PLoS ONE: konditionelt replikerende Adenovirus udtrykker TIMP2 Øger overlevelse i en musemodel af dissemineret æggestokkene Cancer

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er fortsat vanskeligt at behandle primært som følge af præsentation af sygdommen på et fremskredent stadium. Konditionelt replikerende adenovira (crads) er lovende anti-cancer midler, der selektivt dræber tumorcellerne. Den foreliggende undersøgelse vurderede effekten af ​​en hidtil ukendt crad (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) indeholdende CXCR4 promotoren for selektiv viral replikation i cancerceller sammen med TIMP2 som et terapeutisk transgen, målrettet mod matrixmetalloproteaser (MMP’er) i en murin ortotopisk model af dissemineret ovariecancer. En orthotopisk model for ovariecancer blev etableret i athymiske nøgne mus ved intraperitoneal injektion af den humane ovariecancer-cellelinje, SKOV3-Luc, som udtrykker luciferase. Efter bekræftelse af peritoneal formidling af cellerne ved non-invasiv billeddannelse blev musene tilfældigt inddelt i fire behandlingsgrupper: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Alle mus blev afbildet ugentligt for at overvåge tumorvækst og blev aflivet efter at have nået en af ​​de foruddefinerede endepunkter, herunder stor tumorbyrde og signifikant vægttab sammen med kliniske tegn på smerte og lidelse. Overlevelse analyse blev udført under anvendelse af log-rank test. Den mediane overlevelse for PBS-kohorten var 33 dage; for Ad-ΔE1-TIMP2, 39 dage; for Ad5 /3-CXCR4, 52,5 dage; og for Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, 63 dage. Den TIMP2-bevæbnet crad forsinket tumorvækst og signifikant øget overlevelse sammenlignet med den ubevæbnede crad. Denne terapeutiske virkning blev bekræftet at være medieret gennem hæmning af MMP9. Resultater af

in vivo

undersøgelse støtte den translationelle potentiale Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 til behandling af humane patienter med fremskreden kræft i æggestokkene

Henvisning:. Yang SW, Chanda D, Cody JJ , Rivera AA, Wæhler R, Siegal GP, et al. (2011) konditionelt replikerende Adenovirus udtrykker TIMP2 Øger overlevelse i en musemodel af dissemineret kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (10): e25131. doi: 10,1371 /journal.pone.0025131

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Maj 27, 2011; Accepteret: August 25, 2011; Udgivet: 12 oktober 2011

Copyright: © 2011 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver R01CA108585, T32 CA075930, og University of Alabama i Birmingham, Patologisk Institut Research Fund er værdsat. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Ovariecancer er den førende årsag til gynækologisk cancer død i USA [1]. Den betydelige morbiditet og mortalitet hos patienter med denne gruppe af tumorer tilskrives det faktum, at patienter præsentere kun med uspecifikke symptomer i de tidlige faser, som udelukker dens diagnose [2]. Størstedelen af ​​patienterne er diagnosticeret på trin III eller ud over, hvor kræften har udbredt i hele den peritoneale kavitet, hvilket fører til en dårlig prognose. Aktuelle behandlinger har begrænsninger, som de fem-års overlevelse er forblevet uændret på 50% i løbet af de seneste fire årtier [3]. Således er et presserende behov for nye og effektivt målrettede behandlinger for dissemineret sygdom.

Betinget replikerende adenovirus (crads) er en lovende ny klasse af lægemidler, da disse vira har potentiale til selektivt og selv-bestandig replikere og lyse kræft celler til at udrydde hele tumoren [4]. Kliniske forsøg med crads har hidtil demonstreret sikkerheden af ​​onkolytiske adenovirus. beskedne terapeutiske virkning med crads tyder imidlertid yderligere optimering til effektiv klinisk oversættelse er påkrævet [5]. En strategi til at forøge antitumorvirkning udnytter crad som en platform til levering af et terapeutisk transgen, ud over deres onkolytiske potentiale [6]. Til det formål har vi den hypotese, at effektiviteten af ​​en replikerende adenovirus kunne forbedres til behandling af ovariecancer ved bevæbne med et gen, der virker på værten mikromiljø, som samspillet mellem cancerceller og dets mikromiljø har været kendt for at modulere tumorudvikling [7], [8], [9].

Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er en forskelligartet familie af proteaser stand til at nedbryde flere komponenter af den ekstracellulære matrix (ECM) [10]. De er en af ​​de ideelle mål for ovariecancer terapi, da deres fejlregulering har vist sig at bidrage til at fremme tumorvækst, angiogenese, invasion og metastase [11]. Især er MMP-2 og MMP-9 konsekvent opreguleret i ovariecancer og er forbundet med dårlig prognose [12], [13]. Vigtig regulator af MMP’er er deres endogene inhibitorer, vævet inhibitor af metalloproteinaser (TIMP), en familie af små secernerede proteiner der virker ved at binde direkte til aktive MMP’er og derved hæmmer deres indsats. Til dato er der blevet identificeret fire pattedyr TIMP’er [14]. Blandt de TIMP familiemedlemmer, TIMP-2 er enestående i sin evne til at inhibere tumorvækst og angiogenese gennem veje også uafhængige af MMP-inhibering [15], [16], [17]. Vi antager, at produktionen af ​​TIMP2 fra virusinficerede celler bør binde og hæmme overskydende ekstracellulære MMP’er og derved hæmme tumor progression gennem både MMP-afhængige og MMP-uafhængige veje.

Vi har tidligere udviklet og bestemt terapeutiske potentiale en TIMP2-bevæbnet crad, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, for ovariecancer terapi [18]. Transduktionelle selektivitet crad blev opnået ved genetisk erstatte Ad5 knop med Ad3 knop, der omgår coxsackie og adenovirus receptor (CAR) og omdirigerer binding til Ad3 receptoren, som mere rigeligt udtrykt på ovariecancerceller [19], [ ,,,0],20]. CXCR4-promotoren blev anvendt til at mediere tumor selektiv replikation af vektoren, som det udviser overlegen aktivitet i både etablerede humane ovariecancerceller og patient-afledt primære tumorvæv [18]. Endvidere aktivitet af CXCR4-promotoren er minimal i leveren, den større organ vides at modulere systemisk leveret adenovirusvektorer [21]. Den TIMP2 genet blev inkorporeret for at inhibere tumorudvikling. Vi har for nylig valideret

in vitro Hoteller, som Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 producerede funktionelle TIMP2, som angivet af hæmning af den enzymatiske nedbrydning af gelatine af aktive MMP [18]. For TIMP2 bevæbnede crad at være effektiv, var det vigtigt, at ekspressionen af ​​TIMP2 ikke forringe viral replikation eller dens onkolytisk potens. Vi har for nylig vist, at både virusreplikation og onkolytisk styrke ikke blev kompromitteret i både SKOV3.ip1 og OV-4 humane ovariecancerceller ved bevæbne med TIMP2 [18]. Endvidere påviste vi, at der var selektivitet i replikation med CXCR4-promotoren som angivet ved et højere replikation i de ovariecancerceller, sammenlignet med kontrolpatienter fibroblaster. Mod omsætte denne virus ind på klinikken, vi yderligere ansat brugen af ​​en

ex vivo

modelsystem til yderligere at undersøge viral replikation i tumorer væv fra patienter med bekræftet stadie III og IV kræft i æggestokkene. Resultaterne af denne undersøgelse viste et konstant højt niveau replikering med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 [18]. Kollektivt, disse data var meget opmuntrende, hvilket tyder på, at Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 kan være effektiv til behandling af fremskreden ovariecancer. I den foreliggende undersøgelse, vi har forsøgt at bestemme den terapeutiske effektivitet af Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 i en murin ortotopisk model af dissemineret ovariecancer. Tumor progression blev overvåget gennem ikke-invasiv

in vivo

billeddannelse. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse viste en signifikant stigning i overlevelse efter behandling med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, tyder på potentiale for klinisk oversættelse.

