PLoS ONE: Overekspression af Periostin i Stroma positivt associeret med Aggressive Prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Periostin er en vigtig ekstracellulær matrix protein involveret i celle udvikling og vedhæftning. Tidligere vi identificeret periostin at være opreguleret i aggressiv prostatakræft (CaP) ved hjælp af kvantitative glycoproteomics og massespektrometri. Ekspressionen af ​​periostin blev yderligere evalueret i primære radikal prostatektomi (RP) prostatatumorer og tilstødende ikke-tumor-prostatavæv under anvendelse af immunhistokemi (IHC). Vores IHC Resultaterne viste en lav baggrund periostin niveauer i de tilstødende ikke-tumorform prostata væv, men overudtrykt periostin niveauer i peritumoral stroma af primære CaP tumorer.

Metoder

I denne undersøgelse periostin udtryk i CaP blev undersøgt yderligere på flere væv microarrays (TMAS), som blev gennemført i fire laboratorier. For at opnå ensartet farvning blev alle TMA’er farvet med samme protokol og scoret af samme billede beregning redskab til at bestemme de samlede farvningsintensiteter periostin. TMA’erne blev yderligere scoret af patologer til at karakterisere det stromale farvning og epithelial-farvning.

Resultater Salg

periostin farvning blev observeret hovedsagelig i peritumorale stromale celler og i nogle tilfælde i tumor epitelceller selvom stærkere farvning blev fundet i peritumorale stromaceller. Både periostin stroma farvning og epitelial farvning kan differentiere BPH fra CaP herunder lav kvalitet CaP (Gleason score ≤6), med betydelig p-værdi på 2.2E-16 og 0,001 henholdsvis. Periostin epitelial farvning differentieret PIN-kode fra lav kvalitet CaP (Gleason score ≤6) (p = 0,001), mens periostin stromale farvning differentieret lav kvalitet Cap (Gleason score ≤6) af høj kvalitet Cap (Gleason score ≤6) (p = 1.7e -05). Derudover blev en positiv korrelation mellem total periostin farvning og Gleason score observeret (r = 0,87, p = 0,002).

Konklusioner

Resultaterne viste, at periostin farvning var positivt korreleret med stigende Gleason score og aggressivitet prostata sygdom

Henvisning:. Tian Y, Choi CH, Li QK, Rahmatpanah FB, Chen X, Kim SR, et al. (2015) Overekspression af Periostin i Stroma positivt associeret med Aggressive prostatakræft. PLoS ONE 10 (3): e0121502. doi: 10,1371 /journal.pone.0121502

Academic Redaktør: Varda Rotter, Weizmann Institute of Science, ISRAEL

Modtaget: Oktober 3, 2014 Accepteret: 1. februar, 2015; Udgivet: 17 Marts 2015

Copyright: © 2015 Tian et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health, National Cancer Institute, Early Detection Research Network (EDRN, U01CA152813) til HZ og tidlig påvisning Research Network NCI CA86366 til DC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i vores tidligere forsøg på at identificere protein ændringer mellem aggressiv og ikke-aggressiv prostatakræft (CAP), vores gruppe analyserede glycopeptider isoleret fra aggressive og ikke-aggressive prostata tumorer ved kvantitative glycoproteomics hjælp iTRAQ mærkning af glycosite-holdige peptider og tandem massespektrometri [1]. Vi identificerede overekspressionen af ​​tre glycoproteiner i aggressive CaP-væv sammenlignet med ikke-aggressive CaP-væv. To proteiner, cathepsin L og periostin, er ekstracellulære matrix (ECM) proteiner. Cathepsin L fungerer som en endopeptidase, der kan nedbryde mange intracellulære og ekstracellulære proteiner til at ændre deres funktion. Det andet protein, periostin, blev yderligere bekræftet ved hjælp af immunblotting og immunhistokemi (IHC) analyser [1]. Derfor er vores observationer støtter en vigtig rolle for tumor mikromiljø i CaP progression.

