PLoS ONE: L1 celleadhæsionsmolekyle-Specific kimære antigen receptor-Omdirigeret Humane T celler Exhibit Specifik og effektiv antitumoraktivitet mod human kræft i æggestokkene i mus

Der er behov for

Abstrakte

Nye terapeutiske modaliteter for ovariecancer, den mest dødbringende gynækologisk malignitet. Nylige kliniske forsøg har vist imponerende terapeutiske potentiale af adoptiv behandling med kimære antigen receptor (CAR) -redirected T-celler til at målrette hæmatologiske kræftformer, og nye undersøgelser tyder på kan opnås en lignende effekt til faste kræftformer. Vi søgte bestemme, om genetisk modificerede T-celler målrettet mod CE7-epitop af L1-CAM, et celleadhæsionsmolekyle udtrykkes afvigende i flere kræftformer, har lovende som en immunterapi til ovariecancer, første påvisning af, at L1-CAM var stærkt overudtrykt på et panel af æggestokkene cancercellelinjer, primære ovarian tumor vævsprøver og ascites-afledte primære cancerceller. Humane centrale hukommelse afledt T-celler (T

CM) blev derefter genetisk modificeret til at udtrykke en anti-L1-CAM CAR (CE7R), som instrueret effektorfunktion på tumorantigen stimulation som vurderet af

in vitro

cytokin sekretion og cytotoksicitetsassays. Vi fandt også, CE7R

+ T-celler var i stand til at målrette primære ovariecancerceller. Intraperitoneal (i.p.) administration af CE7R

+ T

CM inducerede en signifikant regression af i.p. etablerede SK-OV-3 xenograft tumorer hos mus, hæmmede ascites dannelse, og medførte en betydelig overlevelse fordel i forhold til kontrol-behandlede dyr. Tilsammen disse undersøgelser indikerer, at adoptiv overførsel af L1-CAM-specifikke CE7R

+ T-celler kan tilbyde en ny og effektiv immunterapi strategi for fremskreden ovariecancer

Henvisning:. Hong H, Brown CE, Ostberg JR, Priceman SJ, Chang WC, Weng L, et al. (2016) L1 celleadhæsionsmolekyle-Specifikke kimære antigen receptor-Omdirigeret Humane T celler Exhibit Specifik og effektiv antitumoraktivitet mod human kræft i æggestokkene i mus. PLoS ONE 11 (1): e0146885. doi: 10,1371 /journal.pone.0146885

Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, UNITED STATES

Modtaget: 3. september 2015; Accepteret: December 24, 2015; Udgivet: 13 januar 2016

Copyright: © 2016 Hong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af Hoeven Family Kidney Cancer Research Fund, og NCI Cancer center Support Grant (P30 CA33572)

konkurrerende interesser: MCJ rapporter, der modtager kommercielle forskningsstøtte fra, har ejerandel (herunder patenter) i, og er konsulent /advisory board medlem for Juno Therapeutics, Inc. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. Alle andre forfattere har nogen interessekonflikter at afsløre.

Introduktion

Kræft i æggestokkene er den mest dødbringende blandt alle gynækologiske maligniteter, og er ansvarlig for hovedparten af ​​gynækologiske kræftdødsfald, med en anslået 14.030 dødsfald i 2013 [1]. Trods forbedringer i kirurgiske metoder og finpudsninger af frontline cytotoksiske kombinationer i løbet af de seneste to årtier, de fleste patienter i fremskredne stadier af sygdommen på diagnosetidspunktet til sidst bukke under for tumor recidiv [2]. Således er desperat behov nye behandlingsmetoder. Med den voksende erkendelse af, at ovarietumorer er immunogene, og kan genkendes og angrebet af immunsystemet, har forskellige immun-baserede modaliteter været aktivt udforskes for at forøge effektiviteten af ​​konventionelle terapier med potentiale til at forhindre gentagelser. Faktisk har en række peptidvacciner, dendritiske celle vacciner og adoptivforældre celleterapi strategier blevet undersøgt i kliniske forsøg (revideret i [3]).

