PLoS ONE: Kræft-Type Regulering af MIG-6 Expression af inhibitorer af Methylering og histon Deacetylation

Abstrakt

epigenetisk inaktivering er en af ​​de mekanismer, der fører til inaktivering af et tumorsuppressorgen, enten ved DNA methylering eller histon modifikation i en promotor regulatorisk region. Mitogen inducerbart gen 6 (

MIG-6

), primært kendt som en negativ feedback inhibitor af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) familie, er et tumorsuppressorgen, der er forbundet med mange humane cancere. At afgøre, om

MIG-6

inaktiveres af epigenetisk ændring, vi identificeret en gruppe af menneskelig lungekræft og melanom-cellelinjer, hvor dens udtryk er enten lav eller målbart og studeret virkningerne af methylering og histondeacetylering på sit udtryk. DNA methyltransferase (DNMT) hæmmer 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) inducerede

MIG-6

udtryk i melanom-cellelinjer, men lidt i lungekræft linjer. Derimod inhibitor histon deacetylase (HDAC) Trichostatin A (TSA) induceret

MIG-6

udtryk i lungekræft linjer, men havde ringe effekt i melanom linjer. Men den

MIG-6

promotor selv synes ikke at være direkte berørt af enten methylering eller histondeacetylering, hvilket indikerer en indirekte reguleringsmekanisme. Luciferase reporter assays viste, at et kort segment af exon 1 i

MIG-6

gen er ansvarlig for TSA respons i lungecancerceller; Således kan

MIG-6

genet epigenetisk tavs gennem en indirekte mekanisme uden at have en fysisk ændring i dets promotor. Desuden vores data tyder også, at

MIG-6

genekspression forskelligt reguleret i lungekræft og modermærkekræft

Henvisning:. Zhang YW, Staal B, Dykema KJ, Furge KA, Vande Woude GF (2012) Kræft-Type Regulering af

MIG-6

Expression af inhibitorer af Methylering og histondeacetylering. PLoS ONE 7 (6): e38955. doi: 10,1371 /journal.pone.0038955

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: Februar 27, 2012; Accepteret: 15. maj 2012; Udgivet: 12 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Van Andel Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og manuskript

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mitogen inducerbart gen 6. (

MIG-6

) (også kendt som gen 33,

ERRFI1

, eller

RALT

) er en umiddelbar tidlig reaktion gen, som udtrykkes i forskellige væv og spiller en afgørende rolle i mange patofysiologiske tilstande [1]. Dets ekspression kan induceres af et bredt spektrum af vækstfaktorer, hormoner eller stress stimuli, og det er forbundet med forskellige kroniske tilstande [1], [2]. Undersøgelser i mus har vist, at

Mig-6

er nødvendig for hud morfogenese og lunge udvikling, og at det spiller en vigtig rolle i opretholdelsen fælles homeostase [3], [4], [5].

som et cytoplasmatisk stillads adapter, MIG-6 har flere vigtige protein-protein-interaktion motiver, som kan mediere interaktion med signalmolekyler nedstrøms for receptortyrosinkinaser (RTK’er) [2]. En af de mest fremtrædende roller MIG-6 i reguleringen signaltransduktion kommer fra dens evne til direkte at interagere med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og andre ErbB familiemedlemmer, inhibering deres phosphorylering og nedstrøms signalering i en negativ feedback mode [6], [7], [8], [9]. MIG-6 kan induceres af hepatocytvækstfaktor (HGF) og fungerer som en negativ feedback regulator af HGF-MET signalering [10], [11], hvilket indikerer, at det har bred rolle som et signal checkpoint til modulering aktiverede RTK veje i en rettidigt.

beviser for, at

MIG-6

er et tumorsuppressorgen er overbevisende. Det er placeret i kromosom 1p36, et locus, der ofte har tab af heterozygositet i adskillige humane cancere herunder lungekræft [12], [13], [14], melanom [15], og brystkræft [16]. Faktisk nedregulering eller tab af

MIG-6

udtryk er blevet rapporteret i kræft og er ofte forbundet med dårlig prognose [3], [11], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].