Periostin, også kendt som osteoblast-specifik faktor 2 (OSF-2), er en evolutionært bevaret ECM protein og et medlem af fasciclin familie [2]. Det er blevet vist, at periostin interagerer med andre ECM-proteiner, såsom fibronectin, collagen V, og tenascin-C. Periostin interagerer også med forskellige celleoverfladereceptorer, især integriner, og signaler hovedsagelig via PI3-K /Akt og andre veje til at fremme cellevækst, celleoverlevelse, epithelial-mesenchymal overgang (EMT), invasion, tumor angiogenese og metastase [ ,,,0],2-5]. Nylige undersøgelser har vist, at periostin er involveret i udviklingen af ​​forskellige tumorer, såsom bryst-, tyktarms-, lunge-, ovariecancer, og prostatakræft [6-11].

I denne undersøgelse, vi sigter mod at verificere korrelation af periostin udtryk og CaP aggressivitet. IHC under anvendelse periostin specifikt antistof blev udført for at vurdere ni TMA’er fra flere laboratorier, som består af i alt 3048 radial prostatektomi (RP) kerner. For at opnå ensartet farvning blev protokoller og reagenser enten sendt til samarbejdspartner laboratorier eller TMA’er blev sendt til vores laboratorium for TMA farvning. For at eliminere scoring variation fra individuelle laboratorier, blev alle farves TMA’er scannet ved hjælp af samme scanner med de samme indstillinger, og de scannede billeder blev scoret af samme billede beregning redskab til at bestemme de samlede farvningsintensiteter periostin. Den TMA’er blev yderligere scoret af patologer til at karakterisere det stromale farvning og epitelial farvning.

Materialer og metoder

Materialer

Kanin antihumane periostin antistof var fra Abcam (ab14041, Cambridge, UK); LSAB + System-AP kit fra Dako (Carpinteria, CA); og alle andre kemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Tissue microarray (TMA’er)

TMA’er fra University of California Los Angeles (UCLA).

Tre TMAs består af 197 kerner af ikke-tumorøse prostata (NT), 140 kerner af benign prostatahyperplasi (BPH), 64 kerner af prostata intraepitelialneoplasi (PIN), og 963 kerner af prostata-adenocarcinom fra 246 tilfælde (3 kerner på gennemsnit for hvert tilfælde) blev rapporteret tidligere [12, 13]. NT blev defineret som tilstødende ikke-kræft prostata væv.

TMA’er fra University of California i Irvine (UCI).

Tissue Microarray (TMA) på 480 kerner består af 199 tumor sager (med mere end 10 års opfølgning), 108 parrede kerner af prostata intraepithelial neoplasier (PIN), 7 parrede kerner af stroma, 3 kerner af BPH, og 86 kerner af kalibratorer og cellelinier som tidligere rapporteret [14, 15].

TMA’er fra Johns Hopkins University (JHU) (Bob Veltri laboratorium).

To prostata adenocarcinom væv microarrays (0,6 mm i diameter, 6 kerner per sag) benævnt TMA 681-682, blev skabt under en Cevc EDRN tilskud (PI Alan W. Partin) bygget på Johns Hopkins University afdeling af patologi ved hjælp kirurgiske RP resektion prøver hentet fra patologisk institut arkiver. Hver af to TMA lysbilleder repræsenterer 40 tilfælde af CaP (4 cores per tilfælde) og tumor-matchede ikke-kræft prostata væv (4 kerner per sag). De formalinfikserede og paraffinindlejrede prostata tumorer og tumor-matchede ikke-kræft væv til TMA 681-682 blev opnået på grundlag af ansøgning til Patologisk Institut ved Johns Hopkins Hospital gennem prostatakræft Biorepository Network (PCBN). Brugen af ​​TMA’er herunder TMA’er 681-682 for at studere biomarkører blev godkendt af Johns Hopkins University IRB (Institutional Review Board) for prostatakræft.

TMA fra Johns Hopkins University (JHU) (Hui Zhang laboratorium).

hætten væv microarray (0,6 mm i diameter, 6 kerner per sag) blev bygget på Johns Hopkins University ved hjælp af kirurgiske RP resektion prøver hentet fra afdelingen for patologi arkiv på Johns Hopkins Hospital. Brugen af ​​kliniske oplysninger og tumorvæv blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) på Johns Hopkins University. Repræsenteret på TMA var 60 tilfælde af prostata adenocarcinomer (4 cores per tilfælde) og tumor-matchede ikke-kræft prostata væv (2 kerner per sag). Desuden blev 60 tilfælde af manglende prostata ikke-kræft kontrol væv inkluderet på mikroarrayet, der består af normal nyre, mave, tyndtarm, colon, lever, bugspytkirtel, endometrium, hjerne og lymfeknude.

