PLoS ONE: mangefacetteret Indlæg fra den Hsp90 Inhibitor Ganetespib (STA-9090) i cancerceller med Aktiveret JAK /STAT Signaling

Abstrakt

Der er akkumulerende beviser for, at dysreguleret JAK signalering forekommer i en lang række cancertyper. Især kan mutationer i JAK2 resultere i konstitutiv aktivering af STAT transkriptionsfaktorer og føre til onkogen vækst. JAK kinaser er etableret Hsp90 klient proteiner, og her viser vi, at romanen lille molekyle Hsp90 hæmmer ganetespib (tidligere STA-9090) udviser potent

in vitro

in vivo

aktivitet i en række af fast og hæmatologiske tumorceller, der er afhængige af JAK2 aktivitet for vækst og overlevelse. Notatet ganetespib behandling resulterer i vedvarende nedbrydning af JAK2, herunder konstitutivt aktive JAK2

V617F mutant, med efterfølgende tab af STAT aktivitet og reduceret STAT-target genekspression. I modsætning hertil behandling med den pan-JAK inhibitor P6 resultater i kun forbigående virkninger på disse processer. Yderligere differentiere disse former for indgreb, RNA og protein udtryk undersøgelser viser, at ganetespib derudover modulerer cellecyklus regulerende proteiner, mens P6 ikke. Samtidig virkning af ganetespib på både cellevækst og celledeling signalering oversætter til potent antitumor effekt i musemodeller af implanteret og formidlet JAK /STAT-drevet leukæmi. Samlet set vores resultater støtter Hsp90 hæmning som en ny terapeutisk tilgang til bekæmpelse af sygdomme afhængige af JAK /STAT signalering, med den multimodale virkning af ganetespib demonstrere fordele i forhold JAK-specifikke hæmmere

Henvisning:. Proia DA, Foley KP, Korbut T, Sang J, Smith D, Bates RC, et al. (2011) mangefacetteret Orientering ved Hsp90 Inhibitor Ganetespib (STA-9090) i cancerceller med Aktiveret JAK /STAT signalering. PLoS ONE 6 (4): e18552. doi: 10,1371 /journal.pone.0018552

Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians University, Tyskland

Modtaget: Januar 26, 2011; Accepteret: 4 marts 2011; Udgivet: 14 April, 2011

Copyright: © 2011 Proia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Alle forfattere er eller var medarbejdere i Synta Pharmaceuticals, Inc. og alle undtagen RC Bates og AF Rosenberg holde enten aktier eller optioner i Synta Pharmaceuticals, Inc. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

JAK2 er et ubikvitært medlem af Janus-kinase (JAK) familien af ​​ikke-receptortyrosinkinaser, som tjener til at mediere signalering nedstrøms for cytokin og vækstfaktorreceptorer [1]. Uhensigtsmæssig aktivering af JAK signalering ligger til grund celleproliferation og overlevelse i en række faste tumorer [2], [3] og hæmatologiske neoplasmer [4]. Især har en aktiverende punktmutation i JAK2 (JAK2

V617F) blevet beskrevet med høj frekvens i kroniske myeloproliferative sygdomme (MPD) [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10] og konstitutive JAK2 aktivering forårsaget af kromosomale translokationer er blevet rapporteret i forskellige typer af leukæmi [11], [12], [13].

Aktiveret cytokin-JAK komplekser rekruttere og phosphorylerer effektor molekyler, herunder Signal transducere og aktivatorer af transkription (STAT) proteiner [14]. STAT-proteiner medierer en lang række biologiske processer, herunder cellevækst, differentiering, apoptose, inflammation og immunreaktion [15]. To STAT’er især STAT3 og STAT5, repræsenterer de store substrater for JAK2 der styrer myelopoeisis [16], [17] og kan bidrage til cellulær transformation [18], [19]. Deres vedvarende aktivering, er blevet forbundet med øget tumorcelleproliferation, overlevelse, metastase og tumorfremmende inflammation i både faste og hæmatologiske tumorer [20]. Følgelig inhiberer denne signalering akse ved anvendelse af specifikke inhibitorer med små molekyler af JAK2 er for nylig blevet undersøgt som et punkt for terapeutisk indgriben i multiple humane tumor betegnelser [3], [21], [22], [23], [24] .

