PLoS ONE: CDA-2, et Urinary Forberedelse, Hæmmer lungekræft Udvikling gennem bekæmpelse af NF-kappaB Aktivering i myeloid Cell

Abstrakt

CDA-2 (celledifferentiering agent 2), en urin forberedelse, har potent anti proliferativ og pro-apoptotiske egenskaber i kræftceller. Men mekanismerne i tumor hæmmende virkning af CDA-2 er langt fra klar, og især var der ingen rapport om lungekræft. Her demonstrerer vi, at CDA-2 og dens hovedkomponent phenylacetylglutamin (PG) reducere metastatisk lunge tumorvækst, og forøger overlevelsestiden efter inokulering med Lewis lungecarcinom (LLC) -celler i en dosis-afhængig måde i C57BL6-mus. Proliferativ program analyse i kræftceller afslørede en grundlæggende effekt af CDA-2 og PG på proliferation og apoptose, herunder Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, Survivin, PCNA, Ki-67 proteiner og TUNEL analyser. CDA-2 og PG reducerede signifikant NF-KB-DNA-bindingsaktivitet i lungecancerceller og i alveolære makrofager af tumorbærende mus og især faldet frigivelsen af ​​inflammatoriske faktorer, herunder TNFa, IL-6, og KC. Desuden CDA-2 og PG mindske udtryk for TLR2, TLR6, og CD14, men ikke TLR1, TLR3, TLR4, og TLR9 i knogle-marv-afledte makrofager (BMDM) af mus stimuleret af LLC-medium (LLC-CM ). Overudtrykker TLR2 i BMDM forhindrede CDA-2 og PG fra inhibere NF-KB-aktivering, samt induktion af TNFa og IL-6. TLR2: TLR6 komplekser medierer virkningen af ​​NF-KB inaktivering ved CDA-2. Afslutningsvis CDA-2 inhiberer kraftigt lungetumor udvikling ved reduktion af inflammation i lungen gennem suppression af NF-KB-aktivering i myeloide celler, associere med modulering af TLR2 signalering

Henvisning:. Wang X, Jiang CM, wan HY, Wu JL, Quan WQ, Bals R, et al. (2012) CDA-2, et Urinary Forberedelse, Hæmmer lungekræft Udvikling gennem bekæmpelse af NF-kappaB Aktivering i myeloid Cell. PLoS ONE 7 (12): e52117. doi: 10,1371 /journal.pone.0052117

Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japan

Modtaget: April 26, 2012; Accepteret: November 9, 2012; Udgivet: 17. december 2012 |

Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Research Program for Udvalget for Videnskab og Teknologi i Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden, der forårsager mere end en million dødsfald på verdensplan [1]. Trods fremskridt i tidlig påvisning og standard behandling, er lungekræft ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium og har en dårlig prognose. Derfor forebyggelse og behandling af lungekræft er i fokus for intensiv aktuel forskning [2].

CDA-2 (celledifferentiering agent 2) er en urin forberedelse, isoleret fra sunde human urin i Kina. Det er et hidtil ukendt multifunktionelt stof, der er nyttigt til både forebyggelse og behandling af adskillige tumorer, herunder leukæmi, brystcancer, levercancer, og fæokromocytom, i prækliniske undersøgelser [3] – [5]. Men mekanismerne i tumor hæmmende virkning af CDA-2 er langt fra klar, og især var der ingen rapport om lungekræft. CDA-2 indeholder flere aktive bestanddele, herunder phenylacetylglutamin (PG) (41%), benzoyl Glykokoll (35%), peptider (MW 400-2800) (17%), 4-OH-phenyleddikesyre (6%) og 5 -OH-indoleddikesyre (1%), som med forskellige ordninger for anticancer [5]. Selvom tumor inhibering kan tilskrives disse komponenter, PG er sandsynligvis en vigtig tumorhæmmende komponent [3]. Fase I /II /III kliniske forsøg med CDA-2 er afsluttet i Kina i 2003. I august 2004, staten Drug Administration (SDA) Kina godkendt brugen af ​​CDA-2 som en anticancer lægemiddel i solide tumorer. Selvom CDA-2 blev foreslået at bidrage til tumorinhibering gennem opregulering af peroxisomproliferatoraktiveret receptor-γ (PPAR-γ) og undertrykkelse af PI3 /Akt-signalvejen i tumorceller, tumor-hæmmende virkning af CDA-2 var hidtil hovedsageligt påvist i kræftceller og sin indsats i tumor mikromiljøer, især til immune /inflammatoriske celler i tumor stroma, ikke er blevet en kritisk vurdering [6], [7].