Immunhistokemi (IHC)

TMAs blev bagt ved 60 ° C i 1 time, deparaffineret og rehydreret. TMA’erne blev inkuberet med 5% BSA /PBS ved stuetemperatur i 45 minutter, og derefter inkuberet med 3% H

2O

2 ved stuetemperatur i 15 minutter før påføring primære antistof. Kanin antihuman periostin (Abcam, ab14041) blev anvendt i en fortynding på 1:. 4000 til farvning TMAs og blev påvist under anvendelse af Dako LSAB + System AP kit ifølge producentens instruktioner

For at analysere det samlede periostin farvning, den positive pixel count (PPC, v11) algoritme (Aperio Billede Anvendelsesområde) blev påført på individuelle kerner fra 9 TMAs at beregne den gennemsnitlige pixelintensitet (i en kolorimetrisk kanal, der svarer til den brune IHC bundfald) af alle pixler inden for hver annotation region. Kort fortalt vi brugte PPC input parametre, der er misligholdt til brun farve kvantificering og derefter kørte algoritmen. En pseudo-farve “mark-up” billede blev genereret som en algoritme resultat, der bekræfter, at nærmere angivne input målt den ønskede farve og intensitet intervaller. Positiv plet farveintensiteten blev klassificeret i tre farvekodede områder: 1) intensitet svagt positiv (IWP) = gul, 2) intensitet positiv (lp) = orange, og 3) intensitet stærk positiv (ISP) = rød. Procentdel af farvning blev beregnet som samlede antal positive pixels divideret med det samlede antal pixels og korreleret med Gleason score.

Immunfarvning blev også evalueret blindt ved Johns Hopkins Hospital (JHH) patologer at karakterisere stromale og epitelial farvning lokalisering. TMA blev scoret semi-kvantitativt ved hjælp af et fire enstrengede system baseret på intensiteten og distribution: 0, målbart; 1+, svag farvning; 2+, medium farvning, 3+, stærk farvning. Alle TMA’er blev scannet ved 20X og IHC billeder blev fotograferet ved hjælp af Aperio billede Scope (v11.2.0.780).

Statistisk analyse

Wilcoxon signed rank orden test (parret, to-sidet) blev udført for periostin farvning i peritumoral stroma og ikke-tumorøse stroma, som blev scoret af patologer. Forskellen på periostin farvning i enten stroma eller epitelceller blandt forskellige betingelser for prostata sygdom blev vurderet til individuel score ved hjælp Chi-squared test. Pearson korrelationskoefficienten test blev anvendt til at analysere sammenhængen af ​​Gleason score og positivitet af samlede periostin farvning herunder både stromal og epitelial cellefarvning fra beregningsmæssige scoring.

P

-værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Før glycoproteomics analyse af aggressive og ikke-aggressive CaP væv viste, at periostin blev øget betydeligt i aggressiv prostata tumorer [1]. Den oprindelige opdagelse blev kontrolleres ved hjælp af IHC [1]. Denne undersøgelse har til formål at kontrollere, at periostin overekspression i PCa ved hjælp af store prøvesæt fra multi-laboratorier og universelle Lagring metoder. Den TMA’er omfatter en fra Hui Zhang lab (JHU), der består af 360 kerner (60 tilfælde), to fra Bob Veltri Brady Urologisk Institute lab (JHU) bestående af 640 kerner (80 tilfælde), tre fra David Chia lab (UCLA) bestående 1364 kerner (246 tilfælde), og tre fra Dan Mercola lab (UCI), der består 684 kerner (199 sager).

for at eliminere læse variation fra individuelle laboratorier, alle farves TMA’er blev scannet på Johns Hopkins University ved hjælp af Aperio billedbehandling systemet, og 20x scannede billeder blev analyseret under anvendelse af de samme beregningsmetoder værktøjer til at bestemme den samlede farvningsintensitet for hver kerne. Vi yderligere valideret TMA fortolkning af JHH patologer for alle TMA’er at adskille det stromale farvning og epitelial farvning. De patologer ‘aflæsninger brugte en fire enstrengede system baseret på intensiteten og distribution: 0, målbart; 1+, svag farvning; 2+, medium farvning, 3+, stærk farvning (fig. 1A). I overensstemmelse med vores tidligere observationer blev periostin farvning observeret hovedsagelig i peritumorale stromale celler og i nogle tilfælde i tumor epitelceller selvom stærkere farvning blev fundet i peritumorale stromale celler (Fig. 1A). Den statistiske analyse blev derefter udført for at svare på følgende spørgsmål: 1) hvorvidt periostin udtryk kan differentiere prostata væv, herunder prostatakræft, ikke-tumor områder af prostata væv, BPH, og PIN; 2) om periostin udtryk er korreleret med kliniske variabler, såsom Gleason score