MIG-6

nedregulering i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er forbundet med øget EGFR-signalering og dårligt differentieret kræft [21], mens tab af dets ekspression i ErbB2-forstærket brystcarcinom gør kræft celler mere resistente over for Herceptin, det neutraliserende antistof mod ErbB2 [16]. I glioblastom,

MIG-6

er identificeret som et enkelt gen inden for de mest almindeligt deleterede region ved 1p36.23 locus, og dets ekspression nedreguleres i 34% af glioblastom prøver [19]. Mens

MIG-6

nedregulering er rapporteret i en høj procentdel af papillære skjoldbruskkirtelkræft [22], høj

MIG-6

udtryk korrelerer med længere overlevelse og er forbundet med gunstige kirurgiske udfald for de patienter [24]. Nedsat MIG-6-ekspression er også blevet rapporteret i hudkræft, endometriecancer, og hepatocellulære karcinomer [3], [20], [23]. Selv om sådanne begivenheder er sjældne, tre mutationer i

MIG-6

genet er blevet identificeret i human lungecancer og en i neuroblastom [11], [18]. Yderligere dokumentation for

MIG-6

som et tumorsuppressorgen skyldtes musestudier;

Mig-6

deficiente mus er tilbøjelige til at udvikle epitelial hyperplasi eller tumorer i organer, herunder lunge, hud, uterus, galdeblæren, og galdegangen [3], [11], [20].

Epigenetisk ændring, en af ​​de mest kendte mekanismer, der fører til inaktivering af et tumorsuppressorgen [25], kan skyldes DNA-methylering eller histondeacetylering i genets promotor [25]. I betragtning af, at nedregulering af

MIG-6

ofte observeret i mange menneskelige kræftformer, vi spurgte, om

MIG-6

udtryk er påvirket af DNA methylering og histondeacetylering. Her viser vi, at

MIG-6

promotor selv hverken hypermethyleret eller påvirket af histondeacetylering. Imidlertid er dets ekspression induceret af DNA methyltransferase (DNMT) inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) i melanomcellelinier og af histon deacetylase (HDAC) -hæmmer Trichostatin A (TSA) i lungekræft linjer. Ved dissekering dets promotor regulatorisk område under anvendelse af en luciferase reporter assay identificerede vi en minimal TSA-responselement i exon 1 i

MIG-6

der er afgørende for dets induktion af TSA i lungecancerceller.

Resultater

MIG-6-ekspression er forskelligt reguleret af 5-aza-dC i melanom cellelinjer og TSA i lungekræft-cellelinjer

For at afgøre, om

MIG-6

udtryk var påvirket af epigenetisk ændring, vi først identificeret menneskelige kræftceller, hvor dens promotor er sandsynligvis ramt af methylering eller histondeacetylering. Som vist i figur 1, fandt vi fire humane NSCLC cellelinier (A427, H226, H522, og H596) og fem melanoma cellelinier (M14, MALME-3M, SK-2, SK-MEL-28, og UACC-257) hvori MIG-6-protein var enten lav eller upåviselig. Vi derefter behandlet disse cellelinier med eller uden 5-aza-dC, TSA, eller en kombination af begge inhibitorer.

Hele cellelysater blev fremstillet ud fra de angivne cellelinjer, og MIG-6 blev bestemt ved western blot analyse under anvendelse af anti-Mig-6 polyklonalt antistof. Som en belastning kontrol, blev samme blot probes med anti β-actin antistof.

Til vores overraskelse fandt vi, at TSA behandling signifikant øget mængden af ​​MIG-6 protein i lungekræft celle linjer, men ikke i de melanom-linier (figur 2A). Derimod 5-aza-dC behandling forøgede signifikant MIG-6-protein i melanomcellelinier, men ikke i de NSCLC lungekræft linier (figur 2B). For at bestemme om forhøjelsen af ​​MIG-6-protein blev reguleret på transskriptionelt niveau, udførte vi RT-PCR-analyse. Som vist i figur 3, og i overensstemmelse med proteinekspression,

MIG-6

-mRNA-ekspression øges med TSA behandling kun på de fire lung cancercellelinjer, og det steg med 5-aza-dC behandling kun i fem melanom linjer. Disse data tyder på, at induktion af

MIG-6

udtryk med 5-aza-dC eller TSA reguleres på transkriptionsniveauet og forskelligt reguleret i lungekræft og melanom celler.