NF-KB er et centralt koordinator af inflammatorisk og immunrespons og er for nylig blevet fundet at spille en afgørende rolle i carcinogenese af en række cancersygdomme, herunder lunge- eller colon carcinoma [8], [9]. Det er bemærkelsesværdigt, at de pro-inflammatoriske cytokiner og chemokiner er blevet knyttet til kræftfremkaldende processer i mennesker og mus, og er reguleret af NF-KB-vejen. For eksempel NF-KB-drevet cytokinproduktion af myeloide celler (fx modne makrofager, dendritiske celler og neutrofiler), såsom TNF-α og IL-6 er nødvendige for vækst lungetumor [9]. I en musemodel af colitis-associeret cancer (CAC), blev IKKβ slettet i myeloide celler (der fører til reduceret NF-KB-aktivitet), tumorstørrelse var betydeligt mindre sammenlignet med kontroller og ekspression af pro-inflammatoriske cytokiner, såsom TNFa, IL -6, og IL-1, blev også markant reduceret [10]. Således i myeloide celler, NF-KB-aktivering fremmer tumorvækst. Denne virkning skyldes hovedsagelig øget tumorcelleproliferation via produktion af TNFa, IL-6 og andre cytokiner, der reguleres af NF-KB-vejen i myeloide celler [10], [11].

Her rapporterer vi vores seneste arbejde om tumor undertrykkelse og de molekylære mekanismer i CDA-2 og dens hovedbestanddel, PG, til lungekræft. Vi anvendte eksperimentelle murine lungekræft modeller, hvor CDA-2 og PG reducerer lunge tumorvækst, og viste, at NF-KB-inaktivering i myeloide celler er ansvarlig for CDA-2-induceret tumorregression. Vi fandt, at inhibering af TLR-2 signalering er en vigtig mekanisme af CDA-2-induceret NF-KB-inaktivering. Vores resultater tyder på en hidtil ukendt teori til cancerterapi CDA-2, baseret på inhiberingen af ​​NF-KB i myeloide celler af tumor mikromiljøer.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

musen Lewis lungecarcinom (LLC) -celler blev opnået fra American Type Culture Collection og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Hyclone laboratorier. Inc, South, Utah, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 100 U /ml penicillin, og 100 U /ml streptomycin (Hyclone laboratorier. Inc, South, Utah, USA). Cellekulturer blev udført ved 37 ° C i befugtet luft med 5% CO

2.

Dyr

Female C57BL /6 mus blev opnået fra National Rodent Laboratory Animal Resource (Shanghai Branch , PRC) og holdt under et patogen-fri Central Animal Facility af Tongji Universitet. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Alle eksperimenter dyr blev godkendt af Tongji Universitet etiske komité om brug og pasning af dyr.

Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Generation af lungekræft model i mus og Behandling af CDA-2 og PG

En lungekræft metastase model i C57BL /6 mus blev genereret ved intravenøs injektion af LLC celler. Kort beskrevet subkonfluent LLC-celler eller A549-celler blev høstet og passeret gennem en 40 um cellefilter (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), vaskes tre gange med PBS, resuspenderet i serumfrit DMEM og injiceres i en koncentration på 2 × 10

5 LLC-celler per mus i halevenen. After14 dage blev mus injiceret intraperitonealt (ip) med 500 mg /kg, 1000 mg /kg, og 2000 mg /kg CDA-2 (venligt leveret af Ever Life Pharmaceutical Co. Ltd. Hefei, Anhui, Kina) eller 200 mg /kg, 400 mg /kg, og 800 mg /kg PG (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) i PBS eller PBS alene en gang hver dag i 10 dage.