Den seneste kliniske effekt af kimære antigen receptor (CAR) -baseret adoptiv T-celle immunterapi til behandling af delmængder af patienter med akut lymfoblastær leukæmi og kronisk lymfatisk leukæmi (revideret i [4, 5]) har givet vigtig støtte for at udvide denne form for immunterapi til behandling et bredere anvendelsesområde af maligniteter. Biler er enestående i tilføre T-celler med cytotoksiske effektorfunktioner i en HLA-lidt bindende måde, og er således ikke omfattet af tumorundvigelse som følge af HLA nedregulering (revideret i [6]). Dette er særlig vigtigt i ovariecancer, hvor fremskreden sygdom er korreleret med HLA nedregulering [7]. Faktisk bestræbelser på at designe CAR T-celler til behandling af ovariecancer har været fokus for flere prækliniske og kliniske studier. Præklinisk antitumoraktivitet mod ovarietumorer er blevet rapporteret under anvendelse af T-celler, der udtrykker CARs specifikke for mesothelin [8] og MUC16 [9]. Folat receptor-specifik CAR-modificerede T-celler er blevet testet i en fase I forsøg til tilbagevendende ovariecancer, men mangel på T-celle persistens og lokalisering til tumoren, samt manglende tumorregression foreslår, at strategien kræver yderligere optimering [10 ].

Vi og andre har vist, at L1-celleadhæsionsmolekyle (L1-CAM) er meget over-udtrykt i kræft i æggestokkene, mens fraværende i normale æggestokke [11, 12], og at dens udtryk på tumorer er forbundet med dårlig klinisk resultat [13-15]. Tidligere undersøgelser har også rapporteret, at monoklonale antistoffer rettet mod L1-CAM inhiberer væksten af ​​faste tumorceller

in vitro

og væksten af ​​SKOV3 humane ovariekarcinomceller i en human xenograft model [16]. Disse data, sammen med vores tidligere erfaring med at bruge cytotoksiske T-lymfocytter, der udtrykker en CAR specifikt for CE7 epitop af L1-CAM (CE7R) at behandle børn med fremskreden refraktær neuroblastom [17], har resulteret i vores interesse i at undersøge nytten af ​​CE7R

+ T-celler som en potentiel immunterapeutisk strategi i kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

tumorcellelinjer

æggestokkene adenocarcinom linjer CAOV-3, OVCAR-3, SK -OV-3, MADH2780, og A2780 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket under ATCC foreslået betingelser. Generering af EBV-transformerede lymfoblastoide cellelinie, som udtrykker en membran tøjret OKT3 enkeltkædet antistof (LCL-OKT3) er tidligere blevet beskrevet [18]. Ildflueluciferase-positive SK-OV-3 celler (ffluc + SK-OV-3) blev frembragt ved lentiviral transduktion af SK-OV-3-celler med en eGFP-ffLuc_epHIV7 lentivirusvektor ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 5. Kryopræserverede banker af alle cellelinier blev autentificeret for det ønskede antigen /markør-ekspression ved flowcytometri, og optøede celler blev dyrket i mindre end seks måneder før anvendelse i assays.

Frisk-isolerede ascitesvæske fra patienter med ovariecancer, som gennemgik paracentese blev opnået fra City of Hope National Medical center (COHNMC) kirurgisk personalet i en steril vakuum beholder med godkendelse af COHNMC Institutional Review Board (IRB) og Office of personmotiver Protection. Den COHNMC IRB frafaldes behovet for skriftligt informeret samtykke, da alle prøver blev de-identificeret og ascites var affald. Ascites blev derefter øjeblikkeligt anbragt i kultur med et lige volumen af ​​MCDB105 (Sigma) /M199 (Gibco) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (HyClone), og penicillin /streptomycin (Fisher Scientific). Ovarietumorceller vinder klæbet til cellekulturen pladeoverfladen. Alle eksperimenter ved hjælp af primære celler blev udført inden for to kultur passager.

DNA-konstruktioner og lentiviral vektor

CE7R28Z-T2A-CD19tDHFR

FS_epHIV7 og CE7R (EQ) 28Z-T2A-CD19t_epHIV7 lentiviral konstruktioner anvendt til at generere CE7R

+ -celler indeholdt a) det kimære antigen receptor (CAR) sekvens bestående af V

H og V

L gen-segmenter af L1-CAM-specifik CE7 mAb [19], en IgG4 hængsel-CH2-CH3-sekvensen, enten med eller uden L235E og N297Q dobbelt mutation (EQ) for at forhindre FcR binding og således forbedre persistens i NSG mus [20], de transmembrane og cytoplasmatiske signalsystemer domæner af costimulerende molekyle CD28, der indeholder gg mutationer, der kan forbedre CAR ekspression og funktion [21], og det cytoplasmatiske domæne af CD3ζ kæde [22]; b) det ribosomale springe T2A sekvens [23]; og c) den trunkerede humane CD19 (CD19t) transduktion selektionsmarkør sekvens, som mangler den cytoplasmiske signalering hale (trunkeret i aminosyre 323), i nogle tilfælde direkte efterfulgt af dobbelt muterede humane dihydrofolatreduktase-gen (L22F, F31S, DHFR