Heat shock protein 90 (Hsp90) er en molekylær chaperone kræves til post-translationel stabilitet af sine proteinsubstrater eller “klient proteiner”. Cancerceller indeholder forhøjede niveauer af aktiv Hsp90 [25] og, fordi mange klient proteiner spiller kritiske onkogene roller, cancerceller er særligt følsomme over for Hsp90 inhibition. Desuden er en unik egenskab ved at målrette Hsp90 er, at hæmning resulterer i den samtidige blokade af flere onkogene signalsystemer kaskader, overvinde potentielle pathway afskedigelser, og sensibiliserende kræftceller til kemoterapeutiske stoffer [26], [27], [28], [29]. , Hsp90 Således repræsenterer et attraktivt molekylære mål for udvikling af nye kræftmidler [28], [30], [31]. Af relevans her, er JAK kinaser etableret Hsp90 klienter tyder på, at Hsp90 hæmning kan være effektivt i behandling JAK-rettet neoplastiske lidelser [32], [33].

For at teste denne hypotese, vi har ansat den syntetiske lille molekyle inhibitor ganetespib (STA-9090), en resorcinol-holdig forbindelse relateret til geldanamycin, der binder i ATP-bindende domæne af Hsp90. I prækliniske undersøgelser har stoffet vist lav nanomolær aktivitet

in vitro

mod en bred vifte af menneskelige kræftceller og potent antitumor effekt mod menneskelige xenograftmodeller [34], [35]. Ganetespib er i øjeblikket i kliniske forsøg for både solide tumorer og blodkræftsygdomme. Her viser vi, at ganetespib potent inducerer apoptose i en række forskellige tumorlinjer afhængige af vedvarende JAK /STAT signalering for vækst og overlevelse. Vi demonstrerer endvidere, at stoffet også ændrer mange elementer af cellecyklus regulering i cancerceller, en aktivitet fraværende fra en JAK-specifik inhibitor.

In vivo

, ganetespib os koordinere indvirkning på både cellevækst og celledeling resulterer i potent antitumoraktivitet i JAK /STAT-drevne modeller af menneskelig leukæmi. Således hæmning af Hsp90 aktivitet repræsenterer en lovende metode til bekæmpelse af sygdomme afhængige konstitutive JAK /STAT signalering, med ganetespib demonstrerer potentielle terapeutiske fordele i forhold JAK-specifikke inhibitorer.

Resultater

Ganetespib hæmmer JAK2- medieret signaltransduktion og proliferation i hæmatologiske kræftformer

med lav nanomolær potens, ganetespib reduceret cellulær levedygtighed i en gruppe af menneskelig hæmatologiske og solide tumorcellelinier udvalgt til deres afhængighed af JAK /STAT signalering og varierende kræft type (fig. 1A). I hver af de testede linjer, ganetespib var mere potent end ansamycinet Hsp90 inhibitor 17-AAG. Notatet ganetespib var større end 100 gange mere potent end 17-AAG i SET-2 og HEL92.1.7 leukæmi celler, cellelinjer huser konstitutivt aktive JAK2

V617F mutationer, der fungerer som deres onkogene chauffører.

(a) SET-2, HEL92.1.7, MV4-11 blev NCI-H1975 og DU145 celler behandlet med ganetespib eller 17-AAG over et bredt dosisområde (,0001-1 uM) i 72 timer og levedygtighed celle vurderet af Alamar blåfarvning. (B) Ganetespib udviser mere holdbare inhibering af JAK /STAT signalering forhold til P6. HEL92.1.7 celler blev dyrket i nærvær af 250 nM ganetespib eller 1.000 nM P6 og høstet mellem 0 og 48 timer. Ekspressionsniveauer af de angivne proteiner blev bestemt ved western blot. (C) Ganetespib er signifikant mere potent end 17-AAG. SET-2-celler blev doseret med de angivne koncentrationer af ganetespib eller 17-AAG i 24 timer og analyseret for at bestemme JAK /STAT protein og målniveauer ved hjælp af antistoffer angivet.

