PLoS ONE: Den Proteomics af tyk- og endetarmskræft: Identifikation af et protein Signatur associeret med Prognose

abstrakt

kolorektal cancer er en af ​​de hyppigste typer cancer, og der er behov for identifikation af prognostiske biomarkører. I denne undersøgelse protein er blevet etableret udtryk profiler for tarmkræft og normal colon mucosa ved proteomics ved at kombinere todimensional gelelektroforese med friske frosne snit af parrede Dukes B kolorektal cancer og normal colorektal mucosa (n = 28), gel billedanalyse og højtydende væskekromatografi-tandem-massespektrometri. Hierarkisk klyngeanalyse og principal komponenter Analysen viste, at protein udtryk profiler af kolorektal cancer og normale tyktarmsslimhinde grupperet i særskilte mønstre af protein-ekspression. Femogfyrre proteiner blev identificeret som viser mindst 1,5 gange forøget ekspression i kolorektal cancer og identiteten af ​​disse proteiner blev bekræftet ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri. Femten proteiner, der viste forøget ekspression blev valideret ved immunhistokemi hjælp af en velkarakteriseret kolorektal cancer væv microarray indeholder 515 primær kolorektal cancer, 224 lymfeknude metastaser og 50 normale colon slimhinder prøver. Proteinerne, der viste den største grad af overekspression i primær colorektal cancer sammenlignet med normal colon mucosa var varmechokprotein 60 (p 0,001), S100A9 (p 0,001) og translatorisk reguleret tumor protein (p 0,001). Analyse af proteiner individuelt identificeret 14-3-3β som prognostisk biomarkør (χ

2 = 6,218, p = 0,013, HR = 0,639, 95% CI 0,448-0,913). Hierarkisk klyngeanalyse identificeret forskellige fænotyper forbundet med overlevelse og en to-protein signatur består af 14-3-3β og aldehyd dehydrogenase 1 blev identificeret som viser prognostisk betydning (χ

2 = 7,306, p = 0,007, HR = 0,504, 95 % CI 0,303-0,838), og der forblev uafhængigt prognostiske (p = 0,01, HR = 0,416, 95% CI ,208-,829) i en multivariat model

Henvisning:. O’Dwyer D, Ralton LD, O ‘ Shea a, Murray GI (2011) De Proteomics af tyk- og endetarmskræft: Identifikation af et protein Signatur associeret med Prognose. PLoS ONE 6 (11): e27718. doi: 10,1371 /journal.pone.0027718

Redaktør: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Canada

Modtaget: September 8, 2011; Accepteret: 23. oktober 2011; Udgivet: November 18, 2011

Copyright: © 2011 O’Dwyer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af midler fra Foreningen for International Cancer Research (www.aicr.org.uk), NHS Grampian og The University of Aberdeen Development Trust (www.abdn.ac.uk/giving). Udviklingen af ​​kolorektal cancer væv microarray blev støttet af skotske Academic Health Sciences Samarbejde finansieret af Chief Scientist Office of Den skotske regering (www.cso.scot.nhs.uk/SuppScience/SAHSC.11.html). DO’D oppebar en bachelor forskning stipendium fra The Patologisk Society (www.pathsoc.org) at iværksætte en indskudt BSc Med Sci grad. Aberdeen Proteome Facility (www.abdn.ac.uk/ims/proteomics/) finansieres i fællesskab af Bioteknologi og Biological Sciences Research Council, skotske Funding Rådet og University of Aberdeen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i den vestlige verden kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige form for kræft og den anden hyppigste årsag til kræft død [1]. Worldwide en million mennesker hvert år vil udvikle CRC og forekomsten af ​​denne tumor er stigende [1]. De fleste tilfælde af CRC er sporadiske følge af ophobning af somatiske genetiske afvigelser og er forbundet med en række miljømæssige risikofaktorer [1], [2]. Den resterende del af tilfældene involverer en familiær genetisk komponent. Talrige genetiske afvigelser akkumulere herunder inaktivering af adenomatøs polypose coli tumorsuppressorgen og aktivering af onkogener såsom K-ras, sletning af kromosom 18q og amplifikation af 20q [1], [3]. Kumulativt disse genetiske ændringer råd til tumor antiapoptotiske, pro-angiogene og proliferative egenskaber. For nylig er det blevet accepteret, at CRC er en genetisk heterogen sygdom og to forskellige veje for carcinogenese er blevet identificeret. Af sporadisk CRC, 85% skyldes kromosomal ustabilitet og de resterende 15% fra mikrosatellit ustabilitet [3]. Snarere end forekommer som en lineær flertrinsproces, colorektal carcinogenese er mere tilbøjelige til at være resultatet af det komplekse samspil mellem flere mutationsbegivenheder veje. Dette kan til dels forklare den kliniske heterogenitet af denne sygdom og den store forskel ses i resultatet mellem de enkelte patienter [2]. Dette understreger den klare krav om at have forfinet metoder til klassificering og kategorisering tarmkræft ved at identificere og validere passende biomarkører.

