PCR-analyse under anvendelse af oligonukleotidprimere specifikke for

hTREX84

gen viste, at ekspressionsniveauet af hTREX84 transkriptet falder -70 til 80% fra transfektion af siRNA i OVCAR10 celler sammenlignet med den for kontrolcellerne . Under disse betingelser, de konstante ekspressionsniveauer af glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (

GAPDH

) -gen blev opnået i begge celler (figur 2a). hTREX84 målrettede siRNA’er effektivt reducerede niveauerne af hTREX84, men påvirkede ikke niveauerne af ikke-målrettede udskrifter såsom β-actin (figur 2b). Immunfarvning bekræftede, at hTREX84 proteinet drastisk blev reduceret i de fleste af de behandlede celler (figur 2C). Det samlede antal celler faldt betydeligt efter behandling med hTREX84-siRNAs sammenlignet med celler behandlet med transfektionsreagens eller kontrol-siRNA (figur 2d). Vi observerede, at cellevækst blev reduceret i kulturer behandlet med hTREX84-siRNA sammenlignet med kontrol (figur 2e). Guava nexin assays viste, at der var også en reduktion af Annexin V-PE og 7-AAD positive celler i celler behandlet med hTREX84-siRNAs sammenlignet med kontroller og forskellene var også ikke signifikant (p 0,05) (data ikke vist). For at se på mekanismen for hTREX84 siRNA action, vi yderligere bestemmes cellecyklusfordeling ved flowcytometri og fandt, at celletal i G2-M-fasen blev reduceret, og celleantal i G1-fasen blev forøget i OVCAR10 behandlet med hTREX84 siRNA som sammenlignet med celler behandlet med kontrol siRNA, hvilket indikerer, hTREX84 kan være nødvendige for indtræden i G2-M-fasen (fig 2f). Disse resultater indikerer, at afvigende ekspression af hTREX84 kan bidrage til kræft i æggestokkene ved at fremme celleproliferation. Lignende resultater blev opnået ved hjælp af yderligere tumorcellelinier [data ikke vist].

A,

Analyse af hTREX84 og GAPDH mRNA-niveauer efter behandling af celler med siRNA mod hTREX84 eller kontrol siRNA.

B,

Analyse af hTREX84 og p-actin proteinniveauer efter behandling af celler med siRNA mod hTREX84 eller kontrol siRNA.

C,

Analyse af hTREX84 udtryk efter siRNA behandling i 72 timer ved immunfluorescensfarvning i cellerne (

venstre,

celler transficeret med kontrol siRNA;

højre,

celler behandlet med hTREX84-siRNA).

D,

Mikrofotografier viser morfologi efter udtømning af hTREX84 (

venstre,

tumorceller transficeret med kontrol siRNA;

højre,

celler behandlet med hTREX84-siRNA).

E,

Cell proliferation assay af tumorceller efter udtømning af

hTREX84

. Celleproliferation og apoptose (data ikke vist) blev undersøgt under anvendelse Guava ViaCount og nexin assays hhv. Antallet af levedygtige celler (x10

4) afsættes mod behandlingsvarighed på 24, 48 og 72 timer efter behandling med kontrol siRNA eller med hTREX84-siRNA. Vist er resultaterne af tre uafhængige forsøg. Forskellen er statistisk signifikant. *, P 0,05; **, P 0,01.

F

. FACS-analyse af celler efter nedregulering af hTREX84 niveauer. Vist er procentdelen af ​​celler i G1, S, G2-M efter 72 timer af behandling med enten siRNA (venstre panel) eller hTREX84-siRNA (højre panel).

Øget hTREX84 Expression med 5- aza-dC i æggestokkene Immortal Celler

i en tidligere undersøgelse, vi rapporterede, at

hTREX84

mRNA blev afvigende udtryk i langt de fleste høj kvalitet og invasive duktale bryst- [11]. Desuden

hTREX84

mRNA-niveauer var forhøjet i maligne epitelceller sammenlignet med normale bryst-duktale epitelceller, som påvist ved hjælp af laser fanget mikro-dissektion og qPCR analyse. Derfor er vi spekulere, at deregulering af transskription af

hTREX84

mRNA kan være en af ​​mekanismen for hTREX84 protein overekspression i cancerceller. For at hjælpe belyse de molekylære mekanismer bag den abnorme transkription af