hele cellelysater blev ekstraheret fra celler behandlet med eller uden 5-aza-dC (10 uM) og /eller TSA (1 uM), og Western blot analyser blev udført til påvisning af MIG-6-protein. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (A) MIG-6 protein blev induceret ved TSA, men ikke af 5-aza-dC i lungekræft linjer. (B) 5-Aza-dC, men ikke TSA, induceret MIG-6 i melanomcellelinier.

totale RNA’er blev isoleret fra celler behandlet med eller uden 5-aza-dC (10 uM ) og /eller TSA (1 uM), og

MIG-6

ekspression blev bestemt ved RT-PCR-analyser.

GAPDH

udtryk blev anvendt som en intern kontrol. (A) TSA øget

MIG-6

mRNA i de fire lunge cancer cellelinjer. (B)

MIG-6

mRNA i de fem melanom cellelinjer blev øget med 5-aza-dC.

MIG-6 promotor hverken hypermethyleret eller direkte berørt af histon deacetylering

i betragtning af, at

MIG-6

blev induceret med 5-aza-dC i melanom linjer, vi spurgte, om sin promotor blev hypermethyleret i disse celler. Vi ekstraheret genomisk DNA fra både lungekræft og melanomcellelinjer og undersøgt DNA-methylering i 596-bp

MIG-6

promotor regulatorisk region, som indeholder rigelige bindingssteder for CpG (figur 4). Til vores overraskelse, lungekræft cellelinier (figur 4A) og melanomcellelinjer (figur 4B) var ens i at have meget få methylerede bindingssteder for CpG i

MIG-6

promotor regulatorisk område, hvilket viser, at induktion af

MIG-6

med 5-aza-dC i melanom var uafhængig af DNA methylering i sin promotor. Disse resultater blev bekræftet ved direkte sekventering af PCR-produkterne er amplificeret fra bisulfit-behandlede DNA’er (data ikke vist).

MIG-6

promotoren blev amplificeret fra bisulfit omdannede DNA og klonet ind i et TOPO TA-kloningsvektoren. Status for

MIG-6

promotor-methylering i (A) lunge cancer cellelinjer og (B) melanomcellelinier blev bedømt ved sekventering af 10 tilfældigt valgte kolonier fra hver linje for methylerede cytosinrester. Hver rød søjle repræsenterer et CpG websted. De åbne ovaler indikerer umethylerede CpG steder og de faste ovaler indikerer denatureret sites. EBC-1 cellelinje blev anvendt som en negativ kontrol for at vise den basale methylering status MIG-6 promotor.

Ligeledes spurgte vi, om

MIG-6

promotor var påvirket ved histondeacetylering. Ved kromatin immunopræcipitationsassay (chip), fandt vi, at TSA behandling ikke øge bindingen af ​​acetyl-histon H3 til

MIG-6

promotor i lungekræft linjer eller i de melanom linier (figur 5), hvilket indikerer, at

MIG-6

promotor blev ikke direkte berørt af histondeacetylering enten.

cellerne blev behandlet med eller uden TSA (1 uM) i 24 timer, og en chip assay blev udført anvendelse af anti-acetyl histon H3-antistof. Som en negativ kontrol blev normal kaninserum anvendes til immunopræcipitation. De DNA-fragmenter tværbundet og co-immunpræcipiteret med acetyleret histon H3 blev oprenset og anvendt til PCR-amplifikation af initiativtagerne til

MIG-6

og

GAPDH

. EBC-1-cellelinien blev anvendt som en negativ kontrol til at vise den basale histondeacetylering status MIG-6-promotoren.