Molekylære biomarkører kan kategoriseres ved deres evne til at støtte forebyggelse, fremme tidlig påvisning, etablere prognose og forudsige respons patient til specifikke terapier [4], [5]. Opdagelsen af ​​biomarkører vil også hjælpe til forståelsen af ​​de biologiske mekanismer bag sygdomsudvikling og progression. Mens genomforskning herunder Epigenomics og transcriptomics har været indflydelsesrige i biomarkør opdagelse, betyder studere gener og genekspression ikke præcist afspejler mængden af ​​protein udtrykt i cellen. Derudover proteiner undergår mange post-translationelle modifikationer, som kan påvirke deres aktivering, interaktion og fungerer i en celle. Proteomics, som er den globale undersøgelse af proteiner har en central rolle i den potentielle identifikation af tumorassocierede biomarkører [6], [7]. Forholdet mellem individuelle tumor biomarkører og kolorektal cancer er blevet omfattende undersøgt og undersøgelser har inkluderet biomarkører repræsenterer gener og proteiner involveret i mange aspekter af tumorudvikling og progression herunder tumorinvasion og metastase, cellecyklusregulering, vækstfaktorer og apoptose associerede proteiner [5] [8] -. [26]

i denne undersøgelse har vi brugt komparativ proteomiske analyse (todimensionalt gelelektroforese, billedanalyse af geler og massespektrometri) for at identificere proteiner, som er over-udtrykt i kolorektal cancer, sammenlignet med morfologisk normal colorektal slimhinde. Overudtrykt proteiner er blevet valideret af immunhistokemi hjælp af en stor velkarakteriseret sæt af tarmkræft og et protein signatur i forbindelse med prognose identificeret.

Metoder

To dimensional (2D) gelelektroforese

2D-gelelektroforese blev udført ved anvendelse matchede par af frisk frosset Dukes ‘B coloncancer og morfologisk normale colon-mucosa (blind- og colon ascendens, n = 15 og sigmoid colon n = 13) som beskrevet tidligere [20] – [22], [ ,,,0],27]. Alle sager blev udvalgt fra Aberdeen kolorektal tumor bank og de klinisk-patologiske detaljer i de prøver, der anvendes til proteomics er angivet i tabel 1. Ingen af ​​patienterne havde fået kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. På indsamling, blev både tumor og normal kolorektal slimhinde dissekeret fra kolorektal cancer excision prøver inden for 30 minutter kirurgisk fjernelse, og straks frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C inden analyse.

Frosne snit (20 um tykkelse, n = 30) af hver prøve blev skåret og solubiliseret i lysepuffer [27]. Et afsnit (10 um tykkelse) fra hver prøve blev farvet med hæmatoxylin og eosin og den morfologiske diagnosen bekræftet ved lysmikroskopisk undersøgelse. Efter solubulisation blev prøverne centrifugeret til fjernelse af uopløseligt cellulært debris og behandlet med DNAse. 2D-gelelektroforese blev udført to gange for hver prøve under anvendelse 13 cm pI3-10 ikke-lineære Immobilon strimler (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) med proteiner adskilles ifølge ladning (300 V, 6 minutter, 3500 V, 90 min , 3500 V, 300 min), og efterfølgende molekylvægt (100 V, 25 mA pr gel i 60 minutter). Efter gennemførelsen af ​​elektroforese blev geler farvet med coomassie blå for at visualisere proteiner pletter.