hTREX84

i tumorigenese, en udødelig, ikke-tumorigen ovarie overflade epitelcellelinje, HIO-107 blev behandlet med en demethyleringsmiddel, 5-aza-dC ved koncentrationer af 1, 5, 10 eller 50 uM i 5 dage. Totale RNA’er blev isoleret og RT-PCR med specifikke primere til hTREX84 cDNA eller β-actin cDNA blev udført. Resultaterne viste, at intensiteten af ​​RT-PCR-produkt af

hTREX84

blev forhøjet med 5-aza-dC behandling på en dosisafhængig måde (figur 3). Derimod blev produkterne af β-actin jævnt amplificeret fra alle prøverne, der illustrerer, at ekspressionen af ​​β-actin ikke blev ændret af 5-aza-dC behandling (figur 3a, c). hTREX84 protein viste sig også at forøges på samme måde ved anvendelse af western blotting-analyse (figur 3b, d). Lignende resultater blev opnået, når vi anvendte en ovariecancer cellelinie OVCAR2, som udviser lav ekspression af endogene hTREX84 (data ikke vist).

A, Salg HIO-107-celler blev behandlet med 5 aza-dC i koncentrationer på 1, 5, 10, 50 pM henholdsvis 5 dage. RT-PCR show

hTREX84

mRNA-ekspression og

B

, western blot analyse viser hTREX84 protein niveauer.

C, D,

Kvantitativ mRNA og Western blot data blev beregnet ud fra densitometrisk analyse af bånd med NIH ImageJ software, hhv. Værdierne blev normaliseret til p-actin som intern kontrol.

Natriumbisulfit DNA-sekventering af Arrangøren og Exon1 af hTREX84 Gene

Vi identificerede i GenBank ™ et humant genomisk klon (RP11 -70.501) afledt af kromosom 18p, der indeholder den humane TREX84 cDNA-sekvens oprindeligt beskrevet af Durfee et al [16] (DDBJ /GenBank ™ /EMBL data Bank, accession nummer AAA53571), samt andre grupper [5], [19] [20] (tiltrædelse nummer NM_005131). Tilpasningen af ​​den menneskelige

TREX84

cDNA og den genomiske klon i GenBank ™ tilladt os at bestemme exon-intron organisation af genet. Genomisk DNA blev efterfølgende isoleret fra disse 5-aza-dC behandlede celler og natriumhydrogensulfit DNA sekventering blev udført. Overraskende viste resultaterne, at alle CpG-dinukleotider finde på hTREX84 promotoren og exon 1-regioner fra behandlede og ubehandlede HIO107 og OVCAR2 celler blev alle demethyleres, hvilket indikerer, at ændringer i promotor-methylering ikke er forbundet med stigende ekspression af

hTREX84

mRNA og protein efter 5-aza-dC behandling.

for yderligere korrelere status methylering af

hTREX84

promotor og exon 1 region og hTREX84 udtryk, vi analyserede 15 tilfælde af bryst- og ovariecancer cellelinier, 10 tilfælde af bryst- og ovarie udødelige cellelinjer, 6 tilfælde af invasiv bryst duktalt carcinom, 13 tilfælde af ovarietumorer, samt deres parrede normale væv ved natriumbisulfit DNA-sekventering. Resultaterne viste, at

hTREX84

promotor og exon 1-regioner i næsten alle cellelinjer blev demethyleret (figur 4a, b).

hTREX84

promotor og exon 1-regioner i de fleste normale væv blev også demethyleres. Der var sporadiske methylerede CpG steder i normale væv (figur 4c); imidlertid afvigende promotor methylering af

hTREX84

syntes ikke at være den største epigenetisk mekanisme forbundet med unormal ekspression af hTREX84 i bryst- og ovarietumorer og tumorcellelinier.

A

, DNA sekvens af

hTREX84

regulator regioner. CpG sites er vist i grøn farve. Nukleotider er nummereret til højre fra AUG translation startkoden, som er understreget.

B

, Natriumbisulfit sekventering af DNA isoleret fra ubehandlede (I) og behandlet (II) celler. Stjernerne angiver CpG sites.

