PLoS ONE: Small Molecule APY606 Viser Omfattende antitumoraktivitet i kræft i bugspytkirtlen via svække Ras-MAPK Signaling

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er blevet fundet med unormal udtryk eller mutation i Ras proteiner. Onkogent Ras-aktivering udnytter deres omfattende signalering nå at påvirke flere cellulære processer, hvori mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signalering udøver vigtige roller i tumorigenese. Terapier målrettede Ras er således af stor fordel for kræft i bugspytkirtlen. Selv om små molekyle APY606 er blevet plukket ud af virtuel screening lægemiddel baseret på Ras target receptor, sin tilbundsgående mekanisme stadig mangler at blive belyst. Heri vurderede antitumoraktiviteten af ​​APY606 mod humane pancreas cancer Capan-1 og SW1990 cellelinier og udforskede virkningen af ​​Ras-MAPK og apoptose-relaterede signalvej på aktiviteten af ​​APY606. APY606 behandling resulterede i en dosis- og tidsafhængig inhibering af cancer cellelevedygtighed. Derudover APY606 udviste stærk antitumoraktivitet, som det fremgår ikke kun af reduktion i tumorcelleinvasion, migration og mitochondriemembran potentiale, men også ved ændring i flere apoptotiske indeks. Desuden APY606 behandling direkte hæmmede Ras-GTP og nedstrøms aktivering af MAPK, hvilket resulterede i nedregulering af anti-apoptotiske protein Bcl-2, der fører til opregulering af mitokondrie apoptose pathway-relaterede proteiner (Bax, cytosolisk Cytochrom

c

caspase 3) og cyklin-afhængige kinase 2 og cyclin a, E. Disse data tyder på, at svække Ras-MAPK signalering er en ny virkningsmekanisme for APY606 under terapeutisk intervention i bugspytkirtelkræft.

Henvisning: Guo N, Liu Z, Zhao W, Wang E, Wang J (2016) Small Molecule APY606 Viser Omfattende antitumoraktivitet i kræft i bugspytkirtlen via svække Ras-MAPK Signaling. PLoS ONE 11 (5): e0155874. doi: 10,1371 /journal.pone.0155874

Redaktør: Hiroyasu Nakano, Toho University School of Medicine, JAPAN

Modtaget: 29, 2016 Accepteret: 5 maj 2016; Udgivet: 25. maj 2016

Copyright: © 2016 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

finansiering:. forfatterne ønsker at anerkende de følgende finansieringskilder, der støttede denne forskning: National Natural Science Foundation of China (81573448, 11174105, 91227114 og 91430217), National Science Foundation (MCB- 0947767) og Natural Science Foundation of Jilin provinsen (20150101009JC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en dødelig sygdom på grund af pancreas duktalt adenokarcinom ranking den fjerde blandt kræftrelaterede dødsfald [1]. Arten af ​​denne tumor er kendetegnet ved en dårligt resultat for alle faser af sygdommen og kun 1-4% af patienter med pancreascancer er stadig i live efter 5 år fra diagnosen [2]. Forskellige behandlingsregimer ikke signifikant forbedre overlevelsen af ​​patienter [3,4]. Svigt i kemoterapi i bugspytkirtelkræft skyldes hovedsagelig multilægemiddelresistens og dosisbegrænsende bivirkninger. Til dato er det uklart, hvordan intracellulære signalveje fører til de afvigende biologiske egenskaber i bugspytkirtelkræft. Desuden er det stadig lidt kendt om, hvordan farmakologiske hæmninger specifikke signalveje forbedre reaktionen af ​​bugspytkirtelkræftceller til konventionel kemoterapi [5]. Derfor bør den fremtidige indsats mod udvikling af nye terapi til at forbedre overlevelsen og livskvaliteten for patienter med kræft i bugspytkirtlen omfatte ny strategi for at undersøge effektiviteten anticancer narkotika [6].