(A) patologer ‘kriterier for IHC scoring (a) 0, målbart..; (B) 1+, svag farvning; (C) 2+, medium farvning; (D) 3+, stærk farvning. Periostin blev hovedsageligt farvet i peritumoral stroma. (B) Box afbildninger af positivitet af periostin samlede farvning i patient-matchede prostata adenocarcinom og ikke-tumorform prostata væv. (C) Fordeling af ændringerne i IHC score mellem peritumoral stroma og stroma fra ikke-tumor områder (NT). På x-aksen-1: IHC score i NT er højere end i den parrede kræft ved 1; 0: IHC scoringer er de samme for den parrede NT og kræft; 1: IHC score i NT er lavere end i den parrede kræft ved 1; 2: NT lavere end kræft ved 2; 3: NT lavere end kræft ved 3. Højden af ​​bjælkerne (y-akse) er antallet af patienter. Summen højde på røde bjælker er meget større end den grønne bar, hvilket indikerer, at IHC scores blandt de peritumorale stromale celler er meget højere end de tilsvarende normale stromale celler.

For at afgøre, om et udtryk for periostin kunne differentiere CaP fra ikke-tumor områder af prostata væv, blev statistiske analyser udført for tre TMA’er fra JHU fordi disse TMA’er består af både prostata tumorer og patient-matchede ikke-tumorform prostata væv. Periostin samlede farvning og stromal farvning blev analyseret hhv. Den periostin samlede farvning blev forøget i prostata tumor med Gleason score 6 og op sammenlignet med parrede ikke-tumor-prostatavæv (fig. 1B). Siden periostin hovedsageligt blev farvet i stroma blev histogram analyse anvendt til at analysere ændringerne i IHC scores mellem periostin peritumoral stroma og parret ikke-tumorform stroma (Fig. 1C). X-aksen er forskellen i IHC scoringer, der blev beregnet ved hjælp af IHC score på periostin peritumoral stroma minus score på parrede ikke-tumorform stroma. De røde bjælker angiver antal patienter, som havde højere IHC scoringer i kræft sammenlignet med ikke-tumorform stroma, mens den grønne bjælke angiver de lavere IHC scores i kræft. Højden af ​​bjælkerne (y-akse) er antallet af patienter. Summen højde af røde bjælker er betydeligt større end den grønne bar, hvilket indikerer, at de ICH scorer blandt peritumorale stromale celler er signifikant højere end de tilsvarende ikke-tumor-stromaceller. Den Wilcoxon signed rank orden test (parret, to-sidet) giver p-værdien for betydningen af ​​denne forskel (p = 2.75e-12).

For at sammenligne periostin udtryk i prostata tumor og andre betingelser af prostata sygdomme, TMA’erne fra UCLA, som består af 197 kerner af ikke-tumorform prostata (NT), 140 kerner af benign prostatahyperplasi (BPH), blev analyseret 64 kerner af prostata intraepitelialneoplasi (PIN), og 963 kerner af CaP. Bortset kernerne med væv fall-off, blev 1233 kerner anvendes i stromal farvning analyse mens 1247 kerner blev anvendt i epitelcelle farvning analyse. Den periostin farvning blev påvist med lav baggrund i ikke-tumorøse prostata og BPH, og med forøget farvning i PIN, mens mest intensive farvning blev fundet i CaP (fig. 2). Chi-squared test afslørede, at både periostin stroma farvning og epitelial farvning differentieret BPH fra CaP herunder lav kvalitet CaP (Gleason score ≤6), med betydelig p-værdi på 2.2E-16 og 0,001 henholdsvis (tabel 1 og 2, S1 statistiske Analyse). Periostin epitelial farvning differentieret PIN-kode fra CaP herunder lav kvalitet CaP (Gleason score ≤6) (p = 0,001). Desuden periostin stromal farvning differentieret lav kvalitet CaP (Gleason score ≤6) af højkvalitets CaP (Gleason score ≤6) (p = 1.7e-05) (tabel 1 og 2, S1 Statistisk analyse). Resultaterne viser, at den periostin farves positivt korreleret med aggressivitet af prostatacancer.