C

. Natriumbisulfit sekventering af DNA fra et normalt brystvæv (N) og en invasiv duktal carcinom (T). Stjernerne angiver CpG sites.

Identifikation af transkriptionsfaktorer bundet til hTREX84 Gene Promoter

For at give en bedre forståelse af det molekylære grundlag for hTREX84 overekspression i bryst- og ovariecancer vi evaluerede transkriptionsfaktorbindingssites i

hTREX84

regulator regioner [21] ved hjælp AliBaba2 (https://wwwiti.cs.uni-magdeburg.de/grabe/alibaba2). Ni SP1, 7 NF1, 4 AP1, 2 NF-KB, sammen med andre transkriptionelle faktorer bindingssteder blev forudsagt af dette program. Vi fokuserede i første omgang på to NF-KB bindingssteder i den transkriptionelle regulering af

hTREX84

. Først vi udnyttet chromatin immunoprecipitation (chip) assay for at bestemme status for RelA /p65, en af ​​underenhederne af NF-KB, ved promotoren for

hTREX84

. Efter chip-protokollen,

hTREX84

gen promotorregioner blev opformeret og analyseret ved semikvantitativ PCR med specifikke primerpar omkring NF-KB bindende regioner på promotor af

hTREX84

(figur 5a). Ene bryst (MDA-MB-231) og to æggestokkene (OVCAR10, OVCAR5) tumorcellelinjer blev dyrket underkastet chip med et antistof (Ab) til RelA /p65. Berigelse af specifikke DNA-sekvenser i kromatin immunopræcipitater, hvilket indikerer en sammenslutning af RelA /p65 med DNA-strenge inden intakt kromatin, blev visualiseret ved PCR-amplifikation. Ingen binding blev set på immunpræcipitation prøver uden RelA /p65-antistof (figur 5b). Disse resultater blev yderligere bekræftet, da vi transient transficeret RelA /p65 ekspressionsplasmider ind i en ikke-tumorigen bryst epitelcellelinje, MCF-10F og stimuleret hTREX84 proteinekspression (fig 5c). Desuden, når vi slået ned RelA /p65-ekspression ved hjælp siRNA målrettet mod RelA /p65, de hTREX84 protein niveauer var til gengæld faldet (figur 5d).

En

, Skematisk diagram af hTREX84 promotor angiver den konserverede NF-KB-DNA-bindende motiv.

B

, chip assay af RelA /p65 binding til

hTREX84

gen promotor i MDA-MB-231 (bane 1, 2); OVCAR5 (bane 3, 4); OVCAR 10 (bane 5, 6). Celler blev dyrket i 48 timer. Chip assays blev derefter udført med anti-RelA /p65 antistof. PCR analyse blev udført på immunpræcipitation prøver uden antistof (bane 1, 3, 5), med RelA /p65-antistof (bane 2, 4, 6).

C

, MCF-10F-celler blev transient transficeret med en kontrolvektor (bane 1) eller et RelA /p65 cDNA ekspressionskonstruktion i 48 timer. Western blot-analyse for RelA /p65, hTREX84 og β-actin.

D

, Western blot-analyse af RelA /p65, hTREX84 og β-actin proteinniveauer efter behandling af MDA-MB-231-celler med kontrol siRNA (bane 1) og siRNA mod RelA /p65 (bane 2) til 72 timer.

For yderligere at bestemme, om NF-kB direkte regulerer hTREX84 promotor-aktivitet gennem disse to NF-kB bindingssteder, vi udførte transient transfektion assay i MCF-10F celler med hTREX84 /pGL3 journalister. Reporterkonstruktioner indeholdende muterede NF-kB-bindingssteder (figur 6a, b), der blev dannet ved PCR-styret mutagenese, blev sammenlignet med vildtype-sekvens i nærvær af RelA /p65. Resultaterne viste alle reportere, der indeholder NF-kB muteret bindingssted (er) har reduceret promotoraktivitet (figur 6c).

A,

DNA-sekvens af NF-κB1M påviser, at den første NF-kB-bindingssted er muteret fra 5′-GGAAACTCCC-3 ’til 5′-CCAAACTCCC-3′.