Ras proteiner er centrale regulering komponenter, der involverer i normal cellevækst, differentiering og malign transformation [7]. Det blev anslået, at næsten 90% af pancreascancer er blevet fundet med unormal ekspression eller mutation i Ras proteiner [8]. Onkogent Ras aktivering udnytter deres omfattende signalering nå at påvirke flere cellulære processer, herunder undertrykkelse af apoptose og fremme af spredning [9]. Programmeret celledød, eller apoptose, er en normal fysiologisk proces, hvorved individuel celle dør og fjernes fra en given population. Apoptotisk celledød indledt uløseligt gennem mitochondriet-medierede pathway fungerer som et afgørende forsvarsmekanisme mod malignitet, og korruptionen i den apoptotiske maskiner er et afgørende underskrift af kræftceller [10]. Onkogene Ras-drevet erosion af apoptosecyklus og dets bidrag til kræft er veldokumenteret [11]. Blandt de nedstrøms signalering kaskader af Ras har mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) cascade blevet rapporteret at spille vigtige roller i udviklingen af ​​cancere [12-14]. Et af de vigtigste roller, Ras-MAPK-vejen i en lang række af mammale celler, er regulering af cellecyklus overgang [15]. De proliferative signaler genereret af onkogene Ras kulminerer med opregulering af adskillige transkriptionsfaktorer udløser ekspressionen af ​​cykliner, der tilskriver til aktivering af Ras-MAPK-vejen. Onkogent Ras kan fremme cellecyklusprogression ved at inhibere cyclin-afhængige kinaser (CDK’er). Den undertrykkende virkning medieres af multiple Ras effektor pathways herunder Ras-MAPK-vejen [16,17]. Med vores forståelse, vil bidraget fra onkogene Ras til disse processer utvivlsomt være en spændende allé af kræftforskningen i den kommende fremtid.

Det er velkendt, at små molekyler har afgørende roller i kræft kemoterapi. En lille-molekyle inhibitor, APY606 blev plukket ud af virtuel screening lægemiddel baseret på Ras target receptor i vores seneste arbejde [18]. Imidlertid er dens underliggende mekanisme af anti-cancer egenskaber dårligt forstået. Her blev de tilbundsgående undersøgelser udført for at vurdere dens kræft-kampene natur mod kræft i bugspytkirtlen Capan-1 og SW1990 cellelinjer. Disse resultater viser, APY606 apoptose tilskrives aktiveringen af ​​den indre mitokondrielle apoptotiske vej og forebyggelse af ras-MAPK-vejen kaskade. Samtidig blev APY606 yderligere fundet at inducere S fasen anholdelse og bremse metastaser i de to cellelinjer ved at ændre Ras aktivering. Derfor vil vores forskning danne grundlag for målrettet Ras lægemiddelforskning og APY606 terapeutisk anvendelse i kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), L-15 cellekulturmedium og oksefosterserum (FBS) blev opnået fra Gibco (Grand Island, NY). Alle de andre reagenser blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). APY606 blev venlig at give af NCI /DTP Open Chemical Repository (https://dtp.cancer.gov) og derefter bekræftet af HPLC og ESI-MS. Primære antistoffer mod human caspase-3, caspase-9, cytochrom

c

, Bcl-2, Bax, c-Raf, ERK, pERK, MEK, pMEK, cyclin A, cyclin E og CDK2 blev indkøbt fra Santa Cruz og BD Bioscience, hhv. Antistofferne mod human GAPDH og β-actin blev opnået fra Santa Cruz.

cellelinier og cellekultur

Humane pancreas cancer Capan-1 og SW1990 cellelinjer blev opnået fra cellen Bank of type Culture Collection Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og dyrket i DMEM og L-15 medium indeholdende 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin, hhv. Cellerne blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2 incubator. I processen med cellekultur, der var ikke nogen effekt af mycoplasmaer på de to cellelinier, der blev bekræftet af en fluorochrom DNA-farvning test. APY606 blev opløst i DMSO (dimethylsulfoxid), og frisk fortyndet til den ønskede koncentration med dobbelt destilleret vand umiddelbart før brug. Slutkoncentrationen af ​​DMSO i dyrkningsmediet er 0,1% (v /v). De kontrol celler modtog køretøjet består af dobbelt destilleret vand kun indeholder 0,1% DMSO, som ikke væsentligt påvirker cellerne.