MIG-6 transkription indirekte reguleret af en faktor (er), der påvirkes af methylering eller histondeacetylering

Da de ovennævnte data tyder på, at

MIG-6

induktion er ikke direkte reguleret, vi kiggede for en sekundær mekanisme, med hæmmere inducerer udtryk for en transskription faktor (er) eller co-faktor (er), der på sin side regulerer

MIG-6

udtryk. Således har vi gennemgået svarene fra den

MIG-6

promotor regulatorisk region til hæmmere via luciferase reporter assay. En

MIG-6

promoter reporter plasmid blev konstrueret ved at indsætte en 1.383-kb genomisk DNA-fragment (bestående af

MIG-6

promotor, dens opstrøms regulatoriske region, og den nedstrøms exon 1 og del af intron 1) foran et luciferase reportergen. Test af reporter i både lungekræft og melanomcellelinier, fandt vi, at TSA signifikant forøget

MIG-6

promotoraktivitet i lungecancerceller men viste ingen sådan virkning i melanomceller (figur 6). Disse data var i overensstemmelse med vores tidligere western blot og RT-PCR-analyser. 5-aza-dC dog syntes at have nogen virkning på reporteraktivitet i enten melanom eller lungekræft linjer (figur 6). Disse data viser, at mens TSA-responsive element er inden for 1,383 kb region

MIG-6

, 5-aza-dC-responsive element er sandsynligvis uden for denne region.

Lung cancer og melanoma cellelinier blev transient transficeret med luciferase reporter plasmider, enten pGL3-Basic eller pGL3-P (-1076 /+ 307), efterfulgt af behandling med eller uden 5-aza-dC eller TSA. Den pU6B-

Renilla

reporter blev co-transficeret til normalisering. Hvert assay blev udført tre gange. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. Den studerende t-test

s

værdi angiver en statistisk signifikant forskel mellem de mock-behandlede og TSA-behandlede prøver.

En lille del af exon 1 i MIG-6 er afgørende for TSA respons i lungekræft

Vi udførte en række deletionsanalyser i 1.383 kb

MIG-6

promotor regulatorisk region for at bestemme den minimale region er nødvendig til indledning af TSA i lungekræft celler. Deletion fra 5′-terminus til den proksimale region i

MIG-6

promotoren, medførte et fald i den basale promotoraktivitet, mens reaktionen på TSA blev væsentlige bibeholdes (figur 7A). Deletion fra 3′-terminus til den transkriptionelt initieringssite af

MIG-6

resulterede i fuldstændig tab af respons på TSA (figur 7B), hvilket indikerer, at TSA responselementet var nedstrøms for

MIG- 6

promotor. Yderligere deletionsanalyser afslørede en lille segment i exon 1 ud fra det transkriptionelle initieringssite, der var afgørende for TSA responsivitet (Figur 7C). Som opsummeret i figur 7D, den minimale TSA responselementet er inden for de første 50 nucleotider af exon 1, med den distale 20-nukleotid segment viser den højeste aktivitet.

(A-C) Forskellige længder af

MIG-6

promotor regulatorisk region blev indsat i pGL3-vektoren. Luciferase reporter assay blev udført i A427 lungecancerceller transient transficeret med pGL3-Basic eller den angivne reporter transporterer

MIG-6

promotorelement. Cellerne blev derefter behandlet med eller uden 5-aza-dC eller TSA. Den pU6B-

Renilla

reporter blev co-transficeret til normalisering. Hvert assay blev udført tre gange. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. (D) Skematisk afbildning af TSA-responselementet i

MIG-6

promotor regulatorisk region. Pilen viser transskription start stedet; det røde felt angiver exon 1. Shaded i grøn er den 50-bp element i exon 1, der er mest sandsynligt ansvarlig for TSA respons i lungekræft celler, som vi er udpeget som den minimale TSA-respons element.

Vi spekuleret på, at der eksisterer en kritisk transkriptionsfaktor bindende motiv i den minimale TSA responselementet. Vi udførte mutation analyser af 50-nukleotidsegment at lokalisere potentielle transcriptionsfaktor-bindende motiv (er) (figur 8A). Sammenlignet med vildtype-P (-76 /+ 50) reporter, mutation i m4 og m5 elementer resulterede i et signifikant fald i reporter aktivitet som respons på TSA, mens mutation i andre elementer havde mindre virkning (figur 8B). Dette resultat er enig i deletionsanalyser, som M4 og M5 elementer er inden for det distale 20-nukleotid segment, når slettet, resulterede i en stejl drop-off i TSA respons. Vi genererede en anden mutant reporter M11, hvor halvdelen af ​​sekvenserne i både m4 og m5 blev muteret (figur 8A). Vi fandt, at M11 mutant havde en langt større reduktion i TSA respons (figur 8C), hvilket indikerer, at disse sekvenser er af afgørende betydning for bindingen af ​​en endnu ikke identificeret transkriptionsfaktor der regulerer MIG-6-genekspression induceret af TSA i lungekræft .