FS), som giver resistens over immunosuppressive lægemidler af methotrexat (MTX) [24]. GM-CSF-receptor alfa kæde signalsekvensen blev anvendt til både a) og c) til at drive celleoverfladeekspression af bilen og selektionsgener. The CD19R (EQ) 28Z-T2A-EGFRt-T2A-DHFR

FS_epHIV7 lentiviral konstrukt anvendes til at generere CD19-specifik CAR (CD19R +) T

CM indeholdt de samme angivne bestanddele som beskrevet ovenfor for CE7R-holdige konstruktioner, med undtagelse af den bil, som har V

H og V

L gen segmenter af CD19-specifikke FMC63 mAb [25], og brugen af ​​en afkortet human EGFR (EGFRt) som transduktion selektionsmarkøren [ ,,,0],26]. Alle konstruere og konstruktion associeret polymerase kædereaktion primer sekvenser er tilgængelige efter anmodning.

Aktivering, lentiviral transduktion, og udvidelse af T

CM

Humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev isoleret som beskrevet [18] fra hepariniseret perifert blod fra sunde donorer leukaferese produkter eller kassere kits indeholder resterende blodkomponenter af raske donorer, der havde gennemgået aferese på COHNMC med godkendelse af COHNMC IRB og Office for human Emner Beskyttelse. Blodprøver fra sunde donor leukaferese produkterne fremstilles med skriftligt informeret samtykke. Den COHNMC IRB frafaldes behovet for skriftligt informeret samtykke af blodprøver fra raske donorer leukaferese udsmid kits som disse blev de-identificeret og indhentet fra affald. T

CM isolation (under anvendelse CD14- og CD45RA-depletion efterfulgt af CD62L-udvælgelse), anti-CD3 /CD28 bead stimulation, og lentiviral-medieret transduktion blev derefter udført som tidligere beskrevet [27] ved brug MOI i området fra 1 til 3 . The Dynabeads Humant T Expander CD3 /CD28 (Invitrogen) blev fjernet mellem dag 10 og 14, og perle-fri T-celler blev ekspanderet med en celletæthed på 0,5-1 x10

6 celler /mL med cytokiner [27]. I nogle tilfælde cellerne transduceret med CE7R28Z-T2A-CD19tDHFR

FS_epHIV7 undergik yderligere ekspansion (Rapid ekspansion metode REM) som tidligere beskrevet [18] med eller uden DHFR

FS-medieret udvælgelse ved anvendelse af 0,1 pM methotrexat (MTX) [24].

Flowcytometri

celleoverflade-L1-CAM blev vurderet med oprenset CE7 mAb [12] efterfulgt af phycoerythrin (PE) -konjugeret gede-anti-muse-IgG (BD Biosciences) . CAR (CE7R eller CD19R) ekspression blev vurderet med biotinyleret Donkey anti-human Fcy (Jackson ImmunoResearch Laboratories) efterfulgt af PE-konjugeret streptavidin (SA-PE, BD Biosciences). Alternativt blev transgenekspression evalueret ved at detektere CD19t eller EGFRt markører med enten PE-konjugeret anti-CD19 (Beckman Coulter) eller biotinyleret-cetuximab [26] efterfulgt af SA-PE hhv. CD4 og CD8-ekspression blev påvist under anvendelse fluorochrom-konjugeret anti-CD4 og anti-CD8 (BD Biosciences). Flourochrome-konjugerede isotype-matchede mAbs tjente som kontroller (BD Biosciences). Dataindsamling blev udført på en FACScalibur (BD Biosciences) og procentdele af immunreaktive celler blev beregnet ved anvendelse FCS Express version 3 software (De Novo Software).

Immunohistokemisk farvning

Immunhistokemisk evaluering af L1-CAM ekspression via CE7 mAb blev udført som tidligere beskrevet [12].

