PLoS ONE: Vaccination med embryonale stamceller Beskytter mod lungekræft: Er en bredspektret profylaktisk vaccine mod kræft Muligt

Abstrakt

antigene lighed mellem tumorer og embryoner er blevet værdsat i mange år og afspejler? ekspressionen af ​​embryonale genprodukter ved cancerceller og /eller cancer-initierende stamceller. Drage fordel af denne lighed, har vi testet en profylaktisk lungekræft vaccine bestående af allogene murine embryonale stamceller (ESC). Naive C57BL /6-mus blev vaccineret med ESC sammen med en kilde for granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) for at tilvejebringe immunstimulerende adjuvansaktivitet. Vaccinerede mus var beskyttet mod efterfølgende udfordring med implanterbare Lewis lungecarcinom (LLC). ESC-inducerede antitumorimmunitet skyldtes ikke en ikke-specifik “allo-respons” som vaccination med allogene murine embryonale fibroblaster beskyttede ikke mod tumorudvækst. Vaccine effekt var forbundet med robust tumor-reaktivt primær og hukommelse CD8

+ T-effektor reaktioner, Th1 cytokin respons, højere intratumoral CD8

+ T effektor /CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T regulerende celle-forhold, og nedsættelse af myeloide afledte suppressorceller i milten. Forebyggelse af tumorigenese viste sig at kræve en CD8-medieret cytotoksisk T-lymfocyt (CTL) -respons fordi

in vivo

depletion af CD8

+ T-lymfocytter fuldstændigt ophævede den beskyttende virkning af vaccination. Vigtigt er det, at denne strategi vaccination undertrykte også udviklingen af ​​lungecancer induceret af kombinationen af ​​kræftfremkaldende administration og kronisk lungeinflammation. Yderligere forfining af denne roman vaccine strategi og identificere fælles ESC /tumorantigener kan føre til immunterapeutiske muligheder for patienter med lungecancer og måske endnu vigtigere, kunne være et første skridt mod udviklingen af ​​profylaktiske cancervacciner.

Henvisning : Yaddanapudi K, Mitchell RA, kit K, Willer S, Sharma RK, Yan J, et al. (2012) Vaccination med embryonale stamceller Beskytter mod lungekræft: Er en bredspektret profylaktisk vaccine mod kræft muligt? PLoS ONE 7 (7): e42289. doi: 10,1371 /journal.pone.0042289

Redaktør: Lucia Gabriele, Istituto Superiore di Sanità, Italien

Modtaget: 14. marts 2012; Accepteret: 5 jul 2012; Udgivet: 31 Jul 2012

Copyright: © Yaddanapudi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH /NCRR P20RR018733 (KY), den amerikanske Lung Association (jWe, RAM) og Kentucky Lung Cancer Research Program (RAM). JWe understøttes af Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Virkningerne rapporteret her er genstand for en verserende amerikanske Letters patentansøgning, som Drs. Mitchell og Eaton er navngivet som opfindere, ansøgning nummer 60 /782.672 (US-PTO), med titlen “Metoder og udstyr til immunisering mod kræft”. Det blev indleveret den 15. marts 2007 (efter første indsendelse 15 Marts 2006). Så vidt forfatternes viden, har der ikke været nogen office handling på det, og det er stadig en ansøgning. Der er ikke andre patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

En gammel teori om onkogenese var, at kræft opstod fra reder af embryonale stamceller, der findes i normale væv og stimuleres til at vokse med en form for irritation [1]. Selv om dette begreb i vid udstrækning blev ignoreret i over et århundrede, er der nu tegn på, at muteret, vævsspecifikke stamceller fungere som selvstændige forny “kræft initierende celler”, med ansvar for indledning af mange maligniteter [2]. I indirekte støtte af denne idé, er der rigeligt med beviser, der mest solide tumortyper udtrykker embryonale antigener i varierende grad [3], [4], [5]. For eksempel de “carcinoembryonisk antigener”, først beskrevet i midten af ​​1960’erne, repræsenterer antigener deles af embryoner og tumorer i fordøjelseskanalen [6], [7]. Trods en vis succes ved hjælp af disse delte embryonale /tumorantigener som mål for immunterapi i kræftpatienter, har en vedvarende hindring for disse tilgange været, at tumor-induceret immun tolerance [8].