(A) sekvenserne af P (-76 /+ 50), der indeholder

MIG-6

promotoren og minimal TSA-responselement er vist. For hver mutant reporterkonstruktion (m3-m11), blev den understregede sekvens muteret til GAATTC. (B og C) En luciferase reporter assay blev udført i A427 lungecancerceller ved transient transfektion den angivne reporterplasmidet med eller uden TSA behandling. De fejl søjler repræsenterer standardafvigelse og alle analyser blev udført i tre eksemplarer.

Andre gener forskelligt reguleret af 5-aza-dC og TSA i lungekræft og melanom celler

Vi spurgte næste om der var andre gener forskelligt reguleret af 5-aza-dC og TSA i lungekræft og melanom celler. Vi udførte mikromatrice analyser på prøver, der stammer fra A427 lungekræft og M14 melanom celler behandlet med 5-aza-dC og /eller TSA. Figur 9A viser de gener, der viser et udtryk mønster, der svarer til

MIG-6

(som er angivet som

ERRFI1

i varmen-kort) som reaktion på enten 5-aza-dC eller TSA-behandling (figur 9A). En anden gruppe af gener syntes at være nedreguleret, det modsatte af

MIG-6

ekspression (figur 9B).

Microarray analyser blev udført på RNA-prøver fra A427 lungecancerceller og M14 melanom celler behandlet med eller uden 5-aza-dC (10 uM) og /eller TSA (1 uM). Varmen kort viser (A) gener, hvis udtryk mønster svarede til af

MIG-6

, og (B) generne, hvis ekspression blev nedreguleret af behandlingen, i modsætning til

MIG -6

udtryk.

MIG-6

genet er angivet med en stjerne, og er vist som den alternative symbol,

ERRFI1

.

Blandt de op-regulerede gener var dem kodning for transkriptionsfaktorer, såsom EGR1 og STAT1, MIG-6-inducerbart gen

HBEGF

, og gener, der koder for histonproteiner (figur 9A). Selv om disse gener blev udtrykt differentielt i A427 og M14-celler (figur 9a), yderligere analyser viste, at

EGR1

(men ikke for flere andre gener, vi undersøgte) viste et ekspressionsmønster svarende til den i

MIG- 6

på tværs af de fire lungekræft-cellelinjer og fem melanom linjer (figur 10). Således

MIG-6

var ikke den eneste gen forskelligt reguleret i lungekræft og melanom celler. Måske er der vævsspecifikke faktorer (enten transkriptionsfaktorer eller transkriptionsfaktor co-aktivatorer /co-repressorer), som reagerer forskelligt på 5-aza-dC og TSA, hvilket fører til differentiel induktion af

MIG-6

og

EGR1

i lungekræft og melanom celler.

udtryk for

EGR1

blev bestemt ved RT-PCR. (A) TSA inducerede

EGR1

udtryk i NCI-H226, NCI-H522, NCI-H596, og A427 lunge kræft cellelinier. (B) 5-Aza-dC induceret

EGR1

ekspression i M14, MALME-3M, SK-2, SK-MEL-28, og UACC-257 melanoma cellelinier.

GAPDH

udtryk blev brugt som en intern kontrol (se figur 3).

Diskussion

MIG-6

, et tumorsuppressorgen , har vist sig nedreguleret i mange humane cancere. At afgøre, om nedregulering af

MIG-6

udtryk var påvirket af epigenetisk modifikation i sin promotor, vi behandlede lungekræft og melanom-cellelinjer med hæmmere af methylering og histondeacetylering og derefter besluttet, hvordan disse hæmmere påvirket

MIG-6

udtryk. Interessant nok fandt vi, at DNMT inhibitor 5-aza-dC specifikt induceret

MIG-6

ekspression i melanomceller, men ikke i lungecancerceller, mens HDAC-inhibitor TSA inducerede den omvendte mønster (figur 2 og 3). Trods begge induktioner reguleres på transkriptionel niveau, blev vi overrasket over at finde, at den

MIG-6

promotor hverken hypermethyleret eller direkte berørt af histondeacetylering (figur 4 og 5), hvilket indikerer, at en indirekte mekanisme kunne være ansvarlig for differentiel induktion. Faktisk har 5-aza-dC også blevet rapporteret at inducere ekspressionen af ​​adskillige andre gener, hvis promotorer påvirkes ikke direkte ved methylering i leukæmiceller [26], hvilket antyder, at 5-aza-dC kan have en bredere indflydelse på regulering gen udtryk via en methylering-uafhængig måde.