Brug af HEL92.1.7 celler sammenlignede vi JAK /STAT inhiberende aktivitet af ganetespib til forbindelsen pyridon-6 (P6) [36], en reversibel, ATP-kompetitiv pan hæmmer af Jaks (fig. 1B). Ganetespib og P6 hver blokeret JAK2 afhængig signalering, som det fremgår af tabet af phospho-STAT3 og phospho-STAT5, og ERK-signalering. Imidlertid ganetespib var mindst fire gange mere potent og undertrykt STAT signalering længere sammenlignet med P6. Ganetespib behandling alene førte til de målrettede, proteasom-afhængige (data ikke vist) tab af JAK2 og phospho-AKT proteinniveauer (fig. 1B), begge Hsp90 klient proteiner. Således ganetespib behandling resulterer i vedvarende inhibering af multiple oncogene mål i disse cellulære modeller af JAK2-drevet malignitet. Lignende virkninger på JAK /STAT signalering blev set med SET-2-celler, hvor 50 nM ganetespib var i stand til at destabilisere JAK2 tilstrækkeligt til at resultere i tab af aktiverede (

dvs

, fosforyleret) STAT3 og STAT5 udtryk (Fig. 1C ). 17-AAG viste sammenlignelige virkninger som ganetespib men var 200 gange mindre potent, i overensstemmelse med de levedygtighed data beskrevet ovenfor. Tilsammen viser disse data, at ganetespib besidder overlegen JAK /STAT hæmmende aktivitet til både P6 og 17-AAG i form af potens eller varighed af respons.

Ganetespib ophæver JAK /STAT signalering i solide tumorer

Ud over sin forekomst i hæmatologiske maligniteter, onkogen STAT aktivering er også udbredt i en række faste tumorer. For eksempel er vedvarende aktiveret STAT3 fundet i 50% af lunge-adenocarcinomer og er primært observeret i tumorer indeholdende mutationer i den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) [37], [38]. NCI-H1975 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie udtrykker Hsp90 klient EGFR

L858R /T790M, et konstitutivt aktiveret og erlotinib-resistent form for EGFR, og ganetespib behandling resulterede i en dosis-afhængigt fald i EGFR ekspression i disse celler (fig. 2A). Desuden ganetespib inducerede også potent nedbrydning af JAK2 og tab af phosphoryleret STAT3 i en dosis-afhængig måde. Inaktivering af AKT og GSK3p, proteiner vigtige i reguleringen apoptose, blev observeret med et lignende dosisrespons til den for JAK2 /STAT3 signalering. For nylig blev det vist, at JAK2 kan modulere aktiviteten af ​​yderligere apoptotiske regulatorer såsom BAD og BCL-XL for at fremme celleoverlevelse [21]. Konsistent med dette har vi bemærket en ledsagende reduktion i niveauerne af phosphoryleret BAD (fig. 2A), hvilket således reducerer den pro-apoptotiske aktivitet af dette protein. Disse data antyder en potentiel mekanisme til at redegøre for den cytotoksiske respons observeret med ganetespib behandling (fig. 1A).

(A) Client protein nedregulering i NSCLC. NCI-H1975-celler blev doseret med de angivne koncentrationer af ganetespib i 24 timer og deres cellelysater analyseret for at bestemme JAK /STAT og Hsp90 client protein niveauer ved hjælp af antistofferne angivet. (B) Ganetespib blokerer IL-6 inducerede og konstitutive STAT3 aktivitet i NSCLC celler. HCC827 lungecancerceller blev behandlet med stigende koncentrationer af ganetespib eller P6 i 24 timer efterfulgt af en 15 min stimulering med eller uden 50 ng /ml humant rekombinant IL-6. Niveauerne af JAK2, total og phospho-STAT3, og PIM2 blev analyseret ved western blot. GAPDH indgår som en belastning kontrol. (C) Client proteinnedbrydning i prostatacancerceller. DU145 celler blev doseret med graduerede koncentrationer af ganetespib i 24 timer og cellelysater underlagt western blot for at bestemme JAK /STAT og målprotein niveauer ved hjælp af antistofferne angivet. (D) Funktionel Hsp90 er påkrævet for JAK2, men ikke JAK1, stabilitet i DU145-celler. DU145-celler blev behandlet med DMSO (kontrol, C), 15 nM, 60 nM eller 240 nM ganetespib i enten 24 eller 48 timer og lysater probet ved Western blot med de angivne antistoffer.