Materialer og metoder

Celler

Den ildflueluciferase-udtrykkende ovarie adenocarcinom cellelinie SKOV3-luc blev venligst stillet til rådighed af Dr. R. Negrin (Stanford Medical School, Stanford, CA). Den humane lungecarcinom-cellelinje A549 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Begge cellelinier blev dyrket i en 01:01 blanding af Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) og Hams F-12-medium, suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) , L-glutamin (2 mM), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml), ved 37 ° C i en fugtig atmosfære og ved 5% CO

2. Medier og kosttilskud blev købt fra Mediatech (Herndon, VA).

Konstruktion og produktion af virus

Ad-ΔE1-TIMP2 er et E1-, E3-slettet replikationsdefekt Ad5 vektor, som udtrykker TIMP2 under kontrol af CMV-promotoren [22]. Ad5 /3-CXCR4, er en crad med CXCR4-promotoren indsat i E1A position langs med en tropisme-modificeret fiber, der indeholder fiberen aksel og hale Ad5, der har haft knop domæne erstattet med den Ad3 virus [23]. Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 blev konstrueret under anvendelse af en fuld-længde humant TIMP2 cDNA som beskrevet tidligere [18]. Den replikering adenovirus, Ad-ΔE1-TIMP2 blev opformeret i 293 celler. De crads, Ad5 /3-CXCR4 og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 blev amplificeret i A549-cellelinjen. Alle vira blev oprenset ved to runder af cæsiumchlorid-densitetscentrifugering. De titre af viruspartikler og infektiøse enheder blev bestemt som beskrevet tidligere [24].

ortotopisk ovariecancer model og vektor behandling

BALB /c nu /nu mus af 6 til 8 uger af alder blev opnået fra National Cancer Institute-Frederick Animal Production Area (Frederick, MD) og i karantæne i 2 uger. Musene blev holdt under patogenfrie betingelser i henhold til American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care retningslinjer. Animal protokoller blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Alabama i Birmingham.

In vivo

optisk billeddannelse blev udført på det lille dyr imaging core facilitet i Comprehensive Cancer Center ved University of Alabama i Birmingham. På dag 0 blev mus injiceret intraperitonealt (i.p.) med 5 × 10

6 SKOV3-Luc celler i 250 pi PBS og afbildes for bioluminescens til opnåelse baseline aflæsninger. Otte dage senere blev mus reimaged at sikre implantation af tumorerne og blev derefter tilfældigt opdelt i fire grupper: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, med n = 10 per gruppe. Hver mus blev injiceret i.p. med 2 x 10

8 IU for den givne virus i 200 pi PBS eller PBS alene. Alle mus blev afbildet for bioluminescens ugentligt efter tumorcelleinjektion at overvåge tumorvækst. Alle mus blev fulgt dagligt for at optage overlevelse. Overlevelsestid afspejler den tid, dyrene at nå begge følgende parametre. Først, den kliniske tegn på smerte eller angst. For det andet, en af ​​de forudbestemte målbare endpoints herunder: vægttab på over 15%, eller vægtøgning på over 20% af kropsvægten. Dyret vægt blev målt på dag 0 og måles igen hver 3. dag indtil afslutningen af ​​forsøget. Overlevelsesdata blev afbildet på en Kaplan-Meier-kurve, og forskellige grupper blev sammenlignet ved hjælp af log-rank (Mantel-Cox) test (GraphPad Prism Software v.5).