Vækst inhiberingsassay

The Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ) (Dojindo, Japan) assay blev udført for at undersøge virkningen af ​​APY606 på cytotoksicitet. Kort fortalt blev Capan-1 og SW1990 cellelinier podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd i et volumen på 100 pi. Efter inkubation natten over blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af APY606 i 24 timer og 48 timer henholdsvis. Celler blev derefter eksponeret for 10 pi CCK-8 reagens i 3 timer; den optiske densitet ved 450 nm blev aflæst med en M200 PRO NanoQuant autoaflæser (TECAN, Schweiz). I dette assay betyder CCK-8 ikke forstyrrer APY606 og forårsage en positiv reaktion. Målingerne blev udført mindst fem gange.

Colony danner assay

For at teste overlevelsen af ​​celler behandlet med APY606, Capan-1 og SW1990 cellelinjer blev podet i 24-brønds plader ( 200-300 celler pr brønd) og fik lov til at klæbe i 24 timer. Cellerne blev inkuberet i dyrkningsmedium indeholdende APY606 med koncentrationerne af 2, 4, 6, 8 og 10 ug /ml i 6 dage. Derefter blev cellerne fikseret med methanol og farvet med 5% Giemsa og kolonier (mere end 50 celler) blev talt under et omvendt mikroskop (AMG EVOS, Life).

Nuklear farvning assay

APY606-induceret cellekernekondensation og morfologisk ændring blev detekteret ved anvendelse af DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol). Capan-1 og SW1990 cellelinier (5 x 10

6 celle pr plade) blev dyrket på glas-bottom plader til 50% konfluens og derefter dyrket i mediet i nærvær af 6,25, 12,5 og 25,0 ug /mL APY606 for 24 t. Cellerne blev fikseret med 3,5% paraformaldehyd og inkuberes derefter i et fluid indeholdende 2 mg /ml DAPI i 20 min. Det nukleare morfologi af celler blev observeret ved fluorescens mikroskopi (AMG EVOS, Life).

Kvantificering af celle apoptose

Tidligt i apoptose, er phosphatidylserin (PTS) omplantes til den ydre cellemembran og kan identificeres ved binding af Annexin V, en ligand for PTS. Apoptotisk Capan-1 og SW1990 celler blev kvantificeret under anvendelse af Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC) apoptosis afsløring kit (Abcam, UK) efter celler blev behandlet med APY606 ved forskellige koncentrationer (6,25 og 12,5 ug /ml) i 24 timer. Kort fortalt blev cellerne trypsineret og vasket to gange med kold PBS, og derefter blev cellerne resuspenderet ved en densitet på 1 x 10

6 celler /mL i bindingsbuffer (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2). Derefter blev cellerne inkuberet med 5 pi annexin V-FITC og 5 pi PI i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur og underkastet flowcytometrianalyse (FACSAria, BD Biosciences). I alt blev 10.000 begivenheder analyseret i hver prøve. Dataanalyse blev udført med Diva 6.0 software (BD Biosciences).

Måling af mitokondrie membranpotentiale

Nedbrydning af mitokondriel membranpotentiale (A ^ m) er en karakteristisk signatur af apoptose i en mitokondrie-relateret vej . ATm kan måles ved anvendelse fluorescerende probe JC-1. Kort fortalt blev Capan-1 og SW1990 cellelinier udsået i 6-brønds plader (5 × 10

5 celle per brønd) og behandlet med APY606 ved koncentration på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer. Celler blev vasket med PBS og inkuberet i 500 pi JC-1 arbejdsdag opløsning ved 37 ° C i 5% CO

2 i 20 min. Derefter blev celler resuspenderet i 500 pi inkubationsbuffer, efterfulgt af visualisering ved hjælp af konfokal laser scanning mikroskop (CLSM, Leica, TCS SP2). JC-1 blev ophidset af 488 nm laserlys og emission blev fanget ved 530 nm [19]. Faldet af rød /grøn fluorescensintensitet ratio viser tabet af A ^ m i cancerceller.