JAK /STAT signalering akse er en vigtig modulator af cytokin signalering og en foreslået mekanisme for afvigende STAT3-aktivering i lungekræft involverer opregulering af autokrin og /eller parakrin IL-6-signalering [2]. Derfor har vi undersøgt, om ganetespib kunne hæmme denne signalering i NSCLC celler. I fravær af ekstern ligand, HCC827 celler behandlet med ganetespib udviste en dosisafhængig formindskelse i JAK2-ekspression, hvilket fører til et tab af STAT3-aktivitet og ekspression af den nedstrøms STAT target PIM2 (fig. 2B). Biokemisk inhibering af JAK2 af P6, omend ved højere koncentrationer, ligeledes nedreguleres konstitutiv STAT3 aktivitet, men påvirkede ikke total JAK2 proteinniveauer. Tilsvarende begge forbindelser blokeret JAK /STAT signalering stimulation når pathway blev aktiveret ved exogent IL-6 behandlinger (fig. 2B).

dysreguleret IL-6 /JAK2 signalering har også været impliceret i prostatacancer tumorigenese [39 ], [40]. Den DU145 prostatakræft cellelinie udtrykker en autokrin IL-6-signalering sløjfe [41] og blev for nylig rapporteret at være følsomme over for virkningerne af en ny lille molekyle JAK2-hæmmer

in vitro

in vivo

[3], [41]. Ganetespib var en potent inducer af celledød i denne linje (fig. 1A). Biokemisk karakterisering af DU145 celler afslørede lignende hæmmende effekt på JAK2 signalering følgende ganetespib behandling (Fig. 2C). blev observeret tab af JAK2, phospho-STAT3 og phospho-SHP2-, en JAK2 interagerende phosphatase vigtigt for JAK2 signaltransduktion, efter tilsætning af ganetespib. Interessant nok blev den relaterede JAK1 kinase udtrykt i denne cellelinie ikke målrettet til nedbrydning, men i stedet viste sig at stige efter ganetespib eksponering (fig. 2D). Lignende resultater blev opnået for PC-3 prostatacancer-cellelinie (data ikke vist). Disse data viser, at selektiv nedbrydning af JAK2 i DU145 prostata celler var tilstrækkelig til at ophæve efterfølgende aktivering af STAT3 signalering.

Hsp90 hæmning nedregulerer transskription af JAK /STAT signalering mål og cellecyklus gener

I HEL92 .1.7 erythroleukæmi celler, biokemisk hæmning af JAK2 af P6 behandling resulterede i et tab af cellulær levedygtighed, men med 30 gange mindre styrke end ganetespib (IC

50 værdier 600 vs 20nM) (fig. 3A). At sammenligne den cellulære virkning af hver inhibitor, vi først identificeret betingelser, hvorunder JAK2 aktivitet blev reduceret til tilsvarende niveauer ved hvert lægemiddel baseret på deres kinetiske og potens forskelle. Som illustreret i figur 3B, 4 timers P6 (1000 nM) og 24 timers ganetespib (250 nm) behandlinger blev valgt på grund af sammenlignelige virkninger på STAT3 /5 signalering. RNA-ekspression profilering på disse tidspunkter afsløret, som forventet, at mange JAK /STAT målgener (såsom SoCs og PIM familiemedlemmer) blev nedreguleret ved begge lægemidler (fig. S1, tabel S1). Imidlertid blev yderligere gener ændres ved ganetespib behandling, der var upåvirket i P6-behandlede celler (fig. 3 C, D). Udover fører til den forventede opregulering af talrige varmechokprotein gener, ganetespib behandling også selektivt ændret ekspression af et stort sæt af gener involveret i cellecyklus-aktiviteter, herunder DNA-replikation og reparation (BRCA1 /2), cellecyklusregulering (CDC2 , Cdc25), centrosom /spindel aktiviteter (BUB1 /3, CENPE /M, KIF14, FAM33A), kromosomkondensering (TOP2A, NCAPG), og replikation (RFC3 /4, MCM familie) (fig. S1). Faktisk analyse af de ændrede gener ved hierarkisk klyngedannelse og berigelse score afslørede, at modulatorer af celledeling var de mest fremtrædende processer mindsket med ganetespib behandling (tabel 1).

