PLoS ONE: Vimentin er en ny Anti-Cancer Therapeutic Target; Insights fra In vitro og in vivo Mus xenografundersøgelser

Abstrakt

Baggrund

Vimentin er en allestedsnærværende mesenkymale mellemliggende filament understøtter mekanisk-strukturelle integritet hvilende celler, mens deltage i vedhæftning, migration, overlevelse, og celle signalering processer via dynamisk montering /demontering i aktiverede celler. Bløddelssarkomer og nogle epitelial kræft udviser “epitelial til mesenkymale overgang” fænotyper udtrykker vimentin. Withaferin-A, kan en naturligt afledt bioaktiv forbindelse, molekylært målrette vimentin, så vi søgte at evaluere dens virkninger på tumorvækst

in vitro

in vivo

derved at belyse den rolle, vimentin i narkotika inducerede reaktioner.

Metoder og Resultater

Withaferin-A fremkaldte markant apoptose og vimentin spaltning i vimentin-udtrykkende tumorceller, men betydeligt mindre i normale mesenkymale celler. Denne proapoptotiske respons blev ophævet efter vimentin knockdown eller ved blokering af caspase-induceret vimentin nedbrydning via caspaseinhibitorer eller overekspression af muteret caspase-resistent vimentin. Udtalte antiangiogene virkninger af Withaferin-A blev demonstreret, med kun minimal effekt set i ikke-prolifererende endotelceller. Desuden Withaferin-A signifikant blokeret bløddelssarkom vækst, lokalt recidiv og metastaser i et panel af bløddelssarkom xenograft eksperimenter. Apoptose, nedsat angiogenese, og vimentin nedbrydning blev alle set i Withaferin-A behandlede prøver.

Konklusioner

I lyset af disse resultater, evaluering af Withaferin-A, dets analoger eller andre anti- vimentin terapeutiske tilgange i bløddelssarkom og “epitelial til mesenkymale overgang” kliniske sammenhænge er berettiget

Henvisning:. Lahat G, Zhu QS, Huang KL, Wang S, Bolshakov S, Liu J, et al. (2010) Vimentin Er en Novel Anti-Cancer Therapeutic Target; Insights fra

In vitro

In vivo

Mus xenografundersøgelser. PLoS ONE 5 (4): e10105. doi: 10,1371 /journal.pone.0010105

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: 26 september, 2009; Accepteret: 3 marts 2010; Udgivet 16. april, 2010

Copyright: © 2010 Lahat et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af NCI /NIH R01 tilskud CA138345 (til DL) og en Amschwand sarkom Cancer Foundation frø tilskud (til SW). MD Anderson Cancer Center cellelinje karakterisering og cytogenetiske Core faciliteter er begge støttet af en NCI Cancer Center Support Grant. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bestående mere end 50 histologiske undertyper, bløddelssarkom (STS) kan inddeles i to store grupper: dem med specifikke genetiske ændringer (translokationer eller punktmutationer) og relativt simple karyotyper, og dem med komplekse, ubalanceret aneuploid karyotyper [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Øget forståelse for de molekylære afvigelser kørsel starten og progression af flere STS undertyper, der tilhører den første gruppe (f.eks c-Kit mutationer i gastrointestinale stromale tumorer [GIST] eller 17 22 translokation fører til PDGF-B overekspression i dermatofibrosarkom protuberans [DFSP]), har resulteret i kliniske anvendelser af effektive målrettede behandlinger (f.eks Imatinib mesylat) med væsentligt forbedret resultat [6]. Sådanne terapeutiske fremskridt er meget opmuntrende og fremhæve behovet for at identificere andre nye molekylære mål i yderligere STS undertyper

De fleste STS tilhører den anden gruppe huser aneuploide karyotyper.; denne gruppe består hovedsagelig af malignt fibrøst histiocytom (MFH, også betegnet uklassificerede pleomorf sarkom [UPS]), leiomyosarkomer, maligne perifere nerve kappe tumorer (MPNST), og dedifferentierede eller pleomorfe liposarkomer. Mens kliniske præsentation og sygdomsmanifestationer varierer afhængigt af den specifikke histologiske subtype, som helhed, disse komplekse karyotype STS har en trist prognose, med en 5-års overlevelse på mindre end 50%. Trods indledende lokal styring (opnået ved operation med eller uden stråling), lokalt recidiv og systemisk spredning almindeligt forekommende og manglen på effektive terapeutiske muligheder i disse kliniske scenarier er den største uløste problem i STS. I modsætning til den genetiske enkelhed STS i den første gruppe, den biologiske og molekylære mangfoldighed af komplekse karyotype STS markant begrænser identifikation af individuelle og specifikke “onkogen afhængighed” afvigelser. Han anfægter, er afgørende belyse nye terapier, der kan have nytte for en bred vifte af komplekse karyotype STS.