Gel billedbehandling og analyse

De geler blev derefter scannet for at producere 256 grå skala 24 bit billeder, der blev gemt som TIFF-filer. De afbildede geler blev analyseret ved hjælp Progenesis SameSpots software (ikke-lineær dynamik, Newcastle upon Tyne, UK). Alle gel billeder blev importeret til Progenesis SameSpots til analyse. vurdering Billedkvalitet blev også gjort brug af SameSpots software til at sikre, at alle billederne var i det korrekte format til analyse og havde ingen andre problemer, der kan forstyrre efterfølgende billedanalyse. Alle geler blev oprindeligt automatisk justeret på én henvisning gel med analyse software, derefter manuelt justeret for at sikre korrekt tilpasning af alle geler, så alle pletter at blive opdaget, normaliseret og matches alle geler. Genstande (fx støvpartikler eller striber detekteret som proteinpletter) blev fjernet ved manuel redigering. Henvisning billede geler blev oprettet efter gel justering ved hjælp af analyse software. Når den er sidestillet, geler blev automatisk analyseret ved anvendelse af Progenesis SameSpots software. Geler blev separeret i 2 grupper som enten tumor eller normale geler. Statistisk analyse af protein-ekspressionsniveauer blev derefter bestemt for hver plet baseret på gennemsnit spot volumen, og forskelle i proteinekspression mellem tumor og normale geler blev bedømt ved ANOVA. Steder med en p ≤ 0,05 blev udvalgt til at indgå i resultaterne. Multivariat analyse blev også udført under anvendelse Progenesis SameSpots og både korrelationsanalyse og princippet komponenter analyse blev udført på det afbildede geler. Korrelation analyse blev udført på log normaliseret stedet ekspressionsniveauer til gruppe blev sammen efter ligheder i deres udtryk profiler. Hovedkomponenter analysemetoder spot ekspressionsniveauer i alle geler til at adskille gelerne ifølge ekspression variation, som tillader en grafisk repræsentation af de flerdimensionale data, grupperet i de to grupper; tumor og normal. En endelig rapport, der viser alle analyserede pletter på gelen sammen med ANOVA værdier, rang og udtryk profiler for hver plet på grundlag af gennemsnittet normaliserede volumen for de grupper blev derefter produceret.

væskekromatografi-tandem massespektrometri

efter 2D gelelektroforese og billedanalyse af geler protein pletter af interesse (de pletter, som blev forøget betydeligt i de tumor prøver) blev udskåret fra geler og proteiner identificeret ved væskekromatografi-tandem massespektrometri.

Proteiner i gelen stykker blev spaltet med trypsin (sekventeringskvalitet, modificeret, Promega UK, Southampton, UK) under anvendelse af en Investigator PROGEST robot arbejdsstation (Genomic Solutions Ltd., Huntingdon, UK). Kort fortalt blev proteiner reduceret med DTT (60 ° C, 20 min), S-alkyleret med iodacetamid (25 ° C, 10 min) og derefter spaltet med trypsin (37 ° C, 8 timer). Den resulterende tryptisk peptid ekstrakt blev tørret ved rotationsinddampning (SC110 SpeedVac; Savant Instruments, Holbrook, NY, USA) og opløst i 0,1% myresyre i LC-MS /MS-analyse