B,

DNA-sekvens af NF-κB2M, viser, at den anden NF-kB bindingssted er muteret fra 5′-AGGTAATCCA-3 ’til 5′-ACCTAATCCA-3′. N5-κB1 /2M repræsenteret begge de to NF-KB-bindingssteder i hTREX84 promotorregion blev muteret som beskrevet ovenfor (sekvens ikke vist).

C

, Promoter aktiviteter blandt de tre journalister konstruktioner indeholdende enten en enkelt muterede NF-KB bindingssteder eller begge (NF-κB1 /2M) som bestemt ved en luciferaseanalyse. 1) Vildtype NF-KB-bindingssteder; 2) NF-κB1M; og 3) NF-κB2M; og 4) NF-κB1 /2M.

Da vores tidligere undersøgelser viste, at hTREX84 var stærkt udtrykt i cellekernen især i dårligt differentierede og mere aggressive humane brystcancer [11], spurgte vi, om RelA /p65 kan også udtrykkes på en tilsvarende måde. Vi undersøgte protein ekspression af RelA /p65 ved immunohistokemisk analyse i 89 tilfælde af menneskelig brystcancer, samt 5 normale brystvæv (tabel 1). Denne tumor panel omfatter 22, 33 og 34 tilfælde af godt, moderat og dårligt differentierede tumorer, hhv. RelA /p65 var svagt (0 /+ 1) påvises i normale bryst epitelceller (4 af 5) og protein-farvning angivet cellecytoplasma lokalisering (figur 7a). Farvning for RelA /p65 blev også observeret hovedsagelig i cytoplasmaet i veldifferentierede tumorer (figur 7B). Tydeligt granulær farvning med et øget antal positivt farvede kerner blev observeret i de ringe differentierede tumorprøver (+ 2 /+ 3, 31 af 34) (fig. 7c). Begge RelA /p65 og hTREX84 er højt udtrykt i mere aggressiv kræft indikerer, at RelA /p65 og /eller hTREX84 kan have en rolle i tumor progression og metastase.

A

, RelA /p65 blev svagt påvist i normale bryst epitelceller og positive produkter blev placeret i cellen cytoplasma.

B

, Farvning for RelA /p65 blev fundet primært i cytoplasmaet i høje differentierede tumorer.

C

, Intens og tydeligt kornet farvning for RelA /p65 blev påvist i farvede kerner af lave differentierede tumor prøver.

D

, Tumor sektion evalueret uden det primære antistof til at tjene som en negativ kontrol. Forstørrelse 200x.

Diskussion

I denne rapport, vi udvidet vores tidligere observation, at overekspression af hTREX84 ikke kun forbundet med aggressiv brystkræft, men er også forbundet med afvigende celle spredning i kræft i æggestokkene. Kernelokalisering hTREX84 i ovariecancer, såvel som i andre cancertyper, såsom brystcancer, [11], lungecancer [22] viser sig at være placeret i den nukleare matrix og RNA-bearbejdning center. hTREX84 regulerer transskriptionen strækning af en undergruppe af gener ved at deltage i Trex proteinkompleks [11], [12], der er konserveret fra gær til menneske. Desuden er hTREX84 også involveret i transkription forlængelse, pre-RNA-splejsning, og mRNA eksport. Vi udforskede de molekylære mekanismer, der styrer overekspression af hTREX84 i kræftceller. Da

hTREX84

mRNA-niveauer er signifikant forhøjet i bryst tumorer og tumorcellelinjer, vi spekuleret på, at epigenetiske mekanismer kan bidrage til denne fænotype. Det er velkendt, at methylering af DNA ved CpG-dinukleotider er en vigtig mekanisme til regulering af genekspression i pattedyrceller [21], [23]. Methylering af cytosiner i CpG-sekvens placeret i regulator regioner af nogle gener menes at sikre silencing af visse vævsspecifikke gener i nonexpressing celler. Afvigende methylering er nu betragtes som en vigtig epigenetisk ændring forekommer i human cancer [24], [25]. Hypermethylering af normalt umethylerede tumorsuppressorgener korrelerer med et tab af udtryk i kræft cellelinjer og primære tumorer [26], [27], [28]. På den anden side, at svigt undertrykke gener hensigtsmæssigt ved unormal demethylering af vævsbegrænset gener eller ved hypomethylering af proto-onkogener kan resultere i tab af vævsspecificitet og kunne fremme cancerdannelse [29], [30], [31]. I tidligere undersøgelser har vi vist, at γ-synuclein-promotor, som har et lignende mønster af bindingssteder for CpG som