Immunofluorescens konfokal mikroskopi

Frisk opnåede ascites celler blev direkte afsat på objektglas under anvendelse af en Shandon Cytospin 4 cytocentrifuge, fikseret i 4% paraformaldehyd, permeabiliseret i 0,1% Triton X-100, og opbevaret i PBS ved 4 ° C indtil farvet natten med enten CE7 mAb [12] eller keratin 18 mAb (Cell Signaling) ved 4 ° C, efterfulgt af Alexa Fluor 488-konjugeret gede-anti -mouse IgG-farvning ved stuetemperatur i en time. Kerner var counter-farvet med DAPI. Negative kontroller blev farvet parallelt ved kun sekundært antistof. Celler blev undersøgt på en Zeiss opretstående LSM 510 2-foton mikroskop. Billeder blev erhvervet med Zeiss plan-Neofluar 20 /0.5air linse eller plan Neofluar 40 /1.3 blændetal immersionsolie objektiv, og synsfelter blev derefter analyseret ved hjælp af Zeiss LSM Image Browser.

Western analyse

Western blotting-analyse for CE7R ekspression blev udført under anvendelse af et anti-humant CD3ζ kæde (cytoplasmatisk hale) -specifik monoklonale antistof 8D3 (BD ​​Pharmingen) efterfulgt af gede-anti-muse-IgM (mu-kæde) IRDye

® 800CW konjugeret sekundært antistof (Rockland Immunochemicals Inc), og billeddannelse med Odysseen Infrared Imaging System (LI-COR).

cytotoksicitet og cytokinproduktion analyser

4 timers

51Cr frigivelse og inflammatoriske analyser cytokin frigørelse blev udført som beskrevet tidligere [12].

xenograft æggestokkene tumor model og Xenogen imaging

Otte uger gammel kvinde NOD /SCID-IL2Rγnull (NSG) mus blev podet ip med 3×10

4 ffLuc

+ SK-OV-3 celler på dag 0. Tumor indpodning blev vurderet ved Xenogen ikke-invasiv optisk afbildning som tidligere beskrevet [28], og mus med gradvis voksende tumorer blev adskilt i forskellige grupper at modtage to ip injektioner af enten 5 x 10

6 CE7R

+ T

CM (14,7 x 10

6 af total celler), 14,7 x 10

6 mock-transducerede T-celler, eller PBS på dag 5 og 12. Optisk billeddannelse blev fortsat efter adoptiv T celleterapi til overvågning af tumorvækst. Humane endpoints blev brugt under dyrets overlevelse undersøgelse med mus aflivet ved CO

2 inhalation på tegn på lidelse såsom udspilet mave på grund af tumor ascites dannelse, kramper, rystelser, anstrengt eller åndedrætsbesvær, vægttab ( 20% legemsvægt), tegn på afmagring (dvs. fremtrædende skeletstrukturer), nedsat bevægelighed, en manglende evne til at forblive oprejst, eller tegn på at være døende. Mus blev overvåget op til en gang dagligt som overlevelsesundersøgelse skred frem, med ingen uventede dødsfald. Alle mus eksperimenter blev revideret og godkendt af COHNMC Institute Animal Care og brug Udvalg.

Fluorescens in situ hybridisering (FISH)

Celler blev udsat for 0,075 M KCl ved 37 ° C i 20 minutter , fikseret med Carnoys fiksativ, og faldt på objektglas. Objektglas blev derefter inkuberet i 2 X SSC ved 37 ° C i 30 minutter, dehydreret gennem ethanol serie, blev lufttørret og følgende prober anvendt: LSID13S319 /LSI 13q34, CEP4, CEP10, og CEP 17 (Abbott Molecular), og homebrew prober for kromosom 5 og 9. BAC 53k22 (5p15) og P1-1069 (CDKN2A) blev mærket i Spectrum Orange (Abbott Molecular). BAC 98O22 (5q31) og PACS 835j22 og 1132h12 (ABL) blev mærket i Spectrum Green (Abbott Molecular). Efter hybridisering natten over ved 37 ° C blev objektglassene vasket i 0.4XSSC /0,1% Igepal ved 72 ° C i 2 minutter efterfulgt af 2XSSC /0,3% Igepal ved stuetemperatur i 2 minutter, modfarvet med DAPI (Vector Laboratories) og afbildet på den Bioview Duet Image Analyzer. Et minimum af 200 celler blev scoret per prøve.