Mange DNMT hæmmere og HDAC-hæmmere er i øjeblikket i kliniske forsøg for deres anti-cancer egenskaber [27], [28], [29]. Selv om de fleste af disse epigenetiske lægemidler er stadig i den tidlige udvikling og udsigterne for de kan bruges klinisk til kræftbehandling mangler at blive evalueret, vil denne vurdering afhænger af vores forståelse af, hvordan de fungerer, og hvilke resultater der kan forventes. 5-Aza-dC og TSA ses som potente og specifikke inhibitorer for methylering og histondeacetylering henholdsvis [27], [28], [30], og de har været meget anvendt til undersøgelse epigenetisk ændring af mange tumorsuppressorgener. Disse inhibitorer normalt forårsager globale ændringer i genekspression ved remodeling kromatin via direkte konvertering denatureret DNA til umethyleret DNA eller unacetylated histoner til acetyleret tilstand, hvorved nem adgang til transskription maskiner til genpromotorer. Dog kan nogle inhibitorer gøre mere, og deres anti-cancer egenskaber kunne være meget mere kompliceret. For eksempel, mange ikke-histon cellulære proteiner såsom transkriptionsfaktorer er også substrater af HDAC, og deres transkriptionelle aktiviteter kan blive påvirket af HDAC-hæmmer TSA samt [29].

De fleste tumorsuppressorgener er epigenetisk tavshed ved enten DNA-methylering og /eller histondeacetylering i deres promotorer [25]. Så vidt vi ved, er der ingen rapport, der viser, at ekspressionen af ​​sådanne gener kan differentielt reguleret af inhibitorer af methylering eller histondeacetylering i en cancer-specifik måde uden at have epigenetiske modifikationer i promotoren. Reguleringen af ​​

MIG-6

af disse inhibitorer, som vi viser her, afslører en hidtil ukendt mekanisme, hvormed et tumorsuppressorgen kan epigenetisk tavs i en indirekte og vævsspecifik måde. Vores luciferase reporter analyseresultater viste, at reguleringen af ​​

MIG-6

udtryk i melanom og i lungekræft blev sandsynligvis medieret af forskellige faktorer. Vi har identificeret en minimal TSA responselement i exon 1 i

MIG-6

proksimalt til dets promotor (figur 7 og 8), mens placeringen af ​​5-aza-dC responselementet er stadig usikkert (figur 6) .

Vi spekulere, at TSA respons element i

MIG-6

gen sandsynligvis reguleret af en faktor, hvis udtryk er påvirket af histondeacetylering i sin promotor eller hvis protein aktivitet er direkte reguleret ved acetylering /deacetylering (figur 11A). Denne faktor ville blive aktiveret i lungecancerceller upon TSA behandling, men ikke i melanomceller. Inden for den minimale TSA-responselement, som vi identificeret i

MIG-6

gen exon 1 (figur 7), der er formodede DNA bindende sekvenser for transkriptionsfaktoren aktivator protein-2 (TFAP2), som har fem familie medlemmer og binder sig til konsensus sekvensen 5′-GCCNNNGGC-3 ‘[31], [32]. Når den formodede TFAP2 bindingssteder var muteret, observerede vi et betydeligt fald i TSA-lydhørhed (figur 8), hvilket indikerer, at disse sekvenser er afgørende for TSA-medieret regulering. Det bliver interessant at se, om TFAP2 eller anden faktor (er) binder til disse sekvenser og regulerer MIG-6 genekspression. Som for 5-aza-dC, responselementet derfor sandsynligvis uden den testede 1.383 kb

MIG-6

promotor regulatoriske region (figur 6); altså at det er enten direkte påvirket af methylering i sine DNA-sekvenser eller indirekte medieret af en anden transkriptionel regulator, hvis promotoren er modificeret ved methylering i melanomceller (figur 11 B). Omfattende undersøgelser vil være nødvendigt at foretage, hvad disse faktorer er, og hvordan de kontrollerer

MIG-6

udtryk.