Peptid opløsninger blev analyseret ved anvendelse af en. HCTultra PTM Discovery System (Bruker Daltonics Ltd., Coventry, UK) koblet til en ultimativ 3000 LC System (Dionex (UK) Ltd., Camberley, Surrey, UK). Peptider blev separeret på en monolitisk kapillarsøjle (200 um indvendig diameter × 5 cm lang, Dionex). Eluent A var 3% acetonitril i vand indeholdende 0,05% myresyre, eluent B -80% acetonitril i vand indeholdende 0,04% myresyre med en gradient af 3% -45% B i 12 minutter ved en strømningshastighed på 2,5 pl /min. Peptidfragment massespektre blev opnået i data-afhængige AutoMS (2) mode med en scanning række 300-1500 m /z, 3 gennemsnit, og op til 3 prækursor-ioner udvalgt fra MS scan 100-2200 m /z). Forstadier var aktivt udelukket inden for en 1,0 min vindue, og alle enkeltvis ladede ioner blev udelukket.

Peptid toppe blev detekteret og deconvoluted automatisk ved hjælp af data analyse software (Bruker). Masse lister i form af Mascot generiske filer blev oprettet automatisk og bruges som input til Mascot MS /MS Ioner søgninger i NCBInr databasen ved hjælp af Matrix Science webserver (www.matrixscience.com). Standardsøgemaskinen parametre var: enzym = trypsin, maksimum savnede spaltninger = 1; faste modifikationer = carbamidomethyl (C); variable modifikationer = oxidation (m); peptid tolerance ± 1,5 Da; MS /MS tolerance ± 0,5 Da; peptid ladning = 2+ og 3+ og instrument = ESI-TRAP.

Begge todimensionel gelelektroforese og massespektrometri blev udført af University of Aberdeen Proteome facilitet (www.abdn.ac.uk/ims/proteomics /).

Udvikling af kolorektal cancer væv microarray

En kolorektal cancer væv microarray blev bygget indeholder normal colon mucosa (n = 50), primær (n = 515) og metastatisk kolorektal cancer ( n = 224) som tidligere beskrevet [28], [29].

Alle sager blev udvalgt fra Aberdeen kolorektal tumor bank. I alt blev tumor prøver fra 515 patienter involveret i denne undersøgelse, i hvert enkelt tilfælde, havde en diagnose af primær kolorektal cancer er foretaget, og patienterne havde gennemgået elektiv kirurgi for primær kolorektal cancer, i Aberdeen, mellem 1994 og 2007. 99 tumorer var fra perioden 1994-1998, 199 tumorer var fra 1999-2003 217 tumorer var fra perioden 2004-2007. Ingen af ​​patienterne havde modtaget nogen præoperative kemoterapi eller strålebehandling. De data for patienter og deres tumorer inkluderet i denne undersøgelse er beskrevet i supplerende oplysninger Tabel S1. Den gennemsnitlige lymfeknude udbytte for alle tumorer i denne undersøgelse var 13,4 lymfeknuder pr tumor og for node negative tumorer gennemsnitsvægten lymfeknude udbytte var 14,4 (lymfeknude udbytte refererer til det samlede antal lymfeknuder hentes fra hver colorektale cancerresektionsprocedurer prøve). Overlevelse oplysninger var til rådighed for alle patienter og på tidspunktet for censurere patientdata resultatdata der havde været 237 (46%) dødsfald (total mortalitet). Den gennemsnitlige patient overlevelse var 114 måneder (95% CI 105-122 måneder). De colorektale cancer excision prøver blev modtaget friske, åbnet ovenfor og i givet fald under tumoren, vasket i koldt vand og derefter fikseret i 10% neutral bufret formalin i mindst 48 timer ved stuetemperatur og repræsentative blokke blev indlejret i voks. Sektioner blev farvet med hæmatoxylin og eosin til histopatologisk diagnose og tumorerne blev rapporteret ifølge The Royal College of patologer retningslinjer, der inkorporerer vejledning fra TNM5 af TNM.