Statistisk analyse

Uparret Students t-test blev anvendt til at evaluere forskelle i flux værdier via Xenogen Living Image (fotoner /s). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test. GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software) blev anvendt til disse statistiske beregninger. Værdier af P 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

L1-CAM er en klinisk relevant kræft i æggestokkene associeret antigen

For yderligere at evaluere L1-CAM som et mål antigen på æggestokkene cancerceller, vi først screenet celleoverfladeekspression af CE7 epitop af L1-CAM på fem ovariekræft cellelinier ved flowcytometrisk analyse. Den CE7 epitop af L1-CAM er blevet foreslået at have tumor-begrænset ekspression, som det er blevet påvist på forskellige tumorvæv og maligne cellelinjer, mens mange normale væv ikke udtrykker dette antigen, og visse ikke-maligne celler, ligesom monocytter , express L1-CAM, men ikke dens CE7 epitop [12]. Ud af de fem ovariecancer linjer undersøgt her, fire af dem, OVCAR-3, SK-OV-3, MADH2744 og CAOV-3, udtrykte høje niveauer af L1-CAM /CE7 henviser A2780 celler udviste ringe til ingen L1-CAM /CE7 udtryk (figur 1A), udvide på vores tidligere resultater [12].

A, Cell-overfladeekspression af L1-CAM i forskellige æggestokkene tumor linjer, herunder CAOV-3, OVCAR-3, SK-OV 3, MADH2744 og A2780 blev undersøgt ved flowcytometri via CE7 mAb. Mean fluorescensintensitet (MFI) og procentdele af celler med positiv farvning (%, røde histogrammer) i løbet sekundært reagens alene (sorte histogrammer) er vist. B, Human ovariecancer væv microarray af primære og metastatiske tumorer blev immunhistokemisk farvet med CE7 mAb. Repræsentative billeder fra hver histologisk undertype er afbildet. Mikrofotografier er vist ved 400x forstørrelse (okulær 10x; objektiv 40x). C, Fresh ascites celler afledt fra patienter med ovariecancer blev immunofluorescently farves (

Venstre

) under anvendelse af anti-keratin 18 mus eller CE7 mAb efterfulgt af Alexa Fluor 488-konjugeret gede-anti-muse-IgG. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Ascites celler blev også immunhistokemisk farvet (

Right

) med de samme primære antistoffer. I hvert tilfælde, farvning med gede-anti-muse-sekundært antistof alene (2 ° Ab) tjente som negative kontroller.

L1-CAM /CE7 ekspression blev næste evalueret på forskellige histologiske undertyper af primær patient- afledte ovarietumor prøvemateriale ved immunhistokemisk farvning af 40 tilfælde af æggestokkene tumorvæv microarray [12]. Positiv immunoreaktivitet af L1-CAM /CE7 blev påvist i 39 tilfælde [12], og kalibreres alle fire histologiske undertyper undersøgte herunder serøs, klar celle, endometrioide, og mucinøs (figur 1B). Der var en betydelig heterogenitet i L1-CAM /CE7 ekspression mellem tumorprøver, herunder andelen af ​​tumorceller, der udtrykker L1-CAM /CE7, og intensiteten af ​​L1-CAM farvning. Notatet blev L1-CAM /CE7 ikke fundet på alle prøver af normal æggestok, men findes på forskelligt omfang på de fleste undergrupper af æggestokkene adenokarcinomer (Fig 1B).

L1-CAM /CE7 udtryk på frisk kræft i æggestokkene celler direkte afledt af ascites væske af patienter, som gennemgik terapeutisk paracentese blev også undersøgt. At skelne fra mulige kontaminerende non-tumorceller, som måske også til stede i ascitesvæsken såsom stromale fibroblaster, røde blodlegemer, leukocytter, etc, farvning for epitel-specifik cytokeratin (keratin 18) blev også udført siden ovariecancer er generelt menes at være epitelial karakter. Både immuno (Fig 1C venstre) og immunhistokemiske (Fig 1C højre) farvning viste, at cellerne fra ascitesvæsken udtrykt keratin 18, der foreslog de blev ekspanderet kræftceller, og mange var også meget positive for L1-CAM /CE7. Endvidere blev L1-CAM-ekspression bekræftet på positive og negative celler og væv under anvendelse af pan-specifikke L1-CAM-antistof klon UJ127.11, og ingen væsentlige forskelle i ekspression mellem CE7 epitopen og total L1-CAM blev observeret, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af ​​CE7 epitopen for L1-CAM-udtrykkende ovariecancere (data ikke vist og [12]). Tilsammen disse resultater sammen med andre vha L1-CAM detektering reagenser, der ikke var specifikt for CE7 epitopen [29, 30], validere potentialet for L1-CAM, herunder dens CE7 epitop, som et immunterapeutisk mål for ovariecancer.