En alternativ immun-baserede anti kræft strategi kan være profylaktisk vaccination mod tumorantigener

før

til udseendet af kræft – og den tilhørende immun tolerance – men denne fremgangsmåde er også fyldt med problemer. Selvom vi nu har nogle effektive vacciner til cancere, som stammer fra infektiøse midler (for eksempel human papillomavirus [9]), opstår cancere fra ‘selv’ og størstedelen af ​​antigener, der vises af tumorceller er også til stede på normale voksne celler. Men nu ser det ud, at de fleste tumorer udtrykker visse embryonale antigener. Vigtigt er det, kan et udtryk for nogle embryonale antigener ende i det første eller andet trimester af graviditeten, længe før den pattedyr immunsystem bestemmer ‘selv’ versus ‘ikke-selv “. Følgelig kan genprodukter udtrykkes af både embryoer og tumorceller ikke indgå i den ‘selv’ repertoire og er derfor potentielt immunogene.

I begyndelsen af ​​det 20. århundrede blev det rapporteret, at forudgående injektion af mus med fostervæv førte til afvisning af transplanterbare tumorer (revideret i [10]). Kļaviņš

et al

senere rapporterede, at antisera rejst i kaniner mod en emulgeret hele den menneskelige embryo (6-7 uger) -. Adsorberet mod voksne humane væv – anerkendt en række menneske tumortyper herunder hud, bronchiale, nyre-, colon, lever-, lunge- og bryst [11]. Disse observationer støtter konceptet, at dyr eller mennesker immuniseret mod embryonale materiale kan være i stand til at genkende og ødelægge neoplastiske celler. Meget nylige undersøgelser beskriver potentiale ESC til at prime anti-tumor-immunitet. Disse rapporter viser, at pluripotente ESC inducerer beskedne forsinkelser i tumorvækst i musemodeller for transplanterbar coloncarcinom og lungecancer [12], [13].

Immunstimulerende cytokiner, herunder GM-CSF, interleukin (IL) -2 , IL-12 og interferon (IFN) -α har vist betydelige antitumorvirkninger. Blandt disse GM-CSF er et af de mest potente og specifikke inducere af anti-tumor-systemisk immunitet [14], [15]. GM-CSF medierer sin virkning ved at stimulere aktivering af faglige antigenpræsenterende celler (APC’er), nemlig dendritceller (DC) og makrofager. APC’erne efter tur, bearbejde og præsentere tumorantigener at advare hjælper-T-celler og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) [16], [17]. Øget lokal produktion af GM-CSF ved genetisk modificerede tumorceller kan inducere specifikke anti-tumor-cellulær immunitet både

in vitro

in vivo

[15], [17], [18], [19]. I den foreliggende undersøgelse, søgte vi at forbedre kræft immunoterapeutiske potentiale i embryonale stamceller antigene krydsreaktivitet med maligne celler i et forsøg på at identificere en mere effektiv ESC-baserede anti-cancer vaccine.

Her rapporterer vi at vaccination med ESC i kombination med en kilde for GM-CSF er effektiv til at forhindre implanterbare og carcinogent-induceret lungetumorer uden påviselig toksicitet eller tegn på autoimmunitet. Den terapeutiske effekt af vaccinen ESC /GM-CSF kombination blev associeret med robust tumor-specifikke primære og langtidshukommelse CD8

+ T effektor reaktioner, infiltration af CD8

+ T celler i tumoren, der fører til øget intratumoral CD8

+ T effektor /T regulatoriske celle ratio og nedsættelse af myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) i milten. Kollektivt, vores resultater giver en stærk begrundelse for at videreudvikle denne roman form for vaccine som et immunterapeutisk strategi til forebyggelse af kræft.