Evaluering af lungetumorer

på udpeget tidspunkter blev musene aflivet, og deres lunger blev fjernet, vejet og histologisk undersøgt. Nogle mus blev holdt indtil døden og overlevelsesdata blev opnået. Lung tumorknuder blev mikrodissekeres anvendelse af en 18 G nål under et mikroskop til proteinanalyse. Tumor mangfoldigheden og maksimale størrelser blev bestemmelse som beskrevet [9]. Kort fortalt, blev hele tumorbærende lunger manuelt oppustet med og fikseret i 4% paraformaldehyd og indlejret. Paraffinindstøbte lunger blev serielt sektioneret ved 350 um og histologisk undersøgt med hæmatoxylin og eosin (H muse-anti-PCNA, kanin-anti-cIAP1, kanin-anti-survivin (alle tre fra Abcam, Cambridge, UK); muse anti-β-actin (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland). HRP-konjugeret gede-anti-kanin (Santa Cruz Biotechnology) eller kanin-anti-muse blev anvendt som sekundært antistof (Dako, Glostrup, Danmark).

bronchoalveolær lavage (BALF) leukocyttal og alveolære makrofager Isolation

BALF blev bestemt som tidligere [14] beskrevet. Procentdele af leukocytsubpopulationer blev bestemt ved at tælle 100 leukocytter i et tilfældigt udvalgt del af cytospin slide. Det samlede antal leukocytter i BALF bestemtes ved anvendelse af et hæmocytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Alveolære makrofager blev isoleret for EMSA som tidligere beskrevet [15]. Kort beskrevet BALF var frø i DMEM og opretholdes i cellekultur skålen. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i befugtet luft med 5% CO2 i 1 time. Skålen blev derefter vasket 3 gange med PBS, og de adhærerende celler, overvejende makrofager, blev indsamlet til ekstrakt kerneprotein.

elektroforetiske mobilitet (EMSA)

kerneproteiner blev isoleret fra lungen tumorer og alveolære makrofager ved hjælp kerneekstrakt Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) og NF-KB-DNA-bindingsaktivitet blev målt ved EMSA som beskrevet [13]. Kort fortalt blev kerneproteiner inkuberet med [

32P] -mærket dobbeltstrenget NF-KB konsensus probe (Promega) ved stuetemperatur i 30 min. DNA-proteinkomplekser blev opløst på 4% polyacrylamidgeler ækvilibreret i 0,5 × TBE under 300V. Geler blev tørret og eksponeret for Hyperfilm ECL (Amersham Bioscience) ved -80 ° C og fremkaldt under anvendelse af Kodak-film (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA). Salg

Cytokiner ELISA Assay

BALF prøver blev fremstillet som beskrevet ovenfor. TNF, IL-6, og KC blev målt ved kommercielt tilgængelige sandwich-ELISA (R muse Il1β, 5′-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3 ‘og 5′-GATCCACACTC TCCAGCTGCA-3′; muse IL6, 5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3 ‘og 5′-TCC ACGATTTCCCAGAGAAC-3′; muse TNFa, 5’-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3 ‘og 5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′; muse Kc, 5’-CTTGGGGACACCTTT TAGCA-3 ‘og 5′-GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3′; muse MIP1, 5’-TGGAG CTGACACCCCGAC-3 ‘og 5′-ACGATGAATTGGCGTGGAA-3′; muse MCP1, 5’-GCAGGTCCCTGTCATGCTTC-3 ‘og 5′-TCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3’; mus TLR2, 5’TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTG -3 ‘og 5’CGCTCCGTACGAA GTTCTCAG -3 « Tlr6, 5’CAACTTAACGATAACTGAGAG -3 “og 5’CCAGAG AGGACATATTCTTAG -3« CD14, 5’ACA TCT TGAACC TCC GCA AC -3 ‘og 5’AGGGTTCCTATCCAGCCTGT -3 “. Specificitet af RT-PCR blev kontrolleret af ” ingen revers transkription ” kontrol og smeltekurveanalyse. Kvantitative PCR-resultater blev opnået under anvendelse af ΔΔCT (tærskelcyklus) metode. Data blev normaliseret til p-actin niveauer i hver prøve.

Statistisk analyse

Værdier vises som middelværdi plus eller minus SEM. Sammenligninger mellem grupper blev analyseret ved t-test (to-sidet) eller ANOVA til forsøg med mere end to undergrupper eller Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant for P-værdier mindre end 0,05.