Bestemmelse af Ras-GTP

Capan-1 og SW1990 cellelinjer blev dyrket i komplet medium natten over, udsultet i 8 timer i medium indeholdende 1% FBS og derefter behandlet i 24 timer med forskellige koncentrationer af APY606. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev celler stimuleret med EGF (10 ng) i 10 minutter. Derefter blev cellerne lyseret, og cellelysatet blev behandlet af en Ras-aktivering assaykit (Upstate, Millipore). Den samlede Ras og de aktive Ras-proteiner blev påvist under anvendelse Western blotting assay som beskrevet nedenfor.

Flowcytometrisk kvantificering af pERK

Udtrykket mængde phosphoryleret ekstracellulær signal-reguleret kinase (pERK) var en udlæsning af Ras-MAPK-vejen kaskade. Til måling af inhibering omfang Erk aktivering eksperimentelt, flowcytometrisk analyse blev anvendt til at opnå kvantitativ encellede måling af mængden af ​​pERK. Kort fortalt blev Capan-1 og SW1990 cellelinier behandles med APY606 ved koncentration på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer, fikseres derefter og permeabiliseret under anvendelse Cytofix /Cytoperm Kit (Becton Dickinson, Mountain View). Efter centrifugering blev 0,05 ug antistof per brønd i 100 pi antistofblanding for en Alexa Fluor 488 konjugeret ERK1 /2-antistof (anti-phospho-p44 /42 MAP kinase, Thr202 /Tyr204, BD Bioscience) tilsat og inkuberet i 1 time på is . Efter vask blev prøver analyseret under anvendelse fluorescensaktiveret cellesorterer FACSAria (BD Bioscience), og procentdelen af ​​farvede celler i hver kvadrant blev kvantificeret under anvendelse Diva 6.0 software (BD Bioscience). I alt blev 10.000 begivenheder analyseret i hver prøve. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Cell cyklus analyse

For at teste den potente mekanisme for APY606-induceret celle væksthæmning, blev effekten af ​​APY606 behandling på cellecyklusfordeling udforsket af flow cytometri. Kort fortalt blev Capan-1 og SW1990 cellelinjer podet (1 × 10

6 celler per brønd i 6-brønds plade) og behandlet med APY606 ved koncentration på 6,25 og 12,5 ug /mL i 24 t. Celler blev suspenderet, fikseret i 70% (v /v) ethanol ved 4 ° C natten over. Derefter blev celler vasket og resuspenderet i 1 ml PBS indeholdende 50 ug /ml PI og 1 mg /ml RNaseA ved stuetemperatur i mørke i 30 min. I alt blev 10.000 begivenheder analyseret umiddelbart i hver prøve ved flowcytometer (FACSCalibur, BD Biosciences). Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Sårheling assay

For at undersøge indflydelsen af ​​APY606 på motiliteten evne cancerceller, sårheling assay blev udført for at evaluere cellemotilitet af APY606 -behandlede celler. Capan-1 og SW1990 cellelinier blev udpladet på 24-brønds dyrkningsskåle og derefter scoret med en mikropipettespids. Mediet blev erstattet med 12,5 ug /mL APY606 i det komplette medium, og cellen migration blev overvåget ved anvendelse CLSM i 24 timer. Billeder blev fanget, og sårlukning afstand (sammenlignet med kontrol ved 0 h) blev målt i tre uafhængige sårsteder per gruppe. Relativ celle motilitet sammenlignes som forskellen sår bredde mellem ved 0 timer og ved 24 timer.

Trans-brønd kammer assay

For yderligere at undersøge effekten af ​​APY606 på invasionen evne cancerceller , Matrigel trans-brønd kammer assay blev udført. Capan-1 og SW1990 cellelinier blev podet på plader med 6 brønde med en tæthed på 2 x 10

5 celler /brønd og dyrket i 24 timer. Efter cellerne blev udsultet i 24 timer blev celler behandlet med 12,5 ug /ml APY606. Derefter blev celler opsamlet og 1 x 10

5-celler fortyndet med serumfrit medium blev udpladet til trans-brønds enheder med polycarbonatfiltre (Cambridge, MA) indeholdende 8 um porer. Den polycarbonatmembran blev præ-overtrukket med 250 ug /ml Matrigel (BD Biosciences). De nederste kamre blev fyldt med 600 pi medium indeholdende 5% FBS. Efter 24 timer blev cellerne fikseret i methanol og farvet med acridin orange (AO, Dingguo, Kina). Den øverste overflade af membranen blev forsigtigt skrubbes med en vatpind, og cellerne invaderende gennem filtre membran blev talt på glasbund dyrkningsplader, og billeder svarende til hele membranoverfladen blev erobret af CLSM.