CE7R

+ T

CM udstilling

in vitro

effektor aktivitet mod L1-CAM

+ æggestokkræft cellelinjer

med udgangspunkt i vores tidligere erfaringer med første generation CE7-specifikke CAR T-celler, der specifikt er rettet mod L1-CAM [12, 17, 19], udviklede vi en anden generation CAR, der indeholder den tidligere rapporterede L1-CAM /CE7-bindende scFv [19] i forbindelse med en CD28 costimulerende domæne i serie med signalering domæne af CD3ζ at øge styrken [22, 31, 32] (fig 2A). Den CAR lentiviral kassette omfattede også en T2A ribosomal springe sekvens [23] efterfulgt af en afkortet CD19 udvælgelse /sporing markør (CD19t) for at lette identifikationen af ​​succesfulde CAR-udtrykkende T-celler (Fig 2A). I nogle tilfælde blev en mutant dihidrofolate (DHFR

FS) sekvens indbefattet i samarbejde med CD19t (Fig 2A) at bibringe methotrexat (MTX) resistens og således muliggøre

in vitro

udvælgelse af transduktanter. Til disse undersøgelser, anvendt vi beriget centrale hukommelse T-celler (T

CM) (CD45RA-, CD62L +) [27], som vores gruppe har udviklet en klinisk fremstilling platform for denne hukommelse delmængde, der tidligere har vist sig at have gunstige egenskaber til terapeutisk anvendelse, herunder langsigtet vedholdenhed på adoptiv overførsel

in vivo

[18, 33, 34]. Primære humane T

CM beriget fra raske donorer, der var lentivirally transduceret til at udtrykke L1-CAM-specifikke CAR (CE7R) og ekspanderet med en cyklus af REM, blev undersøgt for CAR proteinekspression ved Western blotting (Fig 2B). Den endogene CD3ζ kæde af 16kDa blev detekteret i begge transducerede og mock-transducerede T-celler, mens den omtrentlige 66 kDa bånd, der indikerer CAR kun var til stede i CE7R-transducerede T-celler (Fig 2B). Stabil celleoverfladeekspression af CE7R (som påvist ved anti-Fc-antistof) og CD19t immunologisk markør på transducerede T

CM-afledte celler, der var blevet udvidet i nærvær af MTX blev bekræftet via flowcytometrisk analyse (fig 2C). Transduktion og udvælgelse af CAR-udtrykkende celler ikke signifikant ændrer CD4 /8-forhold sammenlignet med mock-transducerede kontroller (Fig 2C).

A, Skematisk fremstilling af anden generation CE7-specifikke CAR (øverst) og en repræsentativ lentiviral CE7R kassette (nederst), der indeholder sekvenser, der koder et immunglobulin enkelt variabelt fragment (scFv) afledt fra L1–CAM-specifikke murine CE7 monoklonalt antistof bundet gennem et humant immunglobulin (huγ

4 Fc) hængselsregionen for at den humane CD28 transmembrane og cytoplasmatiske signalsystemer domæner (huCD28 tm /CYT), og det humane CD3 ζcytoplasmic (huCD3ζ CYT) domæne efterfulgt af det ribosomale springe T2A sekvens og selektionsmarkører CD19t og dobbelte mutant DHFR (DHFR

FS). Construct ekspression drives af et EF-1α-promotoren. B, Western blots afslører både den endogene CD3ζ (intern loading kontrol) og de CE7R bands påvist med anti-humant CD3 ζ cytoplasmatiske hale-specifikt antistof. Bane 1: et kendt CAR-positive T-cellelinje (positiv kontrol), bane 2: CE7R-transducerede T

CM celler, Lane3: mock-transducerede T

CM celler. C, Flowcytometrisk analyse af overflade udtrykte Fc-holdige CE7R, CD19t, CD4, CD8 eller (grå histogram) sammenlignet med farvning med enten isotypekontroller eller SA-PE alene (åbne histogrammer). D, Cytolytisk aktivitet CE7R

+ T

CM celler mod de angivne ovariecancer cellelinje mål blev bestemt ved 4-timers

51Cr-release assay. LCL-OKT3 blev anvendt som positiv kontrol mål. Mean% chrom frigivelse ± S.D. af tredobbelte brønde er vist. E, CE7R + T

CM-celler blev co-dyrket med de indikerede tumor linjer på en 10: 1-forhold i 21 timer, og supernatanter blev analyseret for IFN-γ og TNF-α-niveauer ved cytometrisk bead array. Betyder + S.E.M. af tre eksemplarer brønde er afbildet.