Resultater

CDA-2 Fald Lung tumorvækst i mus Tumor Modeller

For at undersøge effekten af ​​CDA-2 og dens vigtigste komponent PG på vækst af lunge tumor, blev tumorer genereret ved intravenøs injektion af 2 × 10

5 LLC celler i C57BL6 mus. After14 dage blev mus injiceret intraperitonealt (ip) med 500 mg /kg, 1.000 mg /kg, og 2000 mg /kg CDA-2 eller 200 mg /kg, 400 mg /kg, og 800 mg /kg PG i PBS eller PBS alene en gang hver dag i 10 dage. Mus blev aflivet, og deres tumor mangfoldigheden og maximum tumor størrelser af lungetumorer blev evalueret. I modsætning til kontrol, administration af CDA-2 til musene væsentligt reducerede lunge tumor mangfoldigheden og maximum tumorstørrelser (fig. 1A, B). H ned) i LLC podede C57 /BL6-mus 10 dage efter CDA-2 behandling med angivne doser. 2 × 10

5 LLC-celler blev intravenøst ​​injiceret i sex-matchede C57 /BL6-mus ved halevene, 14 dage senere blev musene behandlet med PBS eller CDA-2 i 10 dage, på dag 25, blev lungerne fjernet. (B) Lung tumormangfoldighed og maksimal tumorstørrelser blev bestemt ved seriel sektionering ved 350 um intervaller. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 5, signifikant forskel, * p 0,05. (C) Overlevelseskurver af mus (p 0001; log-rank test for statistisk analyse, n = 10).

(A) Lunge udseende (op) og histologi (H ned) i LLC inokuleret C57 /BL6-mus 10 dage efter PG behandling med angivne doser. 2 × 10

5 LLC-celler blev intravenøst ​​injiceret i sex-matchede C57 /BL6-mus ved halevene, 14 dage senere blev mus behandlet med PBS eller PG i 10 dage, på dag 25, blev lungerne fjernet. (B) Lunge tumor mangfoldigheden og maksimal tumor størrelser blev bestemt som i figur 1B. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 5, signifikant forskel, * p. 0,05

CDA-2 Reduceret spredning og induceret apoptose i lungekræft Celler

Dernæst at undersøge, om CDA-2-induceret ændring i lunge tumorbyrde skyldtes ændret celleproliferation eller apoptose, undersøgte vi celleproliferation med immunhistokemisk analyse af Ki-67 og celle apoptose ved in situ terminal-transferase dUTP-medieret nick endemærkning (TUNEL) assay. 2 × 10

5 LLC-celler injiceret i mus og 14 dage slutningen af ​​2000 mg /kg CDA-2, 800 mg /kg PG eller PBS blev indgivet som ovenfor i 5 dage. Overensstemmelse med ændringerne i lunge tumorbelastning, Ki-67-positive celler var lavere i CDA-2 eller PG-behandlede tumorer sammenlignet med tumorer af PBS-behandlede dyr (fig. 3A). Omvendt apoptose signifikant opreguleret efter CDA-2 eller PG behandling, hvorimod meget lidt apoptose blev set efter PBS-behandling (fig. 3B).

(A) tumorbærende mus blev behandlet med 2000 mg /kg CDA- 2 eller 800 mg /kg PG i 5 dage, og lunger blev fjernet, fikseret og paraffinindlejret. Paraffinindlejrede tumorbærende lungesnit blev undersøgt ved immunfarvning med anti-Ki-67-antistoffer til påvisning af prolifererende celler. Bar = 100 um. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 5, signifikant forskel, * p 0,05. (B) Apoptotiske celler blev identificeret ved TUNEL-farvning. Bar = 200 um. (C) udskårne lungetumorer blev analyseret for ekspression af angivne proliferative og apoptotiske proteiner ved immunoblotanalyse. Udtrykket af β-actin blev anvendt som intern kontrol for mængden af ​​proteiner.