(A) Sammenlignende effekter af ganetespib og P6 på HEL92 .1.7 tumor cellelevedygtighed. HEL92.1.7 celler blev behandlet med ganetespib eller P6 over et bredt dosisområde (0,0001 til 10 uM) i 72 timer og cellelevedygtighed vurderes af Alamar blue. (B) Temporal og dosisafhængige virkninger på JAK /STAT-mål ved ganetespib og P6. HEL92.1.7 celler blev behandlet med ganetespib eller P6 til 4 og 24 timer og cellelysater omfattet western blot for at bestemme JAK2 /STAT og target-proteinniveauer ved anvendelse af de viste antistoffer. (C) Affymetrix GeneChip analyse af celler behandlet med ganetespib og P6. HEL92.1.7 celler behandlet med 250 nM ganetespib i 24 timer eller 1000 nM P6 i 4 timer. Genekspressionsniveauer i DMSO behandlet (dvs. vehikelkontrol) celler (X-akse) tegnes mod dem af lægemiddelbehandlede celler (y-akse). (D) Venn diagram over antal gener forskelligt reguleret af ganetespib og P6.

Modulation af cellecyklus proteinekspression ved ganetespib inducerer vækst anholdelse

For at udvide disse resultater, vi kiggede eksperimentelt på virkningerne på cellecyklus. Ganetespib inducerede en tidsmæssig G

1 og G

2 /M anholdelse i HEL92.1.7 celler, med ledsagende tab af S-fasen (fig. 4A). I modsætning hertil P6 behandling induceret akkumulering i G

1 fase kun, uden tab af S-fasen eller G

2 /M anholdelse. Vi undersøgte også de målrettede virkninger ganetespib på kritiske formidlere af cellecyklus division på proteinniveauet. Vi observerede reducerede proteinniveauer af cyclin-afhængig kinase 1 (Cdk-1), en central regulator af G

2 /M checkpoint, efter en 24 timers eksponering for ganetespib, en effekt, der varede indtil mindst 48 timer (fig. 4B). I modsætning hertil P6 havde ingen effekt på Cdk1 ekspression. Yderligere blev niveauet af phospho-Chk2, anden integrerende checkpoint kinase, reduceret med ganetespib behandling. Lignende resultater blev fundet for phospho-Chk1 (data ikke vist). Som vist i figur 4C, blev destabilisering af cyclin kinaser også forbundet med en tidsmæssig ophobning af cycliner A1 og B1 i afhængighed narkotikamisbrug. Desuden blev disse virkninger af ganetespib på både JAK2 /STAT signalering og cellecyklus regulering observeret i andre typer cancer, herunder bryst (MCF-7), gastrointestinale stromale (GIST882), pancreas (HPAF) og prostata (DU145) tumorcellelinjer ( fig. 4D). Samlet set har disse yderligere påvirkninger af celledeling maskiner antyder, at ganetespib besidder besluttet fordele i forhold JAK-specifikke inhibitorer til styring STAT-drevne cancerformer.

(A) HEL92.1.7 celler blev behandlet med 250 nM ganetespib eller 1.000 nM P6 (eller DMSO som kontrol) og cellecyklusfordeling bestemt ved flowcytometri ved 3, 5, 9 og 24 timer efter behandling. (B) HEL92.1.7 celler blev doseret med ganetespib (250 nM) eller P6 (1000 nM) i 48 timer. Celler blev høstet ved de angivne tidspunkter og niveauer af total og phospho-Cdk1, phospho-Chk2 og GAPDH analyseret af western blot. (C) Kinetik af ganetespib virkninger på JAK /STAT og cellecyklus proteinekspression. HEL92.1.7 celler blev behandlet med 100 nM ganetespib, høstet med timeintervaller over en 11 h tidsforløbet, og underkastet western blot med de angivne antistoffer. (D) MCF-7, GIST882, HPAF og DU145 celler blev doseret med graduerede koncentrationer af ganetespib i 24 timer og analyseret ved western blot med de angivne antistoffer.