En kolorektal cancer væv microarray blev bygget indeholder normal colon mucosa (n = 50), primær (n = 515) og metastatisk colorektal cancer (n = 224). De metastaser var alle fra tumor involverede lymfeknuder i Dukes C sager. Hver normal slimhinde prøve blev erhvervet fra mindst 10 cm fjernt fra tumoren som beskrevet tidligere [28], [29]. Alle sager blev revideret og områder af væv, der skal udtages prøver blev først identificeret og mærket på passende hæmatoxylin og eosin farves slide af en ekspert konsulent gastrointestinale patolog (GIM). To 1 mm kerner blev taget fra disse områder af den tilsvarende voks indlejret blok under anvendelse af en Beecher Instruments væv microarrayer (Sun Prairie, WI, USA) og anbragt i en recipient paraffin blok. Efter overdragelsen blev modtageropstillingen blok opvarmes til 37 ° C, og en glasplade blev brugt til forsigtigt at trykke ned kernerne for at sikre, at de var alle på samme niveau i den modtagende voks blok.

Immunhistokemi

Immunhistokemi for hvert antistof (tabel 2) blev udført med biotin fri Dako Envision ™ -systemet (Dako, Ely, UK) under anvendelse af en Dako Autostainer (Dako) som tidligere beskrevet [28], [30], [31] . Sektioner af væv microarray blev afvokset i xylen, rehydreret i alkohol og et antigen hentning trin udføres. Dette trin bestod af mikrobølgeopvarmning sektionerne fuldt nedsænket i 10 mM citratpuffer ved pH 6,0 i 20 minutter i en 800 W mikrobølgeovn drives ved fuld kraft. Snittene blev derefter lov til at afkøle til stuetemperatur. Det primære antistof passende fortyndet (tabel 2) i antistoffortyndingsmiddel (Dako) blev påført i 60 minutter ved stuetemperatur, vasket med puffer (Dako) med senere peroxidase blokering i 5 minutter (Dako). Dette blev efterfulgt af en enkelt 2 minutter puffervask hvorefter præ-fortyndet peroxidase-polymer mærket gede-anti-muse /kanin sekundært antistof (Envision ™, Dako) blev påført i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af yderligere vask med buffer til fjernelse ubundet antistof. Lokaliteter af peroxidase aktivitet blev derefter demonstreret med diaminobenzidin som chromogen anvendes i tre på hinanden følgende 5 minutters perioder. Endelig blev sektionerne vasket i vand, let modfarvet med hæmatoxylin, dehydreret og monteret. Udelade primært antistof fra den immunhistokemiske procedure og erstatte det med enten antistof fortyndingsmiddel eller ikke-immunt kaninserum efter behov fungerede som negative kontroller. Positive kontroller blev væv kendt for at udtrykke den enkelte protein.

Sektionerne blev evalueret af lys mikroskopisk undersøgelse og intensiteten af ​​immunfarvning i hver kerne vurderes uafhængigt af to investigator (DO’D og GIM) ved hjælp af en scoringssystem beskrevet tidligere for vurderingen af ​​proteinekspression i tumor microarrays [28] – [31]. Intensiteten af ​​immunofarvning i hver kerne blev scoret som negativ, svag, moderat eller stærk. Den subcellulære lokalisering (enten nukleare eller cytoplasmatisk) af immunfarvning blev også bedømt. Variation i immunfarvning mellem kerner i hvert enkelt tilfælde blev ikke identificeret. Eventuelle uoverensstemmelser i vurderingen af ​​de væv kerner mellem de to observatører blev løst ved samtidig mikroskopisk revurdering.

Vurdering af mikrosatellit ustabilitet status

mikrosatelitter ustabilitet status (MSI) blev vurderet ved immunhistokemi hjælp antistoffer mod MLH1 og MSH2 (tabel 2) som beskrevet tidligere [30].