Resultater

ESC vaccination forhindrer udvækst af en implanteret lunge adenocarcinom

Vores indledende undersøgelser har forsøgt at vurdere den relative beskyttende effekt af ESC-vaccine i mangel af immunstimulerende hjælpestoffer. Immunisering af mus med bestrålet ESC alene havde ingen virkning på tidspunktet for indtræden af ​​Lewis lungekræft (LLC) tumor udvækst men gjorde resultat i et moderat fald i indledende tumor byrde i forhold til tumorer i ikke-immuniserede kontrol mus (

data ikke vist

) i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [12], [13]. For at øge virkningen af ​​ESC vaccine af GM-CSF co-administration, vi først forsøgte at over-express murine GM-CSF i ES-D3 ES cellelinie ved anvendelse retroviral transduktion som tidligere rapporteret for B16 melanom /GM-CSF-vacciner [15]. Men på grund af vanskeligheder med at opnå mærkbar GM-CSF-ekspression under anvendelse af denne fremgangsmåde – sandsynligvis på grund af retroviral promotorelement silencing i ESC [20] – vi i stedet stabilt overeksprimeret GM-CSF i STO-fibroblaster, der er almindeligt anvendt som fødelag for ES -D3 celler. Som vist i fig. 1A, mock inficeret STO fibroblaster udtrykte ubetydelig murine GM-CSF, mens GM-CSF retroviralt transducerede STO fibroblaster udtrykke og udskille overnationale fysiologiske mængder af cytokin. Ved hjælp af en standard vaccination timing regime (fig. 1B), blev naive C57BL /6 mus immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol), bestrålet ESC co-administreret med STO fibroblaster udtrykker GM-CSF (ESC /STO-GM ), eller STO-GM celler alene. Syv dage efter den sekundære immunisering blev musene udfordret med levende LLC-celler og overvåges for tumorudvækst som funktion af tiden. Som vist i fig. 1C, vaccination af mus med ESC /STO-GM var 70% effektive til at forebygge tumorudvækst henviser alle ikke-vaccinerede kontroldyr havde udviklet tydelige tumorer ved dag 24 efter udfordring. Vigtigere, bestrålede STO-GM-celler billede ingen beskyttelse mod udvæksten af ​​LLC tumorer (fig. 1C) tyder på, at den observerede beskyttelse med ESC /STO-GM ikke skyldes uspecifikke immunreaktioner mod allogene helcelle-antigener. Endelig er det vigtigt at bemærke, at disse LLC tumorer den gik udvikler i ESC /STO-GM vaccinerede mus (n = 3) var betydeligt mindre og voksede ved en meget lavere hastighed end de udvikler sig i ikke-vaccinerede kontrolmus (n = 10) (fig. 1D). Derefter bestemte vi, hvis vores strategi vaccination giver beskyttelse mod udvækst af andre C57BL /6-afledte tumorer. Til den ende, vi udfordrede ESC /STO-GM vaccineret mus med syngene B16F0 melanom celle-linje, som stammede fra C57BL /6 mus og overvåget tumorvækst over tid. Som vist i figur S2, ESC /STO-GM-vaccination effektivt reduceret størrelsen af ​​melanom tumorer og også forårsaget en væsentlig forsinkelse i tumor outgrowh i forhold til at styre, ikke-vaccinerede mus.

(A) søjlediagram, som viser GM-CSF-ekspression i ikke-transducerede og retroviralt transducerede STO fibroblaster. Fejl- søjler repræsenterer middelværdi ± SD. *, P 0,05; i forhold til ikke-transducerede STO-celler;

t

test. (B) Ordning af immunisering. C57BL /6-mus blev immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol), eller bestrålet 1 × 10

6 ESC + bestrålet 1 × 10

6 GM-CSF-udtrykkende STO murine embryonale fibroblaster (STO * g) sc i den højre flanke. Syv dage efter boost blev mus udfordret med 1 × 10

5 Lewis lungecarcinomceller (LLC) s.c. i den venstre flanke. (C) C57BL /6-mus (10 /gruppe) blev immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol), eller bestrålet 1 × 10

6 ESC + bestrålet 1 × 10

6 STO-GM, eller bestrålet 1 × 10

6 STO-GM celler alene sc i den højre flanke før s.c. udfordring med LLC på dag 21. Tumorvækst blev overvåget dagligt i alle dyr indtil aflivning på grund af tumorer over 5% af kropsvægten. Den vaccinerede tumor fri mus forblev så i op til 4 måneder senere uden åbenlyse tegn på angst eller autoimmunitet. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. **,

s

0,001; i forhold til kontrol-gruppe; log-rank test. (D). Tumorvækst blev målt ved calipre hver 2. eller 3. dag og tumorvolumener blev afbildet som angivet. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige tumor mængder af 10 mus /kontrolgruppe og 3 mus /ESC /STO-GM-koncernen og er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SEM.