Ganetespib forlænger overlevelse i en JAK2

V617F-mutant musemodel af menneskelig leukæmi

for at bestemme, om disse to aktiviteter ganetespib på JAK2 /STAT signalering og cellecyklusprogression observeret

in vitro

oversætte til antitumor effekt

in vivo

, vi etableret en ortotopisk leukæmi model med HEL92.1.7 celler. Dette resulterede i dissemineret sygdom med sygelighed typisk resultatet af bagbensparalyse forårsaget af rygradsdelene metastaser (data ikke vist). For at undersøge effekten af ​​ganetespib på overlevelse, begynder en dag efter tumor celle implantation, blev stoffet doseret intravenøst ​​på sit højeste ikke-alvorligt toksisk dosis (HNSTD) på 25 mg /kg på en 5 × /ugeskema gennem dagen 19. Som vist i figur 5A, ganetespib behandling mere end fordoblet median samlet overlevelse (. 76,5 dage

vs

34 dage,

P

0,0001). Den ganetespib behandlingen var veltolereret, med ingen signifikant tab af kropsvægt fundet efter 3 ugers dosering (fig. S2). Den øgede overlevelse af de behandlede dyr korreleret med faldt dramatisk tumorceller byrde i deres knoglemarv og rygmarven, som bestemt ved histologisk analyse (fig. 5B).

(A) Kaplan-Meier analyse af den samlede overlevelse i en leukæmi model oprettet ved iv injektion af HEL92.1.7 celler i SCID-mus, hvilket resulterede i udviklingen af ​​dissemineret sygdom. Begyndende en dag efter tumor celle implantation, ganetespib var i.v. doseret ved sin HNSTD (25 mg /kg) på en fem-gange om ugen tidsplan i 3 uger og med dag 19 (n = 10 /gruppe). *

P

0,0001; 2-sidet log-rank test. (B) Ganetespib dramatisk inhiberer tumorcelle byrde i rygmarven og tilstødende knoglemarv. Immunohistochemistical farvning (H 200 × i de lavere paneler.

Ganetespib udviser potent

in vivo

effekt i STAT5 drevet AML xenografter

MV4-11 akut myeloid leukæmi celler udtrykker konstitutive STAT5 aktivitet som følge af en intern tandemduplikation (ITD) mutation i FLT3-receptor-tyrosinkinase, en anden Hsp90 client protein [42] og, som sådan, repræsenterer en alternativ model af STAT-drevet onkogenese. Disse celler er meget følsomme over for ganetespib

in vitro

(fig. 1A) og vi vurderede deres dosis-respons på ganetespib behandlinger i xenotransplantater. Ganetespib blev intravenøst ​​administreret til tumorbærende SCID-mus ved enten daglig eller ugentlig HNSTD på 25 mg /kg eller 150 mg /kg. Som vist i figur 6A, med ugentlig behandling tidsplan resulterede i signifikant og dosisafhængig tumorvækstinhibering, mens den daglige dosisregimen (25 mg /kg 5 × /uge, som anvendt i den ortotopisk model ovenfor) resulterede i signifikant tumorregression ( 84%). I begge doseringsregimer blev tumorvækst undertrykt i op til en uge eller mere når behandlingen ophører. Efter denne periode, som det fremgår af den engang per ugers behandling kohorte, tumorvækst kunne re-initiere.

(A) SCID-mus blev subkutant implanteret med MV4-11 akut myeloid leukæmi-celler. Mus med etableret MV4-11 xenografter (100-200 mm

3, n = 8 mus /gruppe) blev intravenøst Doseret (pilespidser) med ganetespib på enten 25 eller 150 mg /kg en gang ugentligt i 3 uger, eller ved HNSTD på 25 mg /kg fem gange om ugen, som angivet. % T /C-værdier er angivet til højre for hver vækstkurve og fejlen barer er den S.E.M. (B) ganetespib hæmmer STAT-5 phosphorylering og Cdk1 udtryk i tumorxenoplantater i SCID-mus. SCID mus, der bærer MV4-11 tumorer (n = 4 mus /gruppe) blev behandlet med vehikel eller ganetespib på enten 25 mg /kg eller 150 mg /kg ved de angivne tidspunkter mellem 6 timer og 144 timer (6 dage). Tumorer blev resektion og niveauerne af p-STAT5, Cdk1, Hsp70 og GAPDH blev bestemt ved western blot.