Statistik Salg

Statistisk analyse af den immunhistokemiske data, herunder af Mann-Whitney U test, Wilcoxon-test, chi- kvadreret test, hierarkisk klyngeanalyse, Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, log-rank test og Cox multi-variate analyse (variabler angivet som kategoriske variable), herunder beregning af hazard ratio og 95% CIs blev udført ved hjælp af PASW v18.0.2 til Windows XP ™ (SPSS UK Ltd, Woking, UK). Den log rank test blev anvendt til bestemmelse overlevelse forskelle mellem de enkelte grupper. En sandsynlighed værdi på p ≤ 0,05 blev betragtet som signifikant. At udforske indflydelsen af ​​forskellige cut-off point i forhold til overlevelse de immunhistokemiske scores for hver markør blev dikotomiseret. Grupperne, der blev analyseret var negative versus enhver positiv farvning, negative og svag farvning versus moderat og stærk farvning og negative, svage og moderat farvning versus stærk farvning. Hierarkisk cluster analyse blev udført ved hjælp af den længst nabo metoden med kvadratet euklidiske afstand som klyngen foranstaltning og cluster analyse blev udført uden nogen transformation af dataene eller imputering af manglende værdier [18], [19].

Etik

projektet havde godkendelse af det nordlige Skotland Research etiske komité (ref. nr. 08 /S0801 /81). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra deltagere, der leveres frisk prøver af væv for proteomics del af undersøgelsen. Den videnskabsetisk komité fraveget kravet om skriftligt samtykke til den retrospektive væv prøver indgår i kolorektal cancer væv microarray.

Resultater

Proteomics

I alt mere end 1200 individuelle protein pletter blev løst efter separation ved 2D-gelelektroforese og billedanalyse i normale kolonmucosa og colontumorer (figur 1). Hierarkisk klyngeanalyse og princippet komponenter analyse viste separationen af ​​proteinerne i to forskellige grupper-normale og tumor (figur 2). Undersøgelsen omfattede både proximale og distale colon tumorer og hverken klynge eller principielle komponenter analyse påviste, at der var nogen forskel i protein udtryk profiler mellem tumor og normal slimhinde i disse anatomiske steder. Proteiner, der viser større end og lig med 1,5 gange forøget ekspression i tumorprøver er sammenfattet i supplerende oplysninger Tabel S2. Identiteten af ​​disse proteiner var hovedsagelig bekræftet ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri. For hvert protein multiple peptider med stor statistisk sandsynlighed (p 0,05) matches til den relevante protein blev analyseret for at bekræfte identitet. Nærmere oplysninger om massespektrometrisk identifikation af proteiner er vist i supplerende oplysninger Tabel S3.

Repræsentative henvisning 2D-geler af normal kolon (A) og kolon tumor (C). Dette er den kommenterede reference- geler skabt af Progenesis samme pletter gel billedanalyse software til analyse af individuelle geler. Antallet af hver plet tildeles af billedanalysesoftware. For nemmere visualisering af individuelle steder repræsentative ikke-kommenteret 2D-geler af normal colon og colon tumor er vist i panelerne B og D hhv. De proteiner, som blev godkendt af immunhistokemi er blevet identificeret i D.

Repræsentant hierarkisk klyngeanalyse (A) og principal komponenter analyse (B) af normale og tumor geler. Både statistiske metoder viser, at protein udtryk profiler bestemt ved 2D-gelelektroforese og gel billedanalyse adskiller i tumorprøver sammenlignet med normale prøver. Den nedre panel i hver figur viser de standardiserede udtryk profiler. Tallene i figur 2 er “skærmbilleder” af produktionen af ​​analyse fra Progenesis SameSpots softwaren. Både figur 2A og figur 2B viser resultaterne af det samme forsøg af et tilfælde (dvs. et par normale geler N1 og N2 og et par af tumor geler T1 og T2). Den nedre panel i hver del af figuren viser den standardiserede ekspressionsprofil og repræsenterer proteiner af forskellig ekspression afsat lodret med linjer “forbinde” de tilsvarende proteiner i hver gel. De farvede pletter repræsenterer interaktive pletter placeret af software for brugeren at få adgang til hvert datasæt og er placeret vilkårligt af softwaren på skærmen.

Immunhistokemi

Femten proteiner blev udvalgt til immunhistokemisk validering. Kriterierne for udvælgelse af proteinerne omfattede graden af ​​overekspression i kolorektal cancer, udelukkelse af kendte strukturelle f.eks actin og serumproteiner e.g.haemoglobin og tilgængeligheden af ​​egnede validerede antistoffer, som var i kraft på formalin fast voks indlejret væv.