(A) i lungekræft celler, TSA måske indirekte regulere

MIG-6

gennem to mekanismer. Den første kan være, at TSA hæmmer histondeacetylering i promotoren af ​​gen

X

, hvilket resulterer øget produktion af X protein, som øger

MIG-6

genekspression ved at associere med TSA-respons element i exon 1. Den anden kan være, at direkte acetylering af protein X påvirket af TSA resulterer i forøget transkription af

MIG-6

. (B) I melanom celler, regulering af

MIG-6

udtryk med 5-aza-dC kan være direkte eller indirekte. 5-Aza-dC kan hæmme DNA methylering i promotoren af ​​gen

Y

, hvilket fører til opregulering af sit produkt og dermed indirekte øge

MIG-6

udtryk; eller det kan direkte hæmme DNA methylering uden for den testede 1,383 kb

MIG-6

promotor regulatorisk region, der giver nem adgang til en transkriptionel co-aktivator at forbedre

MIG-6

udtryk. “P” angiver promotoren for hvert gen; “E1” angiver exon 1 i

MIG-6

gen.

Kræft-typen regulering af genekspression ved hæmmere af methylering og histondeacetylering er ikke enestående for

MIG -6

. Andre gener, såsom

EGR1

[33] også differentielt reguleret i lungekræft og melanomceller ved de inhibitorer (se figur 9 og 10). Det er endnu ikke fastslået, om lignende

MIG-6

promotor-

EGR1

promotor hverken hypermethyleret eller påvirket af histondeacetylering i disse celler. Hvis disse egenskaber er de samme i de to initiativtagere, bliver det interessant at se, om de er underlagt samme faktor (er) eller via forskellige mekanismer.

Vi rapporterer her, at

MIG-6

ekspression differentielt reguleret af inhibitorer af methylering og histondeacetylering i lungecancer og melanomceller uden fysiske epigenetiske ændringer i dets promotor.

MIG-6

(og muligvis

EGR1

) kan tjene som værdifulde biomarkører til bestemmelse af følsomhed /egnetheden af ​​en kræftform til behandling med DNMT og /eller HDAC-hæmmere i klinikken.

Materialer og metoder

humane cellelinjer

Den menneskelige lungecancer cellelinier A427, blev opnået NCI-H292, NCI-H2122, NCI-H596, og SK-MES-1 fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). EBC-1 var fra Health Science Research Resources Bank (Tokyo, Japan). NCI-H226 og NCI-H522 blev opnået fra NCI-60 cellelinier (NCI-Frederick). De blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. Den menneskelige melanom cellelinjer A375, C8161R, MALME-3M, M14, SK-2, SK-MEL-28, SK-MEL-103, SK-MEL-147, UACC-62, og UACC-257 blev venligst stillet til rådighed af Dr. . Matthew VanBrocklin (Nevada Cancer Institute, Las Vegas, NV) [34] og opretholdt i RPMI suppleret med 5% FBS og 1% penicillin /streptomycin.

plasmider

En serie af DNA-fragmenter afledt af

MIG-6

promotor regulatorisk region blev indsat i

Bgl

II og

Kpn

i sites i promotor-mindre luciferase reporter pGL3-Basic (Promega, Madison , WI) for at skabe de plasmider pGL3-P(−1076/+307),–P(−533/+307),–P(−106/+307),–P(−76/+307),–P(−76/+255),–P(−76/+245),–P(−76/+177),–P(−76/+139),–P(−76/+50),–P(−76/+31),–P(−76/+20),–P(−76/+10), og-P (-76 /-1). Alle indsatte fragmenter blev amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af

Pfu

turbo-DNA-polymerase (Stratagene, La Jolla, CA), og de resulterende plasmider blev sekventeret for at bekræfte nøjagtigheden af ​​inserterne.