Western blotting analyse

for at tydeliggøre de underliggende mekanismer for APY606-induceret celle apoptose og cellecyklusstop på molekylært niveau, blev Western blotting analyser undersøgt. Capan-1 og SW1990 cellelinjer blev vasket med kold PBS efter 24 timers behandling med APY606 ved koncentration på 6,25 og 12,5 ug /ml. Efter cellulære proteiner blev ekstraheret og kvantificeret, blev samme mængde protein elektroforesebehandlet på 10% SDS-PAGE-gel og derefter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). Derefter blev PVDF-membran probet med den angivne primære antistof natten over ved 4 ° C og yderligere blottet med passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof. Visualisering blev udført ved anvendelse kemiluminescens detektor (DNR, Kiryat Anavim, Israel). Proteinniveauet blev normaliseret under anvendelse af GAPDH eller β-actin som en intern kontrol.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som middelværdi ± SD af tredobbelte eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 11.5 statistisk software.

Resultater

1. APY606 hæmmer spredning af Capan-1 og SW1990 cellelinjer

At udforske vækstpotentialet hæmning af APY606 i de to cancer cellelinjer, kz-afhængige hæmmende effekter af APY606 på væksten af ​​Capan-1 og SW1990 celle linjer blev evalueret som vist i fig 1A. Når Capan-1-celler blev behandlet med APY606 ved en koncentration på 12,5, 25,0 og 50,0 ug /ml i 24 timer, procentdelen af ​​vækstinhibering over kontrolceller (100%) var næsten 21,0 ± 2,6%, 81,3 ± 0,5% og 93,3 ± 0,6% hhv. Følgelig procentdelen af ​​inhiberede SW1990 celler løbet kontrolcellerne (100%) var 52,3 ± 1,5%, 82,3 ± 0,6% og 90,0 ± 1,0% hhv. Når Capan-1-celler blev behandlet med APY606 ved de samme betingelser i 48 timer, procentdelen af ​​vækstinhibering over kontrolceller (100%) var ca. 50,0 ± 1,7%, 90,0% og 93,0%, henholdsvis. I mellemtiden, procentdelen af ​​inhiberede SW1990 celler løbet kontrolcellerne (100%) var 71,7 ± 3,2%, 75,3 ± 1,5% og 87,3 ± 2,3% hhv. IC

50 værdi for APY606 var 14,3 ± 1,3 ug /ml (24 h) og 9,5 ± 0,6 ug /ml (48 h) i Capan-1-celler samt 10,3 ± 1,1 ug /ml (24 timer) og 6,8 ± 2,3 ug /ml (48 h) i SW1990-celler, hhv. Derudover har vi også undersøgt virkningen af ​​APY606 på overlevelsesraten for Capan-1 og SW1990 cellelinier ved kolonidannende assay. APY606 behandling resulterede i en signifikant inhibering af kolonidannelse i de to cellelinjer i en dosisafhængig måde (Fig 1B). Kollektivt vores resultater indikerede, at APY606 induceret koncentrationsafhængige inhiberende virkninger på væksten og overlevelsen af ​​både Capan-1 og SW1990 cellelinier.

Celler blev behandlet med angivne koncentrationer af APY606 for 24 og 48 timer og derefter vurderet af CCK-8 (A) og kolonidannende (B) assay hhv. Præsenteret data er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. Kernefarvning billeder (C) blev taget af fluorescerende mikroskop med 10 × mål. Skalaen bar var 20 um.

Endvidere blev cellekernemorfologi af celler detekteret ved DAPI der er en blå fluorescens farvestof specielt bindende A-T-rige regioner i DNA. DAPI kan passere gennem en intakt cellemembran derfor kan det bruges til at farve både levende og fikserede celler, selvom det passerer gennem membranen mindre effektivt i levende celler og derfor effektiviteten af ​​pletten er lavere. Den blå fluorescens intensitet i Capan-1 og SW1990 cellelinier behandlet med APY606 ved en koncentration på 6,25, 12,5 og 25,0 ug /ml i 24 timer var stærkere end den kontrolgrupper behandlet med vehikel som vist i fig 1C. Desuden er det klart, at de kondenserede og fragmenterede kerner steget med APY606 behandling i en koncentrationsafhængig måde.