ESC vaccination fremkalder tumorcelle-specifik CD8-afhængige cytotoksiske T-lymfocyt respons

Mest succesfulde cancer immunoterapi kræver en robust CD8-afhængige CTL-respons [21 ], [22]. For at undersøge om ESC /STO-GM-vaccination fremkalder CD8 svar, splenocytter fra ESC /STO-GM vaccinerede og ikke-vaccinerede (kontrol) mus blev vurderet for

in vitro

tumor celledræbende ti dage efter immunisering. Resultaterne indikerer tilstedeværelsen af ​​et CTL-respons efter ESC /STO-GM vaccination (fig. 2A). Vigtigere er det, denne drab er specifik for tumorceller (og ESC) i, at der ikke cytotoksicitet blev observeret mod primær voksne murine lungefibroblaster eller STO fibroblaster (

data ikke vist

). Vi undersøgte yderligere fænotypiske markører på CD8

+ splenocytter fra ESC /STO-GM vaccineret og kontrol mus. Granzyme B er en cytolytisk molekyle typisk udtrykt af effektor, men ikke naive eller hukommelse, CD8

+ splenocytter [23], [24]. Splenocytter blev opnået fra ikke-vaccinerede /tumor udfordret (kontrolgruppe), vaccineret /tumor udfordret og vaccinerede /ikke-tumor udfordrede mus og farves direkte

ex vivo

uden restimulering. Som vist i fig. 2B, kun en meget lille brøkdel af CD8

+ splenocytter isoleret fra ikke-immuniserede kontrolmus udtrykte granzym B, mens 25,6% af CD8

+ splenocytter fra vaccinerede /tumor udfordret mus udtrykte denne CTL effektor (n = 6 /gruppe;

t

test,

s

0,05; i forhold til kontrolgruppen, fig 2B, D).. Desuden ingen forskel i procentdele af CD8

+ granzymeB

+ celler blev observeret i splenocytter isoleret fra vaccinerede mus, der ikke blev udfordret med LLC-celler i sammenligning med vaccinerede /tumor udfordret mus (fig. 2C), hvilket giver yderligere beviser at den øgede granzym B respons vi observerer i vaccinerede /tumor udfordret mus er specifik for kræftcellerne. Som en yderligere test af betydningen af ​​CD8-afhængige CTL-medieret antitumorvirkninger, CD4

+ eller CD8

+ T-lymfocytter blev depleteret

in vivo

anvendelse af anti-CD4 eller anti-CD8 monoklonale antistoffer [25]. Henviser mus depleteret for CD4

+ lymfocytter blev i det mindste delvist beskyttet mod udvækst af LLC, CD8

+ T-celle depletion fuldstændigt ophævede den beskyttende virkning af ESC /STO-GM vaccination (tabel 1).

(A) C57BL /6-mus (5 /gruppe) blev immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol) eller bestrålet 1 × 10

6 ESC + bestrålet 1 × 10

6 STO-GM celler sc i den højre flanke. Ti dage efter boost blev musene aflivet, og miltene blev fjernet. Splenocytter fra vaccinerede mus og kontrolmus blev tilsat til brøndene pre-podet med LLC-celler og co-dyrket i yderligere 16 timer med de indikerede effektor-til-mål-celle-forhold, med tab af sidstnævnte overvåges i en Acea elektrisk impedans-læser. De viste resultater repræsenterer fire uafhængige brønde for hver effektor-til-mål-forhold og fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SD. (B-D) C57BL /6-mus blev immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol) eller bestrålet 1 × 10

6 ESC + bestrålet 1 × 10

6 STO-GM-celler s.c. i den højre flanke. Syv dage efter den sidste immunisering blev mus udfordret med 1 × 10

5 LLC-celler s.c. i den venstre flanke. 18-21 dage efter tumor blev musene aflivet, og miltene blev fjernet. Derudover blev et sæt af mus vaccineret med ESC /STO-GM alene og ikke udfordret med tumor. Splenocytter fra vaccinerede /tumor udfordret, vaccinerede /ikke-tumor udfordret og kontrolmus blev vasket, blev Fc-receptorer blokerede, og farvet for overfladeekspression af CD8 og intracellulær ekspression af Granzyme B og analyseret ved flowcytometri. (B, D) Procentdel af CD8