Dernæst CE7R

+ T-celler blev vurderet for deres effektorfunktion på tumor antigen stimulering. Den CE7R

+ T-celler udviste robust omdirigeret cytolytisk aktivitet mod alle testede L1-CAM

+ ovariecancer cellelinjer (dvs. CAOV-3, OVCAR-3, SK-OV-3, og MADH2744), men ikke målrette L1-CAM negative æggestokkræft cellelinje, A2780, i standard 4-timers

51Cr release assays (figur 2D). Interessant, dette cytolytisk aktivitet ikke ud til at korrelere med L1-CAM /CE7 udtryk niveau, som “lav ekspressor ‘MADH2784 (Fig 1A) blev dræbt med samme effektivitet som de andre tre L1-CAM

+ æggestokkene tumor linjer. I modsætning hertil mock-transducerede parentale T-celler ikke lyserer nogen af ​​målene undtagen den humane lymfoblastoide cellelinie, der udtrykker membranbundet CD3-agonistisk antistof OKT3 (LCL-OKT3), som blev anvendt som en positiv kontrol mål at skildre den maksimale cytolytiske potentiale af T-cellerne.

In vitro

stimulation assays ligeledes vist, at CE7R

+ T-celler produceret signifikante mængder af pro-inflammatoriske cytokiner, såsom IFN-γ og TNF-α ved co-dyrkning med alle L1-CAM

+ æggestokkene tumorcellelinjer, men ikke efter stimulering med L1-CAM-negative A2780-celler (fig 2e). Cytokinrespons, i modsætning til de drabsassays, demonstrerede en vis forbindelse til L1-CAM-ekspression intensitet, hvor CAOV-3-celler inducerede den højeste og SK-OV-3 og MADH2744 inducerede de laveste cytokinniveauer. Sammen viste disse data, at CE7R-udtrykkende T-celler kan udløses til at udøve L1-CAM-specifikke effektor aktivitet

in vitro

mod mål kræft i æggestokkene linjer.

adoptivt overført CE7R

+ T

CM udviser potent

in vivo

anti-tumor aktivitet

for at undersøge anti-tumor aktivitet CE7R-udtrykkende T

CM i prækliniske musemodeller, udviklede vi en menneskelig xenograft model for intraperitoneal ovarietumor anvendelse af en SK-OV-3 cellelinie, der blev manipuleret til at udtrykke ildflue luciferase (ffLuc

+ SK-OV-3) for at muliggøre overvågning af tumorvækst i mus med bioluminescens billeddannelse. Da selv avancerede ovarietumorer stort set forbliver indesluttet i bughulen og sjældent formidle via karsystemet hos patienter, valgte vi at administrere tumorceller direkte i peritonealhulen at modellere sådan klinisk relevant intraperitoneal (i.p..) – Dissemineret ovariecancer. Inokulering af NSG mus med ffLuc

+ SK-OV-3-celler i.p. ført til udvikling af en stor primær tumor nodule og udbredelse af flere mindre nodulær tumorer til organerne inden i bughulen, omentum og mesenterium, og /eller de dyr, præsenteret med udspilede underliv fyldt med blodige ascites (op til 3 ml per mus) inden 1.5 til 2 måneder. Udvikling af peritoneal carcinomatose, formidling af tumorcellerne i hele maven, og massive ascites i denne xenograftmodel nøje efterligner kliniske situationer i æggestokkene kræftpatienter.