2. APY606 inducerer apoptose af Capan-1 og SW1990 cellelinjer

For at vurdere apoptose-inducerende effekt af APY606 på Capan-1 og SW1990 cellelinjer, blev antallet af apoptotiske celler kvantificeres ved hjælp af flowcytometrisk analyse. Celler farvet positive for annexin V-FITC og negativ for PI undergår apoptose; celler farvet positive for både annexin V-FITC og PI er enten i slutstadiet af apoptose undergår nekrose eller allerede død; celler farvet negativ for både annexin V-FITC og PI er i live uden at undergå apoptose [20]. Som vist i figur 2A, antallet af apoptotiske celler var ubetydelig (0,4-1,0%) i kontrolcellerne i de to cellelinier behandlet med bærer. Mens andelen af ​​tidlige apoptotiske celler blev øget til 21,3 ± 3,5% og 50,4 ± 5,5% efter Capan-1-celler blev behandlet med APY606 på 6,25 og 12,5 ug /mL i 24 t. I 48 timer behandling blev værdierne steg til 22,0 ± 2,3% og 54,4 ± 6,2% hhv. Ligeledes ved de samme betingelser, var værdierne 23,4 ± 2,4% og 63,9 ± 7,2% samt 49,9 ± 3,5% og 75,1 ± 6,3% efter SW1990 celler blev udsat for APY606 i 24 timer og 48 timer, hhv. Resultaterne viste klart, at APY606 inducerede en tids- og koncentrationsafhængig apoptose i Capan-1 og SW1990 cellelinier.

Procentdele af apoptotiske cellepopulationer i de to cellelinier behandlet med 6,25 og 12,5 ug /ml APY606 i 24 og 48 timer blev bestemt ved hjælp af flowcytometer (A). Præsenteret data er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. Virkning af APY606 behandling på proteiner relateret til apoptotiske vej blev målt ved anvendelse Western blotting-analyse. Repræsentative blots af respektive proteiner blev vist (B). GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. (C):. Relativ tæthed af target protein blev kvantificeret og plottet

For at undersøge mekanismen ansvarlig for APY606-induceret apoptose, vi evaluerede niveauerne af Bax, Bcl-2, cytosolisk cytochrom

c

, og aktiveringen af ​​caspase-3 og caspase-9 i Capan-1 og SW1990 cellelinier behandlet med APY606 ved koncentration på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer under anvendelse af Western blotting-analyse. Virkningerne af APY606 behandling på ekspressionsniveauerne af pro-apoptotisk protein Bax og anti-apoptotiske protein Bcl-2 blev eksperimentelt undersøgt. Behandling af celler signifikant forøgede ekspressionsniveauet af Bax men faldt den af ​​Bcl-2 i en koncentrationsafhængig måde (figur 2B). Cytochrom

c

er et af de centrale formidlere af den mitokondrielle eller iboende apoptosecyklus. Frigivelsen af ​​cytochrom

c

fra mitokondrie intermembrane rummet er den tidlige hændelse under apoptotisk celledød [21]. Som sådan effekten af ​​APY606 behandling på frigivelse af cytochrom

c

i de to cellelinier blev evalueret. Eksponering af celler til APY606 blev observeret at øge frigivelsen af ​​cytochrom

c

fra mitokondrier i cytosol i en koncentrationsafhængig måde (figur 2C). Ved apoptotisk stimulation, cytochrom

c

frigivne associerer med procaspase-9 at danne et kompleks behandling caspase-9 fra inaktive proenzym til dets aktive form, til sidst udløser caspase-3-aktivering og apoptose [21]. Som vist i fig 2B og 2C, APY606 inducerede bemærkelsesværdigt koncentration-afhængig aktivering af caspase-3 og caspase-9 og til sidst førte til apoptotisk død i Capan-1 og SW1990 cellelinier.