+ celler, der udtrykker granzym B i splenocyter opnået fra vaccinerede /tumor udfordret og kontrol mus (6 /gruppe). (C) Procent af CD8

+ celler, der udtrykker granzym B i splenocyter opnået fra vaccinerede /ikke-tumor udfordrede mus (6 /gruppe). Resultaterne er udtrykt i procent af gated CD8

+ splenocytter (*, p 0,05; i forhold til kontrolgruppen,

t

test). Fejllinjer repræsenterer gennemsnit ± SD.

ESC vaccination inducerer tumorceller-specifikke, Th1-medieret cytokin respons i CD8

+ T-celler

Vi næste bestemmende for evne CD8

+ T-celler fra vaccinerede mus for at producere effektor cytokiner nødvendige for en effektiv anti-tumoral cytolytisk aktivitet. Som reaktion på re-stimulation med LLC cellelysat, en signifikant højere frekvens af IFN-γ, TNF-α og IL-2-producerende CD8

+ splenocytter blev opnået fra ESC /STO-GM vaccinerede mus sammenlignet med den ikke vaccinerede kontrolgruppe (n = 6 /gruppe; ANOVA,

s

0,05; i forhold til kontrolgruppen,. figur 3A-D). I fravær af LLC restimulering, blev ingen stigning i cytokinproduktion observeret i CD8

+ splenocytter fra vaccinerede mus sammenlignet med ikke-stimulerede, kontrol-ikke-vaccinerede mus (fig. 3E, F). Ved analyse af de uafhængige bidrag ESC og STO-GM immuniseringer til CD8

+ T-celle-effektorfunktioner, vi observeret, at ESC alene eller STO-GM-behandlinger alene inducerede ikke en væsentlig stigning i de procentdele af milt CD8

+ TNF-α

+ og CD8

+ IFNy

+ -celler i sammenligning med kontrol ikke-vaccinerede mus (fig. 3C). At afgøre, om ESC /STO-GM vaccinerede mus inducerede lignende CD8

+ T-effektor svar til andre C57BL /6 afledte tumorceller, vi udførte

in vitro

cytokin analyse med lysater afledt B16F0 melanomaceller. Som forventet som respons på fornyet stimulering med B16 cellelysat, observerede vi en signifikant stigning i hyppigheden af ​​IFN-γ og TNF-α producerende CD8

+ splenocytter fra ESC /STO-GM vaccinerede mus sammenlignet med restimuleret splenocyt kulturer opnået fra ikke-vaccinerede kontrolgruppe (Figur S2).

C57BL /6 mus (6 /gruppe) blev immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol) eller bestrålet 1 × 10

6 ESC alene, eller bestrålet 1 × 10

6 ESC + bestrålet 1 × 10

6 STO-GM, eller bestrålet 1 × 10

6 STO-GM celler alene, sc i den højre flanke. Ti dage efter injektionen blev musene aflivet, og miltene blev fjernet. Splenocytter fra vaccinerede mus og kontrolmus blev co-dyrket med LLC lysat (50 ug /ml) i yderligere 4 dage. Effektorer blev høstet og stimuleret i 4 timer med PMA (50 ng /ml) og ionomycin (500 ng /ml) i nærvær af Brefeldin A (1 pl /ml). Efter restimulering blev effektorer høstet, Fc-receptorer blev blokeret, og farvet for overfladeekspression af CD4, CD8 og intracellulær ekspression af cytokiner og analyseret ved flowcytometri. (A, B) Dot plots viser TNF-α og IFN-γ-ekspression i CD8

+ -celler i splenocytkulturer opnået fra kontrol- og ESC /STO-GM vaccinerede mus. Tal i kvadranter repræsenterer de procentdele af hver delpopulation. (C, D) Bar grafer, der viser procentdele af CD8