Primære humane T

CM celler, der blev perlen stimuleret og derefter mock-transducerede eller lentivirally transduceres til at udtrykke enten CE7R eller et ikke-relateret kontrol, CD19-specifikke CAR (CD19R), blev karakteriseret for deres fænotype forud for deres anvendelse i mus (fig 3A). Notatet både CAR sekvenser i disse undersøgelser indeholdt L235E /N297Q dobbelt mutation i deres Fc spacer, som vi har vist sig at reducere binding til opløselige FcγRs og øge

in vivo

vedholdenhed uden at ændre evne CAR at mægle målantigen-specifik lysis [20]. Samlet set mock-, CD19R-, og CE7R-transducerede T-celler var ens med hensyn til deres procentdele af CD4

+ (82-87%) og CD8

+ (10-13%) befolkninger. T celle doser givet til mus blev derefter normaliseret baseret på CAR positivitet, således at eventuelle tumorrespons forskelle ikke ville tilskrives forskelle i transduktionseffektivitet mellem T-cellelinier. Således efter bekræftelse ffLuc + SK-OV-3 tumor etablering af bioluminescens imaging, mus modtog to i.p. doser af enten 5 x 10

6 CAR

+ T-celler, mock-transducerede T-celler, eller PBS, på dag 5 og dag 12 efter tumorcelle administration. Kontrol mus (PBS, behandlet mock, eller CD19R) alle udstillet progression af i.p. æggestokkene tumorvækst, blev døende og måtte aflives inden for 2 måneder. I modsætning hertil behandling med CE7R

+ T-celler markant inhiberede tumorvækst (figur 3B og 3C). Seks måneder efter behandling med CE7R

+ T-celler, 50% (3 af 6) mus forblev i live uden tegn på lidelse, og billedbehandling på dag 119 efter tumorceller injektion viste, at to mus stadig havde kun minimal tumor signal (Fig 3B).

A, Flow cytometri af mock-, CE7R- og CD19R-transducerede T

CM celler før brug

in vivo

. Procentdele af positive celler i hver kvadrant er angivet. B, NSG mus modtog i.p. injektion af ffLuc + SK-OV-3-tumorceller på dag 0, og blev randomiseret i 4 grupper (n = 6 mus pr gruppe) for behandling med to doser af enten PBS eller mock-, CE7R- eller CD19R-transducerede T-celler i.p. (dvs. dag 5 og 12). Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. C, Kvantitativ bioluminescens billeddannelse af for hver gruppe i løbet af tiden. Middelværdi ± S.E. af de samlede flux niveauer af luciferaseaktivitet blev målt. Stiplede linjer repræsenterer dage af T-celle behandling. *, P 0.05 ved sammenligning flux værdier ved de angivne tidspunkter ved anvendelse af uparret t-test. D, Flowcytometrisk påvisning af T-celler i perifert blod 8 dage efter den anden dosis af T-celler blev administreret. Repræsentative histogrammer og procentdele af humant CD45

+ -celler (middelværdi + S.D.) er afbildet for hver gruppe af mus. *, P 0,003 når CE7R

+ T-celle-gruppen blev sammenlignet med enten den forlorne eller CD19R

+ T-celle behandlede grupper. E, Kaplan-Meier-analyse af overlevelse for hver gruppe. *, P ≤ 0,001, når CE7R

+ T-celle-behandlede gruppe blev sammenlignet med nogen anden gruppe ved hjælp af Log-ringede (Mantel-Cox) test.

Interessant, niveauer af humane T-celler (huCD45

+) i det perifere blod 8 dage efter den sidste T-celle administration (dag 20 efter tumorcelleinjektion) var lave, men konsekvent detekterbar i mock, CD19R

+ og CE7R

+ T celle- behandlede grupper (fig 3D), med det mindste beløb af huCD45

+ celler i CE7R

+ T-celle-behandlede gruppe. Vi hypotesen, at størstedelen af ​​i.p. administreret L1-CAM-specifikke CAR T-celler kan være forblevet i bughulen-hvilket er i overensstemmelse med vores observationer i andre eksperimenter, hvor CE7R

+ T-celler blev lettest påvist i peritoneale vaske (og ikke i perifert blod) af OVCAR-3 tumorbærende mus op til tre uger efter ip administration (S1 Fig). Uanset T-celle perifere persistens og /eller lokalisering, den CE7R

+ T-celle-behandlede mus udviste signifikant forbedret overlevelse (median overlevelse på 104,5 dage) i sammenligning med PBS (median overlevelse på 60 dage, p = 0,0012), mock (median overlevelse på 50 dage, P = 0,001), og CD19R (median overlevelse på 56,5 dage, p = 0,0009) behandlede kontroller (fig 3E).

Residual tumorer skrive CE7R

+ T-celle-terapi