For at bestemme, om disse tumor respons korreleret med target modulation

in vivo

, yderligere mus med MV4-11 xenotransplantater blev behandlet med en enkelt dosis af bærer alene eller ganetespib på 25 eller 150 mg /kg. Tumorer blev høstet mellem 6 og 144 timer senere og farmakodynamiske analyse blev udført ved at undersøge ekspressionsniveauerne af phospho-STAT5, Cdk1 og Hsp70 (fig. 6B). I overensstemmelse med den

in vivo

tumorvækst data blev dosisafhængige virkninger på varigheden af ​​målet hæmning inden for tumorer observeret. En enkelt 150 mg /kg dosis af ganetespib undertrykt aktivering af STAT5 og undertrykt udtryk for Cdk1 i mere end tre dage, i overensstemmelse med dens effektivitet i dosering én gang pr uge. Ved 25 mg /kg, blev potent inhibering af STAT5 aktivitet opnået inden for 6 timer, som var tab af Cdk1 24 h efter ganetespib administration. Af note, STAT5 aktivitet genvindes i disse tumorer ved 24 timer, mens Cdk1 ekspression forblev undertrykt gennem mindst 48 timer selv med denne lave dosis (fig. 6B). Mens det relativt hurtig genopretning af STAT5 aktivering skulle have tilladt tumoren at genstarte vækst, vises mere holdbart undertrykkelse af cellecyklussen regulatorer at have holdt væksten af ​​tumorerne arresteret indtil næste dosering lægemiddel. Disse resultater giver stærke beviser for, at koordinere tabet af cellevækst og celledeling signaler orkestreret af ganetespib konto for den potente anti-tumor aktivitet af lægemidlet i denne model.

Diskussion

Vedvarende JAK /STAT-aktivering er onkogen og karakteristisk for mange menneskelige maligniteter og derved giver et attraktivt punkt for intervention for molekylært målrettede lægemidler. I denne undersøgelse, viser vi, at ganetespib har dyb antitumoraktivitet i en vifte af JAK /STAT-drevne kræftformer og vigtigere, kan ophæve afvigende signalering via flere mekanismer. Ganetespib effektivt rettet mod opstrøms regulator JAK2, herunder konstitutivt aktive JAK2

V617F mutant, for nedbrydning i en række hæmatologiske og solid tumor typer med efterfølgende langvarig tab af STAT3 og STAT5 signalering. Resultaterne ikke kun understrege patogen rolle af STAT signalering i tumorigenese, men understøtter den potentielle terapeutiske anvendelighed af ganetespib for en række forskellige humane cancere. I denne henseende sustained inhibering af JAK2 /STAT signalering akse opnås ved ganetespib var mere effektiv end den, der ses med det pan-JAK-inhibitor P6, og ganetespib var ensartet mere potent end ansamycinet baseret Hsp90 inhibitor 17-AAG i vores assays.

Mens JAK2 mutation er en fælles middel til at stimulere onkogen STAT aktivitet, forstyrrelser i andre signalsystemer net, såsom dem medieret af EGFR, IL-6 /IL-6R eller FLT3, kan også bidrage til aktiveret STAT signalering i cancerceller [2], [43]. Vores resultater viser, at Hsp90 inhibering effektivt forstyrrer disse samt, med ganetespib kraftigt nedbrydende EGFR og blokerer både IL-6- og FLT3-medieret aktivering af STAT-proteiner. Således, mens ganetespib direkte pålægger sine farmakologiske virkninger på Hsp90, downstream konsekvenser klart indebære en væsentlig vifte af klient proteiner og biokemiske veje. På denne måde kan Hsp90 inhibering med ganetespib ses som en multi-nodal modalitet snarere end en målspecifik terapeutisk tilgang, som den fremkaldt af en JAK2 eller anden kinase inhibitor (figur 7). Salg

Ganetespib øver potente antitumor virkninger gennem forstyrrelse af flere signalleringskaskader, herunder JAK /STAT signalering akse og cellecyklus mediatorer. (A) The JAK /STAT pathway er en vigtig signalering mekanisme for en bred vifte af cytokiner og vækstfaktorer. Hyperaktivering af denne vej, gennem ligand aktiveret receptortyrosinkinaser (EGFR eller FLT3), cytokin-medieret aktivering af JAK2 eller aktiverende mutationer såsom JAK2

V617F, er ofte forbundet med onkogenese. Regulering af cellens cyklus involverer en række højt koordinerede og essentielle processer, herunder checkpoint kontrol og afsløring /reparation af genetiske skader, kritisk for korrekt progression og celledeling. (B) Inaktivering af Hsp90 ved ganetespib resulterer i proteasomet-medieret nedbrydning af de opstrøms signalsystemer komponenter (angivet med gråt) kritisk for STAT, MAPK og AKT aktivering, hvilket resulterer i væksthæmning. Desuden samtidig nedregulering af centrale cellecyklus-regulerende gener induceret af ganetespib (som vist i tabel 1) resulterer i standsning af cellecyklus i G