hTREX84

er hypomethylated i mange humane faste tumorer, der aberrerende udtrykker dette protein [32], [33]. Vi antager, at

hTREX84

kan være reguleret af en samme mekanisme. Faktisk 5-aza-dC induceret hTREX84 i alle celler behandlet, men indirekte som vist ved manglende methylering ændringer ved de bindingssteder for CpG, hvilket indikerer, at hypomethylering ikke er direkte forbundet med øget ekspression af

hTREX84

mRNA og protein. Disse resultat blev yderligere bekræftet, da vi analyseret en række bryst- og æggestokkræft og tumorcellelinjer og normale væv for tegn på afvigende methylering af natriumbisulfit DNA-sekventering. De CpG steder i

hTREX84

promotor og exon 1-regioner blev universelt demethyleres uanset niveauet af

hTREX84

udtryk. Resultaterne tyder på, at unormale hTREX84 methylering ikke er forbundet med forhøjet hTREX84 udtryk i bryst- og æggestokkræft, og kan reguleres af andre epigenetiske mekanismer.

Der er flere muligheder, som kan forklare, hvorfor 5-aza-dC ikke inducerer hTREX84 ekspression direkte gennem hTREX84 gen status for methylering. For eksempel kan 5-aza-dC have dramatiske virkninger på kromosomer, hvilket fører til dekondensering af kromatin struktur og dermed øge specifik genekspression [34], [35]. En anden mulighed er, at 5-aza-dC kan påvirke nogle transkriptionsfaktorer, der efterfølgende påvirker hTREX84 udtryk.

For at give en bedre forståelse af det molekylære grundlag for hTREX84 overekspression i celle immortalisering og tumorigenese, vi identificeret transskription faktor bindende steder i

p84N5

promotor. Vi har fokus på nuklear faktor KB (NF-KB) og validere det af flere grunde. NF-KB er ikke en enkelt protein, men en lille gruppe af nært beslægtede protein-dimerer, der binder til en fælles sekvens motiv kendt som KB-site [36]. Ifølge Hanahan og Weinberg, tumorigenese kræver seks væsentlige ændringer normal celle fysiologi: selvforsyning i vækstsignaler; ufølsomhed over for væksthæmning; unddragelse af apoptose; immortalisering; vedvarende angiogenese; og vævsinvasion og metastase [37]. NF-KB kan fremkalde flere af disse cellulære ændringer [38], og det har vist sig at være konstitutivt aktiveret i nogle typer af cancerceller, herunder brystcancer. Tidligere undersøgelser har dokumenteret forhøjet eller konstitutiv NF-KB-DNA-bindende aktivitet både in brystcarcinom cellelinjer og i primære brystcancerceller fra mennesker og gnaveroprindelse [39], [40], [41]. Dette kunne være korreleret med det øgede niveau af epidermal vækstfaktor familie receptorer (EGFR) [42]. Ved hjælp af en chromatin immunoprecipitation [43], [44] og funktionelle assays vi viste klart, at RelA /p65, en af ​​underenhederne af NF-KB, binder til promotoren af ​​

hTREX84

og påvirket

hTREX84

mRNA-ekspression. Desuden, når specielt forårsaget af siRNA tilgange, tab af RelA /p65 blokeret hTREX84 udtryk. For yderligere at bestemme, om NF-KB direkte regulerer

hTREX84

promotoraktivitet via NF-KB-bindingssteder, udførte vi en luciferase-promotor-assay, hvor NF-KB-bindingssteder blev muteret enkeltvis eller i kombination. Resultaterne viste, at NF-KB-bindingssteder var essentiel for maksimal promotoraktivitet. Vi undersøgte yderligere protein udtryk for RelA /p65 ved IHC i humane brystcancer prøver og viste et konsistent mønster af overekspression i mere aggressive, dårligt differentierede tumorer. Derfor er RelA /p65 udtrykt på en måde svarende til hTREX84 [11], hvilket indikerer, at disse to proteiner samvirkende kan bidrage til tumorudvikling og metastase.