De repræsentative billeder af periostin ekspression i væv fra forskellige prostata sygdomme. NT: patient parret ikke-tumorøse prostata; BPH: godartet prostatahyperplasi, PIN-kode: prostata intraepitelial neoplasi; og CaP:. prostata adenocarcinom Vejviser

For at bestemme korrelationen mellem periostin udtryk og Gleason score blev alle ni TMA’er analyseres ved hjælp af samme billede beregningsmæssige værktøj. Procentdel af farvning blev beregnet som samlede antal positive pixels divideret med det samlede antal pixels. Stigningerne af periostin samlede farvningsintensitet blev fundet i prostatatumorer med forøget Gleason score i tre TMAs fra JHU (fig. 1B), de tre TMAs fra UCLA (fig. 3A), og de tre TMAs fra UCI (fig. 3B ). Resultaterne viser, at en positiv korrelation mellem total periostin farvning og Gleason score (r = 0,87, p = 0,002) (fig. 3C).

(A) Kassegrafer af positivitet af periostin for tre TMAs fra UCLA, (B) Box afbildninger af positivitet af periostin for tre TMA’er fra UCI, (C) den positive korrelation af fold ændringer og Gleason scor med alle ni TMAs. Procentdel af farvning (positivitet) blev beregnet som det samlede antal positive pixels divideret med det samlede antal pixels.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi ekspressionsniveauet af periostin i de primære prostatakræft væv, ikke-tumor-prostata væv, benign prostatahyperplasi, og prostata intraepitelialneoplasi. Dette er den første undersøgelse med et sådant udvidet kohorte til at analysere periostin udtryk i prostatakræft og forsøge at bestemme den kliniske relevans af periostin elevation med CaP aggressive fænotype.

Høj udtryk for periostin lokaliseret i enten tumor epitel eller peritumoral stroma blev observeret konsekvent som tidligere rapporter [16-19]. Interessant, mens stærke peritumoral periostin farvning blev observeret i alle TMAs, den periostin farvning i tumor epitel blev først påvist i TMA’er fra UCLA og UCI, men ikke i TMA’er fra JHU. Dette kan have været forårsaget af variationer i patientkohorter og teknisk forbehandling, der omfatter prøvetagning, patolog udvalg mv under opførelsen af ​​JHU TMAs. Ifølge den statistiske analyse, epitel- og stromal periostin ekspression var i stand til at skelne CaP danner ikke-tumorøse prostata, BPH og PIN (tabel 1 og 2, fig 1 og 2, og S1 Statistisk analyse). Endvidere blev den samlede periostin farvning (epitel og stromal) vist at være korreleret med stigende Gleason score (fig. 3C). Dette indikerer den peritumoral periostin farvning blev stærkt associeret med CaP aggressivitet.

Andre undersøgelser har antydet, at periostin udtryk er korreleret med kræft metastaser og dystre prognose [9, 20, 21]. Li

et al

rapporterede, at overekspression af periostin ofte blev observeret i stroma af nasopharyngeal carcinom og matches lymfeknudemetastaser sammenlignet med stroma af normale nasopharyngeal mucosa [16]. blev også observeret høj stromale ekspression af periostin at være forbundet med kortere overlevelse af prostatacancer [19]. Men især TMA’erne anvendt i dette studie kun består af primære prostatatumorer. Det ville være yderst nyttigt at analysere periostin udtryk i Cap gentagelse sager, der kan udvikle sig til metastaser og død i fremtiden.

Som konklusion, selv om periostin blev øget i både peritumorale stroma og epitelial CaP celler, periostin havde større ekspression i det tidligere celletype. Vores data viser, at periostin udtryk er meget korreleret med CaP tumor aggressivitet, hvilket understøtter vores tidligere opdagelse. Resultaterne indikerer, at periostin har potentialet til at blive brugt som et diagnostisk væv biomarkør.

Støtte Information

S1 Statistisk analyse. Den statistiske analyse af periostin farvning og status for prostata sygdom

doi:. 10,1371 /journal.pone.0121502.s001

(DOCX)