1 og G

2 /M-faser af cellecyklus og efterfølgende tab af S-fasen.

i yderligere støtte for denne, mens både ganetespib og P6 ændre et fælles sæt af JAK /STAT-mål, kun ganetespib behandling udøvede samtidig effekt på cellecyklus regulerende maskiner. I de leukæmiceller data præsenteret, udsættelse for ganetespib resulterede i G

1 og G

2 /M anholdelse, dels gennem nedbrydningen af ​​Cdk1 og atypisk ophobning af cycliner A1 og B1. Endvidere blev S-fase ophævet. Ud over gener associeret med DNA-replikation og cellecyklussen, flere komponenter af centrosom og spindel blev påvirket på det transskriptionelle niveau ved ganetespib, i overensstemmelse med tidligere fund, at disse komponenter er syntetiseret i S-fasen, og at Hsp90 er afgørende for centrosom samling [44], [45]. Vigtigere var dette en generel respons i alle celler undersøgt, som vi observerede lignende kombinatoriske virkninger på JAK /STAT inhibering med tab af cyclin-afhængig kinase aktivitet i AML, bryst-, gastrointestinal stromal, pancreas og prostata tumortyper.

Ganetespib viste også potente

in vivo

aktivitet. I mus med etablerede MV4-11 (STAT5-drevne) xenografter, ugentlig administration af ganetespib signifikant hæmmede tumorvækst i en dosisafhængig måde. Desuden er en daglig dosering tidsplan for ganetespib var også meget effektiv og resulterede i signifikant tumorregression under administration af lægemidlet. I denne model tumorvækst vises igen omkring en uge efter lægemiddelbehandlingen blev standset (for den høje dosis, 1 × /week kohorte). Vigtigt er det, viste vores farmakodynamisk analyse, at disse tumor respons korreleret med graden og varigheden af ​​STAT5 og Cdk1 protein tab induceret af de forskellige doseringsregimer. Den stramme binding af STAT5 nedregulering med inhibering af tumorvækst seks timer efter lægemiddelindgivelse ved hver dosis indikerer den hurtige reaktion af denne signalvej til lægemiddelindgivelse. Ved 150 mg /kg dosis, STAT5 signalering, men ikke Cdk1 udtryk, returneres af seks dage. Den vedvarende tab af Cdk1 og andre cellecyklusproteiner formentlig fastholder cellecyklusstandsningen og forhindrer vækst fra re forekommende mellem doserne på ugeskema, selv ved tilstedeværelse af re-emergent STAT5 aktivitet. Tilsvarende blev Cdk1 ekspression undertrykkes længere sammenlignet med STAT5 på /kg dosis 25 mg, og vil sandsynligvis forklare den potente aktivitet af ganetespib på hyppigere 5 × /week regimen. Disse data tyder på, at ganetespib administration på begge tidsplan var tilstrækkelig til at afskaffe både overlevelse og celle vækst signaler længe nok til at forhindre tumorvækst. Fordi ganetespib formentlig fører til tab af endnu flere klient proteiner, dets potente antitumoraktivitet sandsynligvis afspejler dens samlede indvirkning på disse yderligere målproteiner så godt.

I et system, der mere præcist efterligner patologien for leukæmiske sygdom, den effekten af ​​ganetespib blev også evalueret i et dissemineret sygdom model med HEL92.1.7 celler. Ganetespib effektivt øget overlevelse i denne ortotopisk model, mere end en fordobling af den gennemsnitlige overlevelsestid for mus. Langvarig overlevelse var forbundet med dramatisk reduceret tumorbelastning i knoglemarven, hvilket fremgår af faldt betydeligt infiltration af humane leukæmiceller og reduceret rygradsdelene metastaser. Kollektivt, disse data er i overensstemmelse med en direkte virkning af ganetespib på leukæmisk cellevækst

in vivo

og demonstrere den potentielle terapeutiske anvendelighed af dette stof for JAK2

V617F-drevne maligniteter.

årsagssammenhæng mellem konstitutiv JAK2 aktivitet og neoplasi har resulteret i udviklingen af ​​en række potente og selektive JAK2 småmolekylære inhibitorer [46].