Bioluminescens imaging at opdage

i vivo Salg luciferaseekspression

Mus blev afbildet på dag 0 for bioluminescerende signal efter injektion af SKOV3-luc celler for at opnå en baseline læsning af tumorbyrde. Billeddannelse blev udført igen før første behandling på dag 8 og derefter ugentligt indtil musene blev aflivet. Kort beskrevet blev 150 mg /kg D-luciferin injiceret i.p., og musene blev bedøvet med isofluran gas anæstesi og anbragt i en lystæt kammer. Den fotografiske (grå-skala) henvisning billede blev opnået ved 10 min efter D-luciferin injektion, og selvlysende billede blev indsamlet umiddelbart derefter. Billeder blev opnået med et CCD afkølet til -120 ° C, ved anvendelse IVIS -100 Imaging System (Xenogen Corp., Alameda, CA), med synsfeltet indstillet til en 25 cm højde. De bioluminiscerende billeder brugt eksponeringer spænder fra 1 til 10 s, 1 f /stop, 4 binning, og åbent filter. Data erhvervelse software blev kalibreret, så der ikke pixels blev mættet under billedsamling. Bioluminescent og gråskalabilleder blev overlejret under anvendelse LivingImage software. Living Billede software (Xenogen, Alameda, CA) blev også anvendt til at opnå en pseudo-billede, der repræsenterer bioluminescens intensitet (blå, mindst intens, og rød, mest intense). Regioner af interesse blev trukket rundt i.p. tumorer, og de samlede tællinger (fotoner) blev summeret for hele tumoren området. De samlede tællinger blev normaliseret til erhvervelse billede tid (fotoner /sek). Statistiske forskelle i tumorstørrelse blandt grupper blev vurderet af Students t-test. En

s

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Data blev præsenteret som middelværdier ± SD.

Immunhistokemi

Mus blev aflivet ved høj tumorbelastning ved forudbestemte parametre defineret som ovenfor. På tidspunktet for aflivning blev obduktioner udført på 3 mus fra hver behandlingsgruppe, hvorfra tumorer og større organer blev høstet og fikseret i paraffinblokke. Kort fortalt blev paraffinsnit af xenotransplanterede humane ovarietumorer afparaffiniseret i xylen og hydreret gennem gradueret alkohol. Antigen genfinding blev udført i citratbuffer (pH 6,0), under damp i 20 min. Snit blev afkølet til stuetemperatur, og endogen peroxidase blev fjernet under anvendelse 0,3% H

2O

2 i methanol i 30 min og blokeret med 5% BSA i 30 min. Vævssnit blev derefter inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Sektioner blev vasket i phosphatpufret saltvand indeholdende 0,05% Tween-20 (PBST) og igen inkuberet ved stuetemperatur med biotin-konjugeret gede-anti-ged /anti-mus sekundært antistof i 2 timer. Efter vask blev snit inkuberet med streptavidin-konjugeret peberrodsperoxidase i 1 time ved stuetemperatur. Efter en anden vask med PBST blev immunodetektion udført ved hjælp af 3,3′-diaminobenzidin-H

2O

2 (Vector Labs) og modfarvet med hæmatoxylin.

Resultater

Tilkobling med TIMP2 forsinket tumorvækst

in vivo

for at evaluere den terapeutiske effekt af Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 i en klinisk relevant

in vivo

model, vi genereret orthotopisk formidles æggestokkene cancer ved injektion af kvindelige nøgne mus med humane SKOV3-Luc celler intraperitonealt (IP). En luciferase-udtrykkende stabil cellelinie blev anvendt til at overvåge den terapeutiske virkning af behandlinger med ikke-invasiv billeddannelse