3. APY606 inducerer ATm

udtømning af A ^ m er et tidligt og væsentlige apoptotisk reaktion på anti-cancer terapi. Mitokondriel forstyrrelser initierer processen af ​​apoptose, som efterfølgende fører til væksthæmning. For yderligere at undersøge mekanismen for APY606-induceret celle apoptose, vi bestemt effekten af ​​APY606 på A ^ m i Capan-1 og SW1990 cellelinjer. Det kationiske farvestof JC-1 er nyttig til påvisning af A ^ m optræder ved det tidlige stadium af apoptose [22]. I levende celler, JC-1 udviser potentiale afhængig akkumulering i mitokondrier der fører til koncentrationsafhængig dannelse af rød fluorescens J-aggregater [23], der indikerer tilstedeværelsen af ​​polariserede mitokondrier. På depolarisering, JC-1 monomer binding med mitokondriemembranen resultater i grøn fluorescens og en reduktion i orange-rød farvning. Således er mitokondrie depolarisering indikeret ved et fald i rød /grøn fluorescensintensitet ratio. Forholdet mellem rød til grøn fluorescens kun afhænger membranpotentialet og ikke på andre faktorer såsom mitokondrisk størrelse, form og massefylde, der kan påvirke enkeltkomponent fluorescenssignaler.

Her kontrol og APY606-behandlede Capan-1 og SW1990 cellelinjer farvet med JC-1 blev overvåget ved CLSM. Som vist i figur 3, blev dannelsen af ​​røde fluorescerende J-aggregater signifikant reduceret i de to cellelinier behandlet med 6,25 og 12,5 ug /mL APY606 sammenlignet med kontrolceller. I modsætning hertil blev den grønne fluorescens særligt bemærket i APY606-behandlede celler på grund af JC-1 monomer binding. Forholdet mellem grøn til rød fluorescens blev forøget i APY606-behandlede celler i en koncentrationsafhængig måde, hvilket antyder, at fluorescensen ændring var indikativ for A ^ m. Tab af ATm blev observeret under APY606 behandling, hvilket antyder, at mitochondrier påvirkes især tidligt under den apoptotiske proces.

Kontrol og APY606-behandlede celler farvet med JC-1 blev overvåget ved CLSM. J-aggregeret form (rød fluorescens) og J-monomer alene (grøn fluorescens) var begejstrede ved 568 og 480 nm. Målestokken var 20 pm.

4. APY606 hæmmer Ras-MAPK-vejen inducerer apoptotisk respons

Med sigte på at vurdere eventuelt målrettet Ras terapeutisk strategi, vi først undersøgt hæmning af Ras-GTP aktivitet i celle-baserede assay. I teorien vil APY606 handle for at mindske Ras-GTP aktivitetsniveau. At tage højde for denne forudsigelse blev virkningen af ​​APY606 på bugspytkirtelkræftceller evalueret ved brug af Raf1RBD pull-down assay. Som forudsagt, de udstrækninger af Ras-aktivering i serum-udsultede Capan-1 og SW1990 blev væsentligt reduceret i nærværelse af APY606 på en dosis-afhængig måde uden en signifikant fald i total Ras niveau (figur 4).

serum-udsultede celler blev behandlet med vehikel eller angivne koncentrationer af APY606 i 24 timer og derefter stimuleret med EGF i 10 minutter. APY606 dæmper cellulær Ras-aktivering i Capan-1 (A) og SW1990 (B) cellelinjer. GTP-bundet Ras blev isoleret ved RBD pull-down assay og påvist ved Ras-GTP aktivering kit. Totale mængde af Ras blev påvist ved anti-Ras-specifikt antistof. Relativ tæthed af target protein blev kvantificeret og plottet.