Alle proteiner viste tumor celle farvning og undtagen nucleophosmin (NPM1) viste cytoplasmatisk farvning (figur 3). NPM1 viste udelukkende nukleare farvning mens glyceraldehyd 3 fosfat (GAPDH) viste både nukleare og cytoplasmatisk farvning og disse to sub-cellulære lokalisationer er blevet vurderet særskilt for dette protein. S100A9 viste både variable tumor celle farvning (S100A9t) og variabel stromacelle- farvning (S100A9s), og disse to cellulære lokalisationer af dette protein er blevet evalueret separat. De proteiner, hyppigst udviste kraftig tumorcelle immunoreaktivitet i primær kolorektal cancer var NPM1 (99,6%), større vault protein (MVP, 81,1%) og prohibitin (PHB, 75,6%), mens i lymfeknudemetastaser de proteiner, som viste den hyppigste stærk tumorcelle immunoreaktivitet var NPM1 (95,8%), MVP (74,5%) og varmechokprotein 60 (HSP60, 63,9%) (figur 4). I normal colon proteinerne, der viste den højeste frekvens af stærk epitelcelle immunoreaktivitet var NPM1 (99,6%), isocitratdehydrogenase 1 (IDH1, 93%) og lactatdehydrogenase B (LDHB, 82,1%) (figur 4).

mikrofotografier af den immunhistokemiske lokalisering af de enkelte proteiner i normal colon, primær kolorektal cancer og lymfeknude metastaser.

Hyppigheden af ​​udtryk som vurderet immunhistokemisk af individuelle proteiner i A. normal colon, B, primær kolorektal cancer og C. lymfeknudemetastase

proteinerne, der viste den største grad af overekspression i primær colorektal cancer sammenlignet med normal colon mucosa var HSP60 (p 0,001)., S100A9 (p 0,001) og translatinally kontrolleret tumor protein (TCTP, s 0,001, tabel 3), mens det for Dukes C kræftformer ingen proteiner viste øget immunreaktivitet i lymfeknudemetastaser sammenlignet med de tilsvarende primære colorektale cancere og proteinerne, der viste den største nedgang i ekspression i lymfekirtel metastase var PHB (p = 0,002), peroxiredoxin (PRDX1, p = 0,003) og HSP60 (p = 0,005, tabel 3). Forholdet af protein-ekspression med individuelle Dukes stadier er vist i tabel 4 og figur 5.

Hyppighed af ekspression af individuelle proteiner som vurderet immunhistokemisk i A. Dukes A kolorektal cancer, B. Dukes B kolorektal cancer og C. Dukes C colorectal cancer. Vejviser

Sammenligninger af ekspression af individuelle proteiner og klinisk-patologiske parametre er beskrevet i tabel 5. Flere af proteinerne viste en meget signifikant sammenhæng med mikrosatellit ustabilitet status herunder 14-3-3β (χ

2 = 22,441, p 0,001), HSP60 (χ

2 = 27,663, p 0,001) og IDH1 (χ

2 = 47,733, p 0,001) .

Survival analyse

analyse af individuelle markører.

forholdet af ekspressionen af ​​individuelle proteiner og overlevelse blev undersøgt ved hjælp af forskellige cut-off points (negativ v positiv, negativ /svag positiv v moderat /strong og negative /svag /moderat v stærk) og er opsummeret i tabel 6 og figur 6. 14-3-3β blev identificeret som viser prognostisk betydning (χ