in vivo

. Otte dage efter tumorcelleadministrering, mus blev igen afbildet at sikre implantation af tumorerne og delt i fire behandlingsgrupper, med 10 mus per gruppe. Kontrolgrupperne modtog PBS, en replikationsdeficient vektor, der udtrykker TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), eller en CXCR4-promotor-reguleret crad med et kimært Ad5 /3 fiber (Ad5 /3-CXCR4). Den terapeutiske gruppe modtog en TIMP2 enarmet CXCR4 promotor baseret crad med et kimært Ad5 /3 fiber (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) (fig. 1). Alle mus blev afbildet efter i.p. injektioner af D-luciferin på en ugentlig basis. Et panel af repræsentative billeder er vist i fig. 2A, mens kvantitativ bestemmelse af bioluminescerende signaler er vist i fig. 2B. Lave bioluminiscerende signaler SKOV3-Luc celler blev opdaget så tidligt som 8 dage efter tumor celle injektion, og var forholdsvis konsistent mellem de fire grupper. Ved dag 22, var der betydelig tumorvækst i PBS koncernen og Ad-ΔE1-TIMP2 behandlede gruppe. I modsætning hertil grupper behandlet med crads havde signifikant inhibering i tumorvækst. Gruppen behandlet med mål-virus, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, udviste tumorregression på dag 22. Ved dag 30 var der stor tumorbyrde i PBS-gruppen, som mus udviste en betydelig stigning i abdominal omkreds og var begyndt at viser tegn på sygdom byrde. I modsætning hertil blev tumorvæksten inhiberet signifikant i alle grupper behandlet med virus (p 0,001). På dag 36 var de fleste af musene i PBS-gruppen døde af en tung tumorbyrde. På dette tidspunkt, mus behandlet med Ad-ΔE1-TIMP2, begyndte at vise betydelig tumorbyrde. Men begge grupper behandlet med crads havde betydeligt mindre bioluminescerende signal (p 0,001), hvilket indikerer en langsommere tumorudvikling. Endvidere tumorbelastning i kohorte af mus behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, den væbnede crad, var signifikant mindre i forhold til tumoren byrde i mus behandlet med både Ad5 /3-CXCR4 og ubevæbnede crad (p 0,01 ;. figur 2B). En lignende tendens i overlevelse efter behandling med forskellige vektorer blev observeret i to pilotundersøgelser med mindre antallet af dyr i hver gruppe (data ikke vist). Kollektivt antyder disse data, at både virusreplikation og tilkobling med TIMP2 medvirkende til at forsinke indtræden af ​​tumorvækst.

Adwt300, er den vildtype Ad5-virus. Ad-ΔE1-TIMP2 er et E1-, E3-deleteret replikationsdeficient Ad5 vektor, som udtrykker TIMP2 under kontrol af CMV-promotoren i E1. Ad5 /3-CXCR4 er en ubevæbnet crad med en CXCR4 promotor i E1 at begrænse viral replikation til kræftcellerne i forbindelse med en Ad5 /3 modificeret fiber, der indeholder akslen og halen af ​​Ad5 fiber og Ad3 fiber knop. Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 er en crad med CXCR4 promotor i E1, bevæbnet med TIMP2 i E3B regionen og den førnævnte F5 /3 modificeret fiber.

formidles tumorer blev oprettet ved at injicere 5 × 10

6 SKOV3-Luc celler ip i køer athymiske nøgne mus på dag 0. På dag 8 blev musene behandlet med enten en i.p. injektion af PBS, eller 2 × 10

8 IU Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 hhv. Bioluminescens niveauer blev målt ugentligt. (A), blev pseudofarve billede, der repræsenterer bioluminescens intensitet på dag 8, 22, 30 og 36. (B), bioluminescens intensitet fra maveregionen kvantificeret og normaliseret, og den gennemsnitlige fotontællinger per sekund for hver gruppe er vist for de givne dage . Data rapporteret som middelværdi ± SD for hver behandlingsgruppe. * P. 0,05

Tilkobling med TIMP2 øget overlevelse

Alle mus blev derefter fulgt for overlevelse som vist i fig. 3A. Den mediane overlevelse steget fra 33 dage, for PBS-kohorten, til 39 dage i kohorten injiceret med ikke-replikerende vektor, der udtrykker TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), denne forskel var statistisk signifikant (p 0,03). Den kohorte behandlet med den ubevæbnede crad (Ad5 /3-CXCR4) havde median overlevelsestid på 52,5 dage, mens kohorte behandlet med TIMP2-bevæbnede crad (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) havde en median overlevelsestid på 63 dage ( fig 3B), denne forskel med også statistisk signifikante (p. 0,002). Sammenfattende tilkobling med TIMP2 synes at være nyttige til behandling af dissemineret ovariecancer, da det øgede overlevelse

in vivo

.

Mus blev overvåget for overlevelse. Overlevelsesdata er plottet på en Kaplan-Meier-kurve (A). Behandling med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 signifikant forøget overlevelse sammenlignet med behandling med Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, eller PBS (p 0,05). (B), median overlevelse i dage for hver behandlingsgruppe.