NF-KB og dens RelA /p65-underenhed især kan fremme tumorgenese gennem sin evne til at inducere ekspressionen af ​​anti-apoptotiske gener, såsom

Bel

-XL,

XIAP

IEX

-1 L [45], [46]. NF-KB kan også stimulere tumorproliferation gennem inducerende visse onkogener såsom cyclin D1 [47] og c-MYC [48]. Yderligere NF-KB målgener, som bidrager tumorcellemigration og /eller metastase indbefatter cellulær adhæsion molekylære, såsom ICAM-1 og VCAM-1 [49]; matrixmetalloproteinaser, såsom MMP-9; chemokinreceptorer, såsom CXCR4, og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [50]. I en nylig rapport blev NF-KB vist at regulere et stort netværk af gener, meget mere end oprindeligt anslået [51]. Betydningen af ​​

hTREX84

som en ny RelA /p65 mål ikke bør overses så enkel en anden NF-KB reguleret gen, siden. hTREX84 er afgørende for transkriptionel forlængelse og mRNA eksport [11]. Det er således interessant at spekulere, at NF-KB direkte kan mediere mRNA metabolisme gennem regulering af

hTREX84

i kræftceller. NF-KB er også kendt for at inducere ekspressionen af ​​visse cytokiner og chemokiner og til gengæld induceres af dem [48], [52]. Denne positive feedback mechanismis normalt holdes i skak for at producere en kronisk eller overdreven reaktion forbundet med visse sygdomme, når NF-KB bliver afvigende aktiv [52]. hTREX84 og RelA /p65 subunit af NF-KB kan også være indbyrdes aktiveres i aggressiv brystkræft. I tidligere undersøgelser stimulerede hTREX84 transkription af RelA /p65 [53]; imidlertid rolle hTREX84 som en transkriptionel faktor er ikke blevet veletableret. Vi observerede også, at hTREX84 ekspression er forøget i østrogenreceptor (ER) negative brystcancer [11], mens konstitutiv aktivering af NF-KB har vist sig at være forbundet med en mere aggressiv brystkræft [40], [42], [54] . Som sådan manglende molekylære mål i ER-negativ brystcancer fortsat en stor terapeutisk forhindring. Ligesom NF-KB, kunne hTREX84 betragtes som en ideel terapeutisk mål for ER-negative brystkræft.

Andre transkriptionelle faktorer vil kunne bidrage til reguleringen af ​​

hTREX84

. Fire AP-1 bindingssteder blev identificeret i

hTREX84

promoter region. AP-1 transkriptionsfaktor er et dimert kompleks, der indeholder medlemmer af JUN, FOS, ATF og MAF proteinfamilier [55]. Forhøjet AP-1-aktivitet blev også fundet i humane brysttumorer og narkotika resistente bryst tumorcellelinier [56], [57], [58]. NF-KB kan indirekte forøge ekspressionen af ​​AP-1-regulerede gener ved fysisk at associere med AP-1 [59]. Den potentielle rolle AP-1 og andre transkriptionsfaktorer i reguleringen

hTREX84

udtryk endnu ikke fastlagt; dog har vores seneste undersøgelser vist, at RelA /p65 spiller en central rolle i reguleringen af ​​

hTREX84

udtryk i bryst- og ovariecancer.

Materialer og metoder

cellelinjer og Cell Kultur

medier og cellekultur reagenser blev udarbejdet af Cell Culture Facility på Fox Chase Cancer center. Ti primære humane ovarie overflade epiteliale (slange) cellekulturer og 10 SV40 Tag udødelige, ikke-tumorigene SLANGE cellelinier blev etableret og dyrket i 199 Mellem med 15% FBS og insulin (290 enheder /per 500 ml), som vi tidligere har beskrevet [ ,,,0],60]. De immortaliserede humane bryst epitelceller MCF-10F (HMECs), som blev dyrket i DMEM /F12-medium suppleret med 5% hesteserum, insulin, hydrocortison, epidermal vækstfaktor, choleratoksin, og antibiotika, blev etableret fra en patient med fibrocystisk sygdom og viser ikke egenskaber ved en malign fænotype [61], [62]. Humane æggestokkene cancer cellelinjer OVCAR2, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR8, OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289, UPN300, A2780 [63], [64], [65], [66], og brystkræft cellelinjer, MDA-