+ TNF-α

+, CD8

+ IFN-γ

+, og CD8

+ IL2

+ -celler i splenocyt kulturer afledt af kontrol, ESC alene, STO-GM alene og ESC /STO-GM vaccinerede mus. Resultater udtrykkes som procentdele af totale celler. *, P 0,05; i forhold til kontrol-gruppe; ANOVA. (E, F) Ikke-stimulerede miltceller fra vaccinerede mus og kontrolmus blev direkte behandlet med PMA /ionomycin /Brefeldin A og farvet for intracellulært cytokinekspression. To uafhængige cellekultur-assays blev udført med celler isoleret fra 6 mus pr gruppe; data fra et repræsentativt assay er vist. Fejllinjer repræsenterer gennemsnit ± SD.

ESC vaccination reducerer myeloide afledte suppressor celler, men ændrer ikke T regulatoriske celler i milten

For yderligere at undersøge de immunmodulerende effekter af ESC /STO * g vaccination, analyserede vi fænotypen af ​​splenocytter ved flowcytometri. Det er blevet påvist, at CD11

+ GR1

+ myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) og CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T regulatoriske celler (T

ReGS) er de to suppressor befolkninger, som hindrer den anti-tumor effektor reaktioner i milten [26], [27]. Vi fandt, at andelen af ​​MDSCs blev signifikant reduceret fra 33,8% til 9,8% i miltene fra mus vaccineret med ESC /STO-GM og udfordret med LLC-celler sammenlignet med ikke-vaccinerede, LLC udfordrede kontrol mus (n = 5 /gruppe

t

test,

s

0,05; i forhold til kontrolgruppen,. figur 4A, B). ESC /STO-GM-vaccination, dog ikke reducere procentdele af milt T

Fo (fig. 4C) eller inducere en ændring i forholdet mellem CD8

+ T-celler til T

regs i milten (fig. 4D). Desuden har vi ikke observere nogen signifikante forskelle i procentdele af CD4

+ og CD8

+ T-celler (fig. 4E) eller i deres absolutte tal (

ikke vist

) i milt fra vaccinerede mus og kontrolmus.

C57BL /6-mus blev immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol) eller bestrålet 1 × 10

6 ESC + bestrålet 1 × 10

6 STO- GM celler sc i den højre flanke. Syv dage efter den sidste immunisering blev mus udfordret med 1 × 10

5 LLC-celler s.c. i den venstre flanke. 18-21 dage efter tumor blev musene aflivet, og miltene blev fjernet. Splenocytter fra vaccinerede mus og kontrolmus blev vasket, Fc-receptorer blev blokeret, og farvet for overfladeekspression af forskellige markører og analyseret ved flowcytometri. (A) Dot plots viser procentdele af milt CD11b

+ GR1

+ myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) i kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus. Tal i kvadranter repræsenterer de procentdele af hver delpopulation. (B) Bar grafer viser procentdele af CD11

+ GR1

+ MDSCs i splenocytter opnået fra kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus. Resultater udtrykkes som procentdele af totale celler. *, P 0,05; i forhold til kontrol-gruppe;

t

test. (C) Bar grafer viser procentdele af CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T regulerende celler (T

reg) i splenocytter opnået fra kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus. Resultater udtrykkes som procentdele af totale celler. (D) Forholdet mellem CD8

+ Foxp3

– til CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

reg celler blev beregnet og sammenlignet i splenocytter fremstillet af kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus. (E) Bar graf, der viser procentdele af CD4

+ T og CD8

+ T-celler i splenocyter opnået fra kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus. Resultater udtrykkes som procentdele af totale celler. Tre uafhængige analyser blev udført med celler isoleret fra 5 mus pr gruppe; data fra et repræsentativt assay er vist. Fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SD.