Vi undersøgte nogle proteiner og gener vides at være involveret i celledeling og apoptose. Tumorer blev omhyggeligt mikrodissekeres hjælp nåle fra lunger, lyseret og undersøgt ved immunoblotting. I modsætning til PBS behandlingsgruppe, ekspression af de antiapoptotiske proteiner Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, og survivin blev stærkt reduceret som reaktion på CDA-2 behandling (fig. 3C). CDA-2-behandling faldt også ekspressionen af ​​prolifererende cellekerneantigen (PCNA), en anden S-fasen markør for cellecyklussen (Fig. 3C). Immunoblotanalyse af tumorlysater af mus viste også nedregulering af Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, og Survivin samt PCNA i lungetumorer efter PG-behandling (fig. 3C). Disse resultater stemmer overens med dem, der observeres ved analyse af Ki-67 og TUNEL.

CDA-2 Forhindrer NF-KB-aktivering og lungebetændelse i Lung af mus

Det er vist, at NF -κB aktivering spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​inflammatoriske og immunreaktion, apoptose, og onkogenese, som er associeret med inflammation-fremmende tumorvækst [19], [20]. For at belyse de mekanismer, tumor-inhiberende virkning af CDA-2, vi først sammenlignet NF-KB-aktivering af dissekeret kræft fra mus med CDA-2, PG eller PBS behandling. Notatet reseceret væv indeholdt tumorvæv herunder tumor og inflammatoriske celler. Nukleare ekstrakter blev forberedt og NF-KB-aktivering undersøgt af EMSA. Som vist i fig. 4A, CDA-2 behandling faldt betydeligt NF-KB DNA-bindingsaktivitet sammenlignet med kontrollen efter 5 dage 2000 mg /kg CDA-2 behandling. Vigtigere, NF-KB-DNA-bindingsaktivitet også blev stærkt inhiberet som reaktion på CDA-2 behandling i alveolære makrofager fra bronchoalveolær lavage fluid (BALF) (fig. 4B). Dernæst behandling med 800 mg /kg PG i 5 dage i tumorbærende mus også effektivt inhiberede NF-KB-DNA-bindingsaktivitet i både tumorceller og alveolære makrofager (fig. 4C). Dette resultat antyder, at PG har lignende virkning ved inhibering af NF-KB-aktivering.

EMSA af kerneekstrakter isoleret fra tumorceller og alveolære makrofager viser nuklear binding af NF-KB efter 5 dage 2000 mg /kg CDA-2 (A og B) eller 800 mg /kg PG (C) behandling. Totalt celleantal og leukocytpopulationen i BALF indsamlet fra C57BL6-mus 3 eller 5 dage 2000 mg /kg CDA-2 (D) og 800 mg /kg PG (E) eller PBS behandling. Cellulær sammensætning blev bestemt under anvendelse cytospinpræparater. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 5, signifikant forskel, * p. 0,05

Dernæst spurgte vi, om CDA-2-induceret inaktivering af NF-KB i myeloide celler ændrer den inflammatoriske situationen i lungerne. Vi kendetegnet inflammatoriske celler og mediatorer i lungerne hos mus udsat for mus cancer model. Totalt celleantal og absolutte antal makrofager, neutrofiler og lymfocytter i BALF var betydeligt reducerede 3 og 5 dage efter 2000 mg /kg CDA-2 behandling (fig. 4D) eller 5 dage efter 800 mg /kg PG behandling (fig. 4E ). CDA-2 eller PG behandling effektivt reducerede ekspression af forskellige inflammatoriske cytokin og chemokin mRNA’er, såsom Il1b, IL6, Kc, TNFa, Mip1α, og MCP1 i lungen (fig. 5A, B). CDA-2 eller PG behandling også nedsat sekretion af TNF-α, IL-6, og KC ved lungeceller (fig. 5C, D). Theses Resultaterne antydede, at reduktion af inflammatorisk reaktion ved inhibering af NF-KB-aktivering, vil sandsynligvis være en væsentlig tumor-inhiberende mekanisme CDA-2 og PG.