TIMP2 udtrykkes i tumorer i væbnede vira

For at afgøre, om den øgede overlevelse ses i TIMP2 enarmede crad sammenlignet med den ubevæbnede crad skyldtes modulering af mikromiljøet af TIMP2, ekspression af TIMP2 blev først undersøgt i tumorer udskåret fra hver behandlingsgruppe ved autopsi. Som det ses i fig. 4, tumorer udskåret fra grupper behandlet med PBS og Ad5 /3-CXCR4 var negative for TIMP2 ekspression. Resultat af immunohistokemi viste, at i tumorer udskåret fra kohorte behandlet med Ad-ΔE1-TIMP2, TIMP2 ekspression var minimal og optrådte begrænset til periferien af ​​tumoren. Dette var ikke uventet, da Ad-ΔE1-TIMP2 er en ikke-replikerende vektor og ikke forventedes at udbrede i tumoren effektivt. I modsætning hertil udviste tumorer fra mus behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 forbedret TIMP2 farvning i hele tumoren, hvilket indikerer, at dette onkolytiske virus var effektiv til at inficere og replikere i hele tumoren.

På tidspunktet for aflivning af mus på grund af tumor byrde blev tumorer indsamlet fra angivne behandlingsgrupper og undersøgt for ekspression af TIMP2 ved immunhistokemi.

TIMP2-bevæbnet crad faldt niveauet af aktive MMP’er

TIMP2 er en kendt inhibitor af MMP2 og MMP9. Derfor farvning for aktiv MMP2 og MMP9 blev udført for at bestemme, om niveauer blev påvirket. Resultaterne af denne analyse viste, at tumorer fra grupper behandlet med PBS, Ad5 /3-CXCR4, og Ad-ΔE1-TIMP2, alle udviste høje niveauer af aktiv MMP2. I modsætning hertil tumorer fra gruppen behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 havde meget lave niveauer af MMP2. Et identisk mønster blev også påvist i MMP9-ekspression ved immunhistokemi. Grupper behandlet med PBS, Ad5 /3-CXCR4, og Ad-ΔE1-TIMP2, alle udstillede immunoreaktivitet til aktiv MMP9. I modsætning hertil tumorer fra gruppen behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 havde meget lave niveauer af aktiv MMP9-ekspression (fig. 5). Disse data antyder, at TIMP2 udskilles af den væbnede crad var også effektiv til inhibering af MMP2 og MMP9 aktiviteter.

På tidspunktet for aflivning af mus som følge af tumorbyrde blev tumorer indsamlet fra angivne behandlingsgrupper og undersøgt for ekspression af MMP-9 ved immunhistokemi.

TIMP2-bevæbnede crad hæmmede angiogenese

Endelig tumorer blev undersøgt for ekspression af CD31, en markør for angiogenese. Kohorter behandlet med PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, og Ad5 /3-CXCR4, havde stor diameter fartøjer med minimal immunreaktivitet foring endoteliale vægge sammenlignet med de kohorter behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 (fig. 6).

Tumor konglomerater i maveregionen blev indsamlet under ofring af dyr fra angivne behandlingsgrupper og fast. Fem uM sektioner af paraffin blokke af tumorvæv blev farvet med humant CD31-antistof til at opdage blod kar.

Diskussion

Betydningen af ​​samspillet mellem tumorceller og mikromiljø i modulerende tumor progression har længe været anerkendt [25]. I patogenesen af ​​ovariecancer, er MMP-2 og MMP-9 konsekvent opreguleret [12]. Desuden øgede niveauer af disse MMP’er korrelerede negativt med overlevelse, da de er forbundet med fremskreden stadie, high-grade ascites og positive (metastatisk) lymfeknude [13]. Disse data tyder på, at MMP’er er gyldige terapeutiske mål til behandling af ovariecancer. En vigtig regulator af MMP’er er deres endogene inhibitorer, TIMP’er. Fire mammale TIMP’er er blevet identificeret hidtil, blandt dem TIMP2 er blevet meget omfattende undersøgt på grund af dens evne til at inhibere tumorvækst og angiogenese ved en række forskellige mekanismer er uafhængige af direkte MMP-inhibering [15], [16], [17]. TIMP2 kan hæmme endotelcelleproliferation gennem induktion af protein-tyrosin-phosphatase-aktivitet [17]. TIMP2 hæmmer også tumorvækst og angiogenese ved at øge aktiviteten af ​​mitogenaktiveret proteinkinase phosphatase 1 [15]. I et forsøg på at udvikle en succesfuld crad rettet mod behandling af dissemineret ovariecancer, foreslog vi, at bevæbne den med TIMP2 ville forøge den terapeutiske virkning af crad ved at hæmme tumor progression gennem både MMP-afhængige og MMP-uafhængige veje.