ESC vaccination øger forholdet af CD8

+ T-effektorceller til T

regs i tumoren

Vores resultater viser, at ESC /STO-GM-induceret anti-tumor effektorfunktion overvejende medieret af CD8

+ T-celler. Vi studerede dermed virkningerne af denne vaccine regime på funktionen af ​​intratumoral CD8

+ celler og deres interaktion med T

regs. Ved anvendelse af et lille antal ESC /STO-GM vaccinerede mus, der gjorde udvikle LLC læsioner – (. Figur 1C, D) omend på en forsinket måde, tumorer fra kontroller og vaccinerede mus blev høstet og anvendt til at undersøge den delmængde profiler af tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL’er). Flowcytometrisk analyser af CD45,2

+ TIL’er afslørede et fald i andelen af ​​CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

regs i tumor infiltrerer fra vaccinerede mus

versus

kontroller (fig. 5A). Selvom vi stadig observeret forekomsten af ​​T

regs i disse tumorer, forholdet mellem CD8

+ T-celler til T

regs blev øget betydeligt i tumoren infiltrerer fra ESC /STO-GM vaccinerede mus (n = 3 /gruppe;

t

test,

s

0,05; i forhold til kontrolgruppen,. figur 5B, C). At vurdere kvaliteten af ​​CD8

+ T-celle tumor infiltrerer følgende ESC /STO-GM vaccination, analyserede vi ekspressionen af ​​aktiveringen markør CD25 og effektor cytokin IFN-γ. CD8

+ -celler i ESC /STO-GM tumor infiltrater havde forhøjede CD25-ekspression og var i stand til at producere større mængder af IFN-γ som respons på fornyet stimulering med PMA /ionomycin (n = 3 /gruppe;

t

test,

s

0,05; i forhold til kontrolgruppen,. figur 5D, E). Således ESC og STO-GM kombination vaccine øger forholdet mellem CD8

+ T-celler til T

regs og procentdele af CD8

+ CD25

+ og CD8

+ IFN betydeligt γ

+ effektorceller inden tumorerne og er tyder på effektiv vaccine-induceret, tumor-reaktive immunsystem priming.

C57BL /6-mus blev immuniseret to gange (dag 0 og 14) med HBSS (kontrol) eller bestrålet 1 × 10

6 ESC + bestrålet 1 × 10

6 STO-GM celler sc i den højre flanke. Syv dage efter boost blev mus udfordret med 1 × 10

5 Lewis lunge carcinomaceller s.c. i den venstre flanke. 18-21 dage efter tumorbelastning blev tumorinfiltrerende celler høstet fra kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus og analyseret ved flowcytometri. (A) Histogrammer viser procentdele af CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

regs i CD45,2

+ tumorinfiltrerende celler opnået fra kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus . (B) Dot plots, der viser de procentdele af CD8

+ og Foxp3

+ subpopulationer i CD45,2

+ tumor infiltrerende celler. (C) Søjlediagram der viser forholdet mellem CD8

+ Foxp3

– til CD8

-Foxp3

+ -celler i 1 af 2 repræsentative eksperimenter med 3 uafhængigt analyserede mus /gruppe. *, P 0,05; i forhold til kontrol-gruppe;

t

test. (D, E) ESC vaccination øger hyppigheden af ​​funktionelle CD8

+ T-celler i tumorer. (D) Bar graf, der viser de procentdele af CD25

+ CD8

+ i CD45,2

+ tumorinfiltrerende celler opnået fra kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus. (E) tumorinfiltrerende celler blev restimuleret med PMA og ionomycin og analyseret for ekspressionen af ​​intracellulær IFN-γ. Bar grafer, der viser procentdele af CD8

+ IFN-γ

+ i tumor infiltrerer celler fra kontrol og ESC /STO-GM vaccinerede mus. Resultater udtrykkes som procentdele af totale celler. Dataene repræsenterer resultater fra 2 uafhængige eksperimenter med 3 mus /gruppe. *, P 0,05; i forhold til kontrol-gruppe;

t

test. Fejllinjer repræsenterer gennemsnit ± SD.

ESC vaccination-induceret CD8

+ T-celle-medierede effektor reaktioner holdes i langsigtet overlevende dyr

Vi næste testet effekten af vores ESC vaccinationsstrategi i opretholdelsen af ​​CD8

+ T-celle-hukommelse pulje og generering af sekundære responser anvendelse af mus, der var blevet succesfuldt vaccineret /beskyttet 60 dage tidligere. Controls inkluderet naive, ikke-vaccinerede mus, som blev udfordret med LLC-celler. 80% af musene som tidligere er vaccineret med ESC /STO-GM havde ikke udviklet tumorer 90 dage efter tumor re-inokulering, medens 0% af aldersmatchede kontroller forblev tumorfri (n = 10 /gruppe; log-rank test,

p

0,001; i forhold til naive kontrolgruppe;. figur 6A). Vigtigere, vaccinerede dyr med udryddet LLC tumorer bibeholdt langsigtet immunologisk hukommelse som bestemt ved forøget produktion af IFN-y af milt-CD8