Induktion af inflammatoriske cytokin og kemokin-mRNA i homogenater af 3 eller 5 dage 2000 mg /kg CDA-2 (A) eller 800 mg /kg PG (B) behandlede lunger blev målt ved real time PCR. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 5, signifikant forskel, * p 0,05. Koncentration af inflammatoriske cytokiner i BALF af 3 eller 5 dage 2000 mg /kg CDA-2 (C) eller 800 mg /kg PG (D) behandlede mus blev bedømt ved ELISA. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 5, signifikant forskel, * p. 0,05

CDA-2 Forhindrer TLR2 signalering i knoglemarv-afledte makrofager

Tidligere undersøgelser har vist at Toll-lignende receptorer (TLRs) -medieret signalering begunstige aktiveringen af ​​NF-KB, der fører til en pro-inflammatorisk respons [21]. For at løse hvorvidt CDA-2 inhiberede NF-KB gennem TLR-signalvejen undersøgte vi ekspressionen af ​​TLR familiemedlemmer i knogle-marv-afledte makrofager (BMDM), der blev stimuleret af serumfrit konditioneret medium fra LLC-celler (LLC-CM) . LLC-CM signifikant induceret ekspression af TLR2 og dets coreceptor TLR6 og CD14 (Fig. 6A, B), men ikke TLR1, TLR3, TLR4, og TLR9 i BMDM (data ikke vist). Vigtigere, tilsætning af CDA-2 eller PG undertrykt signifikant ekspressionen af ​​TLR2, TLR6, og CD14 i en koncentrationsafhængig måde (fig. 6A, B). Inkubation af BMDM med CDA-2 eller PG alene havde ingen virkning på TLR2, TLR6, og CD14-ekspression (fig. 6A, B). Disse resultater antydede, at TLR2 signiling kunne fungere som mægler og bidrager til NF-KB inaktivering ved CDA-2 og PG.

BMDMs blev behandlet i 24 timer ved serumfrit DMEM (SFM) eller LLC-CM eller en kombination med CDA-2 (A) eller PG (B). Totale RNA’er blev isoleret fra BMDMs, og genekspression blev vurderet ved real-time PCR. Resultaterne er middelværdien fold ændring ± SEM, n = 3, signifikant forskel, * p. 0,05

Hæmning af CDA-2 til NF-KB-aktivering blev ophævet ved Over-ekspressionen af ​​TLR2

For yderligere at evaluere TLR2 signalering-medieret NF-KB-aktivering blev reguleret af CDA-2, vi udførte NFKB-drevet luciferasereportergen assay. Rekombinante adenovirusvektorer blev genereret koder TLR2 udtrykt i BMDM. TLR2 eller kontrol vektor inficeret BMDM blev inficeret med NF-KB luciferasereporterplasmid adenovirus. Begge inficeret BMDMs behandling med LLC-CM resulterede i signifikante stigninger i bindingen af ​​NF-KB til dens DNA konsensussekvens, som vist ved en stigning i luciferaseaktivering (fig. 7A). TLR2 inficeret BMDM viste en betydelig baseline aktiveringer af denne transskriptionsfaktor og højere værdier ved LLC-CM sammenlignet med kontrolværdierne (fig. 7A). Behandling af CDA-2 eller PG forårsagede signifikant fald i LLC-CM-induceret NF-KB-transaktivering i kontrol inficerede BMDM, mens der ikke er nogen ændring på reporter aktivitet ved CDA-2 eller PG i TLR2 inficerede celler (fig. 7A). I overensstemmelse med NF-KB transaktiveringsassays resultater, disse konstruktioner også produceret lignende virkninger på udtryk for TNFαand IL-6 (fig. 7B). Således er TLR2 udtryk hæmning af CDA-2 og dens komponent PG kræves for inaktivering af NF-KB i myeloide celler.

(A) BMDMs blev co-inficeret med TLR2 og NF-KB luciferasereportergen adenovirale konstruktioner . 24 timer efter infektion blev cellerne behandlet med SFM eller LLC-CM og /eller CDA-2 eller PG som angivet. Luciferaseaktiviteter blev bestemt 24 timer efter behandlingen. Data er vist som middelværdi ± SEM fold i forhold til kontrol. n = 3, signifikant forskel, * p 0,05; ns, ikke signifikant. (B) Induktion af inflammatoriske cytokin-mRNA i inficerede BMDMs som ovenfor beskrevet. Resultater er middeltal gange ændring ± SEM, n = 3, signifikant forskel, * p 0,05; ns, ikke signifikant.