Raf kinaser er bedst kendt som centrale regulatorer af Ras-MAPK kaskade, og blokken af ​​Ras-MAPK signalvejen har en vigtig rolle i induktion af cancercelle apoptose [24]. For at kontrollere den underliggende mekanisme af apoptose induktion, vi evaluerede effekten af ​​APY606 på Ras-MAPK-vejen i begge Capan-1 og SW1990 cellelinjer. Behandling af de to cellelinjer med APY606 på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer faldt betydeligt phosphoryleringen af ​​MEK og ERK sammenlignet med kontrolcellerne (figur 5A og 5B). Men eksponering af de to cellelinier til APY606 ikke påvirke de samlede niveauer af MEK og ERK. Især blev ekspressionsniveauet af c-Raf signifikant med stigende koncentration af APY606 sammenlignet med kontrolceller. Dette resultat viste, at APY606 induceret apoptose ved at blokere Ras-MAPK-signalvejen.

cellelysater blev analyseret i immunblotting med respektive primære antistof efterfulgt af det andet antistof, og de repræsentative blots blev målt. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. Relativ densitet af target protein blev kvantificeret og plottet. Flowcytometrisk påvisning af phospho-ERK blev udført i begge Capan-1 og SW1990 cellelinier (C). Præsenteret data er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg.

Generelt blev omfanget af pERK betragtes som en indikator for Ras-aktivering [25]. Baseret på dette, vi samtidigt udføres en flowcytometrisk analyse til opnåelse kvantitativ encellede måling. Som vist i fig 5C, APY606 forårsagede produktion ugunstigt pERK i Capan-1 (76,7 ± 1,2%) og SW1990 (46,3 ± 2,6%) cellelinjer ved 12,5 ug /mL dosis end gjorde i vehikelbehandlede kontrolceller i henholdsvis aftale med tendens til Western blotting-analyse.

5. APY606 arresterer cellecyklussen i S-fasen

Mange cytotoksiske midler standse cellecyklussen ved G1, S eller G2-M-fase [26]. For at vurdere mekanismen for APY606-induceret cellevækstinhibering, blev virkningen af ​​APY606 på cellecyklusfordeling først udforsket kvantitativt i Capan-1 og SW1990 cellelinjer under anvendelse flowcytometrisk analyse. Behandling af de to cellelinjer med APY606 på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer markant påvirkede antallet af celler i G1 og S faser på en koncentrationsafhængig måde, men antallet af celler i G2 fase blev ikke signally ændret i forhold til kontrolcellerne (figur 6A). Efter behandling af Capan-1-celler med APY606 på 12,5 ug /mL, at antallet af celler standset i G1-fasen var 62.83% sammenlignet med kontrolceller; dette resulterede i et fald på 18,78% (p = 0,027). Samtidig procentdelen af ​​celler standset i S-fase var 35,59%; dette gav en stigning på 18,09% (p = 0,043) sammenlignet med kontrol celler behandlet med kun køretøj. For fordelingen af ​​SW1990 celler i G1 og S faser, eksponering af celler til APY606 gav anledning til en mere bemærkelsesværdig effekt. Behandling af SW1990 celler med APY606 på 12,5 pg /ml reducerede signifikant antallet af celler standset i G1-fasen ved 32.84% (p = 0,002) og øgede antallet af celler i S-fasen ved 33.57% (p = 0,042), henholdsvis. Disse data viste, at APY606 resulterede i vækstinhibition, der fremkaldte en fremtrædende, langvarig akkumulering af celler i S-fasen og en reduktion af celler i G1-fasen i begge Capan-1 og SW1990 cellelinier.

Capan-1 og SW1990 cellelinier blev behandlet med angivne koncentrationer af APY606 i 24 timer. Repræsentative procentdele af cellepopulationer i G1, S og G2 faserne af cellecyklussen i de to cellelinier blev analyseret ved flowcytometri (A). G1-overgang-relaterede proteiner blev analyseret under anvendelse af Western blotting assay (B). Lignende forsøg blev gentaget mindst tre gange med lignende resultater, og de repræsentative blots blev præsenteret. β-actin blev anvendt som intern kontrol. Relativ tæthed af target protein blev kvantificeret og plottet (C).

cellecyklusprogression er stramt reguleret af cycliner og CDK’er. De reducerede udtryk for cyklin A, cyklin E og CDK2 er kendetegnende for cellecyklus arrest i S-fasen. For at kvalitativt undersøge mekanismen for APY606-induceret cellecyklusstandsning drøftede vi effekten af ​​APY606 behandling på ekspressionsniveauerne af cyclin A, cyclin E og CDK2 i Capan-1 og SW1990 cellelinjer under anvendelse Western blotting assay.