+ -celler (n = 4 mus /gruppe;

t

test,

s

0,05; i forhold til naive kontrolgruppe;. figur 6B). Endvidere har vi observeret en signifikant stigning i milt CD8

+ CD44

hi hukommelsesceller i langfristede vaccinerede mus genbehandles med LLC-tumorceller sammenlignet med naive tumor udfordrede mus. (N = 4 mus /gruppe;

t

test,

s

0,05; i forhold til naive kontrolgruppe;. Figur 6C, D).

Langsigtet overlevende mus fra ESC /STO-GM-koncernen blev re-udfordret fm med 1 × 10

5 LLC celler 60 dage efter indledende tumor podning. (A) Tumorvækst blev overvåget dagligt i alle dyr indtil aflivning på grund af tumorer over 5% af kropsvægten. Resultaterne repræsenterer en summation af to uafhængige forsøg med 10 mus /gruppe. **, P 0,001; forhold til naive kontrol; log-rank test. (B-D) Milte blev isoleret fra vaccinerede overlevende og styre naive mus 10 dage efter tumorinjektion. (B) Splenocytter blev høstet og stimuleret i 4 timer med PMA (50 ng /ml) og ionomycin (500 ng /ml) i nærvær af Brefeldin A (1 pl /ml). Efter restimulering blev celler høstet, Fc-receptorer blev blokeret og farvet til intracellulær ekspression af cytokiner, og analyseret ved flowcytometri. Bar grafer, der viser procentdelen af ​​intracellulær IFN-γ-ekspression i CD8

+ celler (*,

s

0,05; i forhold til naive kontrol

t

test). Resultater udtrykkes som procentdele af totale celler. (C) Dot plots viser procentdele af CD44

+ og CD8

+ celler i splenocytter afledt langsigtet overlevende ESC vaccineret og styre naive mus. Tal i kvadranter repræsenterer procentdele af hver delpopulation. (D) Bar graf, der viser de procentdele af CD44

+ CD8

+ celler (*,

s

0,05; i forhold til naive kontrol

t

test). Resultater udtrykkes som procentdele af totale celler. Data for B-D er repræsentative for to uafhængige forsøg med 4 mus /gruppe. Fejllinjer repræsenterer gennemsnit ± SD.

ESC vaccination undertrykker 3-methylcholanthren initieret, butylhydroxytoluen forfremmet lunge carcinogenese

Forebyggelse af udvækst af implanterbare lungetumorer bruger denne strategi vaccination ikke forudsige effekt i

in vivo

pulmonal tumorigenese. For at teste denne, udnyttede vi en musemodel involverer carcinogenindgivelse efterfulgt af kronisk lungeinflammation som menes at efterligne rygning-associeret lunge carcinogenese [28]. Balb /c-mus blev udsat for en bolus af 3-methylcholanthren (eksperimentel uge 1) og gentagne administration af butylhydroxytoluen (BHT; uger 3-8). Disse dyr blev derefter vaccineret (uge 4, 6 og 8) med enten HBSS alene eller ESC /STO-GM. I denne model, flere lungetumorer forudsigeligt dannes inden for fire til seks måneder efter indledningen. 18 uger efter den første dosis af 3-methylcholanthren blev lunger høstet og fikseret. Indledende brutto undersøgelse af lungerne viste, at kontrol- vaccineret muselunger alle havde overflade tumorer med et gennemsnit på 1,6 store læsioner pr mus (fig. 7A). I modsætning hertil kun 1/8 mus vaccineret med ESC /STO-GM havde en synlig overflade tumor giver et gennemsnit på -0,2 lungetumorer /mus (n = 8;

t

test,

p

0,05; i forhold til kontrolgruppen,. figur 7A). Total lungetumor masse blev yderligere evalueret i 3 dyr i hver gruppe ved undersøgelse af serielle sektioner af lungerne. Som vist i fig.