Diskussion

Det vigtigste fund af den foreliggende undersøgelse er, at CDA-2, en urin forberedelse, hæmmer lunge tumorvækst via en myeloid celle mellemprodukt. CDA-2 reducerer inflammation i lungen gennem suppression af NF-KB-aktivering i myeloide celler associere med modulering af TLR2 signalering. Den vigtigste bestanddel af CDA-2, PG, vil kunne spille en afgørende rolle for anti-tumor effekt af CDA-2.

Denne undersøgelse direkte testede vigtige tumor inhibitoriske virkning af CDA-2 ved anvendelse af eksperimentel lunge tumormodeller. Tidligere undersøgelser havde vist, at CDA-2 er af potentiel værdi som anticancermiddel [3], [7]. CDA-2 er blevet undersøgt og har vist at inhibere væksten af ​​humane brystcancerceller, gliomceller, og humane leukæmiceller

in vitro

og

in vivo

[3], [7]. Klinisk CDA-2 viste signifikante effekter i at forbedre kemoterapi reaktioner i gliom, hepatoma, ikke-småcellet lungecancer, og patienter med brystkræft [7]. PG er en væsentlig bioaktivt bestanddel i CDA-2. Tidligere undersøgelser tyder på, at PG har et potentiale tumor inhiberende virkning, og det også er en vigtig bestanddel af antineoplaston AS2-1, en blanding af natriumsalte af phenyleddikesyre og PG, som er et anti-tumor lægemiddel [3], [22] . De foreliggende data først bekræfte, at CDA-2 behandling direkte resulterer i en vækststandsning af lungetumor og en forlænget levetid i mus indikerer det potente anti-tumor aktiviteten af ​​CDA-2 i inhibering af tumorvækst i en dosis-afhængig måde. Både proliferation-hæmning og apoptose-inducerende virkninger blev observeret i lungetumorer, som påvist ved immunhistokemi og western blotting-analyse. PG udviser også en direkte effekt på lungerne tumorvækst, og har lignende resultater af tumor hæmning som CDA-2. Disse resultater antydede, at CDA-2 kan være et potentielt terapeutisk middel til behandling af lungecancer og PG antages at bidrage størstedelen bioaktivitet CDA-2 på grund af høj procent (41%) og klare tumorsuppressionsaktivitet virkning.

tumoren mikromiljø spiller en afgørende rolle i tumor initiering og promotion og indeholder immunceller og bindevæv, såsom fibroblaster, endotelceller, pericytter og mesenkymale celler [23]. De hyppigst fundne immunceller i tumormikromiljøet er tumorassocierede makrofager (TAM’er). TAMer meste fremme tumorvækst og kan være obligatorisk for angiogenese, invasion, og metastase ved frigivelse af inflammatoriske cytokiner og chemokiner, og deres tilstedeværelse i lungekræft er blevet korreleret med dårlig prognose for patienter med lungecancer [24], [25] og andre resultater såsom øget mikrokar count [26]. Som dele af positive fremadkoblingssektioner loops, kemokiner produceret af TMAs tiltrække yderligere immune /inflammatoriske celler, herunder makrofager til tumormikromiljøet [27]. Vores data viser, behandling af CDA-2 eller PG resulterer i et fald i de samlede celler i BALF, som for det meste ramte makrofager, reduceret inflammation. Det er således sandsynligt, at CDA-2 inhiberer lunge tumor vækst gennem undertrykkelse af befolkningen i immune /inflammatoriske celler og inflammation i lungen.

Aktivering af NF-KB er ansvarlig for induktionen af ​​en række af målgener der er vigtige for tumorigenese [28], [29]. NF-KB-aktivering i inflammatoriske celler styrer produktionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, herunder TNFa, IL-1, IL-6 og IL-23, som medierer tumorpromotion og progression samt NF-KB-aktivering i tumorceller [ ,,,0],8], [11]. NF-KB-aktivering også findes i tumorceller, hvor det regulerer celleproliferation, overlevelse, angiogenese, invasion og metastase [30] – [32]. Den fremmende virkning af NF-KB-aktivering på lunge carcinogenese har allerede vist med forskellige tilgange og rapporteret af forskellige grupper, og udtømning af myeloid cellulær eller epitelial NF-KB synes at have en effekt i reduktion af lunge tumorigenese [9], [ ,,,0],33] – [36].