All pGL3-P (-76 /+ 50) mutante reportere blev oprettet ved hjælp af en QuikChange steddirigeret mutagenese kit (Stratagene) ved at mutere hver af seks oprindelige nukleotider i en

EcoR

restriktionsenzymsted (GAATTC ), som blev bekræftet ved sekventering. De anvendte primere til at skabe hver mutant reporter er som følger: for pGL3-P (-76 /+ 50) m3, 5′-TAGCGGGAGCGCGAGAATTCAAGAGGCGCCTGCG-3 ‘(sense) og 5′-CGCAGGCGCCTCTTGAATTCTCGCGCTCCCGCTA-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m4, 5’-GAGCGCGAGCCAGCAGAATTCGCCTGCGCAGATCT-3 ‘(sense) og 5′-AGATCTGCGCAGGCGAATTCTGCTGGCTCGCGCTC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m5, 5’-AGCCAGCAAGAGGCGAATTCGCAGATCTGCGATCT-3 ‘(sense) og 5′-AGATCGCAGATCTGCGAATTCGCCTCTTGCTGGCT-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m6, 5’-GCGGCGACGGCGGTCGAATTCGAGGCAGAGTGCTA-3 ‘(sense) og 5′-TAGCACTCTGCCTCGAATTCGACCGCCGTCGCCGC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m7, 5’-CGGCGGTCCGGTGCGAATTCGAGTGCTAGCGGGAG-3 ‘(sense) og 5′-CTCCCGCTAGCACTCGAATTCGCACCGGACCGCCG-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m8, 5’-CCGGTGCGAGGCAGAATTCTAGCGGGAGCGCGA-3 ‘(sense) og 5′-TCGCGCTCCCGCTAGAATTCTGCCTCGCACCGG-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m9, 5’-GAGGCAGAGTGCTAGAATTCGCGCGAGCCAGCAAG-3 ‘(sense) og 5′-CTTGCTGGCTCGCGCGAATTCTAGCACTCTGCCTC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) M10, 5’-GAGTGCTAGCGGGAGAATTCGCCAGCAAGAGGCGC-3 ‘(sense) og 5′-GCGCCTCTTGCTGGCGAATTCTCCCGCTAGCACTC-3′ (antisense); og for-P (-76 /+ 50) m11, 5’-GCGAGCCAGCAAGAGAATTCTGCGCAGATCTGCG-3 ‘(sense) og 5′-CGCAGATCTGCGCAGAATTCTCTTGCTGGCTCGC-3’ (antisense). Understregningen angiver

EcoR

I stedet for hver mutant.

Western blot analyse

For at forberede proteinlysater blev celler behandlet med eller uden 5-aza-dC (10 uM) i 3 d eller TSA (1 uM) i 1 d i komplet vækstmedium. For kombinationen af ​​de to, blev celler behandlet med 5-aza-dC i 2 dage, efterfulgt af TSA behandling i 1 d. Hele cellelysater blev ekstraheret i RIPA-buffer (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP 40, 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM natriumorthovanadat, og fuldstændig Proteinase inhibitor Cocktail tabletter), kvantificeret ved anvendelse af en DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA), og justeret med tilsvarende volumen af ​​2 x Laemmli Sample Buffer (Sigma, St. Louis, MO). Proteinet blev kørt i en 10% Tris-glycin-gel (Invitrogen, Grand Island, NY), overført til en PVDF-membran og undersøgt med anti-MIG-6 [11] eller anti-β-actin-antistof (Sigma).

RNA Forberedelse og RT-PCR analyse

Brug TRIzol reagens (Invitrogen), blev totalt RNA isoleret fra hver cellelinje behandlet med 5-aza-dC og /eller TSA og fra kontroller, som detaljeret over. Til revers transkription (RT) -PCR, blev første streng cDNA syntetiseres først fra 1 ug RNA ved anvendelse SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen), efterfulgt af PCR-amplifikation ved anvendelse af 5% cDNA for hver reaktion. Følgende er de anvendte primere til amplifikation af hvert gen thi

MIG-6

, 5′-ATGTCAATAGCAGGAGTTGCTG-3 ‘(sense) og 5′-GTCTAAGGAGAAACCACATAGG-3’ (antisense); for

GAPDH

, 5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3 ‘(sense) og 5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’ (antisense);