i vores seneste undersøgelse, vi karakteriseret og vurderet effekten af ​​Ad5 /3-CXCR4-TIMP2

in vitro

. Vi bekræftede, at TIMP2 ekspression ikke forringe viral replikation eller onkolytisk potensering af virusset. Endvidere blev selektiv replikation opnås med CXCR4-promotoren. Validering af Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 på primære tumorprøver fra fem patienter med bekræftet stadium III eller IV ovariecancer, afslørede et konsekvent højt niveau af replikation sammenlignet med de andre kontrol vira. Kollektivt, foreslog disse data potentiale Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 til behandling af fremskreden ovariecancer [18].

I den foreliggende undersøgelse, vi har forsøgt at bestemme effekten af ​​Ad5 /3-CXCR4- TIMP2

in vivo

. Noninvasiv bioluminiscerende billedbehandling giver et stærkt værktøj, der tillader langsgående overvågning af tumorvækst i mus. Desuden er det tilladt os at bruge en model, der er klinisk relevant. I de fleste tilfælde er ovariecancer diagnosticeret på et fremskredent stadium, hvor kræften har udbredt i hele den peritoneale kavitet, således ved hjælp af en subkutan dyremodel til at evaluere virkningen af ​​behandlingen, mens bekvem, afspejler ikke den naturlige kliniske progression af sygdom. Derfor opstilling formidles tumorer med i.p. injektion af SKOV3-Luc celler sammen med billeddannelse muligt for os at anvende en klinisk gyldig model system, der kan mere præcist og effektivt forudsige den translationelle værdi Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Desuden har flere undersøgelser vist følsomhed og gyldigheden af ​​bioluminescerende billeddannelse i i.p. tumormodeller [26], [27], [28].

Behandling med en TIMP2 enarmet crad signifikant forøget overlevelse sammenlignet med den ubevæbnede crad imidlertid stigningen ikke var robust. I den foreliggende undersøgelse blev virotherapy givet med en enkelt injektion af lav dosis virus på dag 8 efter tumorimplantation. I modsætning hertil mange

in vivo

eksperimenter undersøger effekten indledt behandlingen enten før eller på samme dag af tumor injektion. Desuden er de virale anvendte doser var mindst én til to logs højere og blev leveret via flere administrationer af virus [29], [30], [31], [32]. Hovedformålet med at begrænse vektor dosis i den foreliggende undersøgelse var at etablere et sikkert terapeutisk indeks. Da de nøgne musemodeller, der anvendes i den prækliniske evaluering af eksperimentelle behandlingsformer for kræft i æggestokkene ikke har et funktionelt immunsystem, stigende vektoren dosis til det højest mulige niveau for at opnå en terapeutisk effekt kan ikke være passende for ekstrapolation til mennesker som den højeste vektor dosis resulterer i aktivering af immunsystemet forårsager alvorlige bivirkninger. Men fra data i denne undersøgelse, er det tænkeligt, at med en højere dosis eller et multiplum doseringsregimen, terapeutiske effektivitet kan forbedres yderligere. Et potentielt downside med gentagen administration af virus er, at immuniteten kan blive et stort problem og hæmme terapeutisk effekt. Seneste publikation fra