2 = 6,218, p = 0,013, hazard ratio (HR) = 0,639, 95% konfidensinterval (CI) 0,448-0,913), når negative tumorer blev sammenlignet med tumorer, der viser nogen grad af 14-3-3β immunoreaktivitet (figur 6A). Tumorer viser et fravær af 14-3-3β immunoreaktivitet var forbundet med en bedre prognose. For patienter med 14-3-3β negative tumorer (n = 104, antal dødsfald = 36) den gennemsnitlige overlevelse var 129 måneder (95% CI 113-145 måneder) og for patienter med positive tumorer (n = 398; antallet af dødsfald = 194) var den gennemsnitlige overlevelse var 107 måneder (95% CI 98-117 måneder). Det var prognostisk signifikant (p = 0,03, HR = 0,588, 95% CI 0,361-0,958) i en multivariat model indeholder alle variabler (Dukes stadium, EMVI, tumor site, patientens alder, patientens køn, udtryk for individuelle proteiner). De andre væsentlige variabler var Dukes stadie (p 0,001, HR = 0,491, 95% CI 0,357-0,714), alder (p 0,001, HR = 0,470, 95% CI 0,343-0,645) og extramural vaskulær invasion (EMVI, s 0.001, HR = 0,467, 95% CI 0,338-0,644). Selvom PHB udtryk (positiv v negativ PHB immunoreaktivitet) også blev bemærket at have en meget signifikant sammenhæng med overlevelse (χ

2 = 7,883, p = 0,005, HR = 3,311, 95% CI 1,359-8,064) kun 6 patienter var i PHB negative gruppe (figur 6B). Andre protein, som viste en signifikant sammenhæng med overlevelse ved hjælp af forskellige cut off punkter var IDH1, LDHB, TCTP og MVP (tabel 6 og figur 6C-6G).

Forholdet af individuelle proteiner evalueret af immunhistokemi med overlevelse med forskellig cut-off point. A. 14-3-3β (positiv v negativ immunreaktivitet), B. PHB (positiv v negativ immunreaktivitet), C. IDH1 (negativ /svag immunreaktivitet v moderat /strong immunreaktivitet), D. LDHB (negativ /svag immunreaktivitet v moderat /stærk immunoreaktivitet), E. TCTP (negativ /svag immunreaktivitet v moderat /strong immunreaktivitet), F. IDH1 (negativ /svag /moderat immunoreaktivitet v stærk immunoreaktivitet), G. MVP (negativ /svag /moderat immunoreaktivitet v stærk immunoreaktivitet), H . overlevelse i hver af 10 klynger identificeret ved hierarkisk klyngeanalyse (hver klynge er numerisk identificeret og svarer til de klynger, der er identificeret i klyngen analyse panel af figur 7), I. overlevelse i 2 clusters- klynge 1 og klynger 2-10 kombineret og J. to protein underskrift 14-3-3β og ALDH1 viser, at dobbelt negative tumorer har en betydeligt bedre resultat.

Hierarkisk cluster analyse og identifikation af prognostisk protein signatur.

Hierarkisk cluster analyse blev også brugt som en sonderende statistisk redskab til at undersøge det generelle forhold af markør udtryk med resultatet og er baseret på dette identificere et protein signatur i forbindelse med prognose. En række klyngeløsninger (antal klynger) blev undersøgt for at bestemme det optimale antal klynger, der producerede grupper med forskellige resultater. Klyngedannelse data i ti klynger blev identificeret som det optimale antal klynger til analyse i forhold til de mest prognostisk signifikant grupper (supplerende oplysninger Tabel S4, figur 6H og Figur 7). Disse 10 klynger blev derefter kombineret i to prognostiske grupper; en god prognose gruppe (klynge 1) og en dårlig prognose gruppe (klynge grupper 2-10) (fig 6I). Den gode prognose gruppe (gennemsnitlig overlevelse = 157 måneder 95% CI 135-177 måneder, n = 39, antal dødsfald = 8) havde en signifikant bedre overlevelse (χ

2 = 8,144, p = 0,004, HR = 0,373, 95% CI 0,179-0,757) end dårlig prognose gruppe (gennemsnitlig overlevelse = 106 måneder, 95% CI 1-2-119 måneder, n = 392, antal dødsfald = 183).

Grafisk repræsentation af immunhistokemi markør data vises i midten panel. Panelet til højre viser resultaterne af den hierarkiske klyngeanalyse præsenteres som et dendrogram med 10 individuelle klynger identificeret. Panelet til venstre viser et forstørret udsnit af den grafiske gengivelse.