Hemminki et al

tyder på, at selv ved tilstedeværelsen af ​​signifikant immunitet mod Ad5 kunne man omgå denne immunitet ved blot at bruge en serotype, der er mindre udbredt i befolkningen, såsom Ad3 og dermed opnå terapeutiske virkning uden behov for at øge den virale dosis. Dette princip kan let anvendes til at gentage administrationer virus, hvor hvis immunitet udvikles til serotype anvendes, så kan man blot ændre rygraden af ​​virusset til en mindre udbredt serotype [33]. Desuden kunne forøgelse af viral effekt også opnås ved en multi-modalitet tilgang med stråling eller kemoterapi som adjuverende behandlinger [34], [35], [36]. Med vores nuværende platform af virus målrettet gennem Ad5 /3 er det tænkeligt, at det potentielt kan inficere og formere sig i humane immunceller, hvis omfang ikke kan bestemmes i denne model, som den menneskelige Adenovirus ikke formere sig i mus væv og atymiske nøgen mus mangler T-celler. Men denne potentielle bivirkning kan reduceres ved at ændre tropisme af det virale platform. Perreau

et al

viste nedsat infektion af dendritiske celler med hunde adenovirusserotype 2 (CAV-2) fiber knop [37]. Således ved at skifte knappen fiber fra Ad5 /3 til Ad-CAV2, kan vi forhindre transduktion af dendritiske celler. Endvidere gør det muligt at fastholde de CXCR4 promotorer som den udviser høj aktivitet i tumorceller.

tumorbiologi, arten af ​​peritoneal udbredelse af ovariecancer, såvel som de paradoksale roller MMP’er og TIMP’er i cancer progression yderligere tilføjer kompleksitet til effektiv behandling af sygdommen. Det er velkendt, at øget MMP-2 og MMP-9-ekspression i ovariecancer korrelerer negativt med prognose og overlevelse [12], [13], [38], [39], [40], [41]. Imidlertid er de specifikke roller MMP’er i æggestokkræft progression ikke veldefineret. Undersøgelser viser, at MMP-2 overvejende er vigtigt i begyndelsen tumorgenese ved at indlede metastase ved at forbedre adhæsion af ovariecancerceller til peritoneum [42]. Således terapier blokere det når metastase er etableret er ineffektive. Men andre rapporter støtter rollen af ​​MMP-9 i tumorvækst og angiogenese [43]. Roller MMP’er og TIMP’er i æggestokkræft er yderligere forvirret af immunhistokemiske undersøgelser ser på udtryk for TIMP2 i kræft i æggestokkene væv. Mens nogle grupper har rapporteret lav udtryk for TIMP2 i primære ovarietumorer [38], andre har set forøget TIMP2 udtryk i kræft i æggestokkene væv, hvilket antyder, at TIMP2 bidrager til tumor progression, dels gennem aktivering af pro-MMP2 og hæmning af anti- tumor aktiviteter MMPs [39], [41]. I modsætning hertil har flere dyreforsøg udnytte viral levering af TIMP2 vist sin nytte at undertrykke tumorvækst, migration og metastaser i forskellige kræftmodeller [44], [45], [46], [47], [48]. Kollektivt disse undersøgelser indikerer, at måske effekter af TIMP2 på tumor forfremmelse eller undertrykkelse er afhængige af timing og den specifikke type tumor. Snarere end uspecifik hæmning af MMP, er det måske mere hensigtsmæssigt at specifikt hæmme forskellige MMP’er under stadier af tumor progression.

Emerging data fra kliniske, patologiske, og molekylærgenetiske undersøgelser tyder en ny model for æggestokkene carcinogenese, hvor æggestokkene kræft er klassificeret i to forskellige grupper, type i og II [49]. Type I tumorer er klinisk indolent, da de er langsomt voksende og generelt begrænset til ovariet ved diagnose. I modsætning hertil type II tumorer er klinisk aggressiv, til stede på et fremskredent stadium, og menes at opstå

de novo

, som prækursorer læsioner ikke er blevet identificeret. Type II tumorer, der tegner sig for 70% af ovariecancer, er karakteriseret ved mutationer af TP53 i 80% af tilfældene. Denne nye data tyder på, at p53 potentielt kunne være et terapeutisk mål at bevæbne virus for kræft i æggestokkene terapi. Crads bevæbnet med p53 har vist

in vitro

at forbedre onkolyse i livmoderhalskræft [50] og en række andre kræft cellelinjer [51]. En anden potentiel terapeutisk mål er CXCR4, den eneste kemokinreceptor sig at blive udtrykt på ovariecancer [52].