Siden begyndelsen af ​​1960’erne, planter og mikrober har givet adskillige nyttige, naturligt afledt, små organiske molekyler besidder anti-cancer egenskaber [7], [8], [9], [10].

withania somnifera

(ashwagandha) er en medicinsk plante almindeligt anvendt i indisk traditionel medicin til behandling af et bredt spektrum af lidelser [11], [12], [13], [14], [15]. Withaferin-A (WFA), et stærkt iltet C-28 ergostane type steroid lacton, er en bioaktiv forbindelse isoleret fra

withania somnifera

. WFA udviser forskellige farmakologiske aktiviteter, herunder anti-inflammatorisk, immunmodulerende og antiangiogene virkninger [15], [16], [17], [18]. Adskillige former for evidens tyder på, at WFA har anti-cancer egenskaber, manifesteret ved direkte målretning af tumorceller og indirekte hindrer [tumorassocieret neovaskulatur [19], [20]. Nylige undersøgelser har vist, at WFA undertrykker vækst menneskelige bryst og prostata kræftceller ‘

in vitro

in vivo

ved at inducere markeret apoptose [19], [21], [22]. WFA-induceret cytoskelet arkitektur ændring [23], [24], [25], reaktiv ilt arter generation [26], [27], mitokondriel dysfunktion [26], og proteosomal hæmning [21] er også blevet foreslået. Normale, ikke-tumorigene celler viste sig at være mere modstandsdygtige end tumorceller til WFA-induceret apoptose [22]; selektivitet for maligne celler, samtidig skåne normale celler er en meget ønskeligt træk af potentielle anti-cancer terapeutiske midler.

De nøjagtige mekanismer i WFA handling er ikke blevet endeligt fastlagt. Der er blevet foreslået flere molekylære mål, herunder transskriptionsfaktoren NF-KB [28], [29]; signalmolekylet AKT [27]; De proapoptotiske molekyler PAR-4, FOXO-3, og Bim [22]; og proteosomal chymotrypsin subunit β5 [21]. En nylig undersøgelse udnyttede en kemisk genetisk og proteom testpræparat tilgang [30], hvor en biotinyleret WFA analog blev anvendt som en probe til at trække ned WFA bindingspartnere i endotelceller. Denne strategi resulterede i identifikationen af ​​vimentin, en type III mellemliggende filamenter, som en ny WFA substrat. Endvidere blev WFA-modificerede vimentin fundet at fremkalde betydelige proapoptotiske og antiangiogene effekter, mens vimentin knockdown resulterede i nedsat WFA følsomhed. Disse eksperimenter giver indsigt i WFA aktivitet og fremhæve den potentielle nytte af vimentin som et nyt anti-cancer terapeutisk mål.

STS er mesenkymale og derfor alle udtrykker vimentin, uanset deres histologisk undertype. Derfor er det sandsynligt, at anti-vimentin terapeutiske strategier kan fremkalde anti-STS effekter i en bred vifte af STS. Denne hypotese fik os til at fastslå virkningen af ​​WFA på komplekse karyotype STS

in vitro

in vivo

. Vi brugte humane cellelinjer, der repræsenterer leiomyosarkom, MPNST, fibrosarkom, og UPS /pleomorf liposarkom at vurdere virkningen af ​​vimentin på WFA følsomhed. Vores resultater antyder, at STS er meget følsomme over WFA, en effekt, der er meget mere udtalt end i vimentin-negative epiteliale cancere. WFA inducerer en caspase-afhængig nedbrydning af vimentin, hvilket resulterer i markant anoikis-uafhængig apoptose og STS-associerede antiangiogene effekter. Resultaterne støtter stærkt evalueringen af ​​WFA eller dets analoger som et nyt klinisk strategi for patienter huser disse ødelæggende maligniteter.

Resultater

sarkom celler er meget følsomme over for WFA

Til vurdere effekten af ​​WFA på komplekse karyotype STS vi valgt et panel af humane STS cellelinier, der repræsenterer fibrosarkom (HT 1080), leiomyosarcoma (SKLMS1), MPNST (STS26T), og høj kvalitet pleomorf sarkom /liposarkom (PLS-1). Sidstnævnte cellelinie er for nylig blevet etableret i vores laboratorium (se data S1 og figur S1 for yderligere detaljer). Behandling af de ovennævnte celler med WFA resulterede i et signifikant fald i antallet af vedhæftede celler og mærket morfologiske ændringer, herunder celle-afrunding og kernekondensering (figur 1A). Virkningerne af WFA forekom så tidligt som 2 timer efter behandlingsstart og var dosis- og tidsafhængig (figur S2). Celle vækstassays demonstrerede en WFA-induceret, dosisafhængig formindskelse i STS cellevækst (figur 1B). Middelværdi ± standardafvigelse WFA IC

50 værdier (efter 24 h behandling) blev registreret som 0,4 uM ± 0,07, 0,41 pM ± 0,03, 0,37 pM ± 0,12, og 0,53 pM ± 0,1, for HT1080, SKLMS1, STS26T, og PLS -1 hhv. Tilsvarende lave doser af WFA (0,5 uM) markant hæmmet STS celle kolonidannelse kapacitet (figur 1C). Endelig effekten af ​​WFA på STS forankring uafhængig vækst blev undersøgt. Alle STS celler evalueret, vist evne til at vokse i blød agar; denne vækst blev ophævet efter 24 timers WFA (0,5 uM) behandling (Figur 1D). Tilsammen tyder disse data, at menneskelige STS celler er meget følsomme over for de væksthæmmende effekter af WFA.

A)

WFA behandling (1 uM /24 timer) resulterer i markante morfologiske ændringer, herunder celle-afrunding og nuklear kondens, i STS celler;

B)

MTS analyser demonstrerer en WFA-induceret, dosisafhængig reduktion i STS cellevæksten;

C)

WFA (0,5 uM /24 h) markant hæmmer STS celle kolonidannelse kapacitet målt efter ti dage;

D)

WFA (0,5 uM /24 h) ophæver STS celle forankring uafhængig vækst målt efter tre uger. Grafer repræsenterer gennemsnittet af tre gentagne forsøg ± SD.

WFA inducerer markeret apoptose i STS celler, men mindre apoptose i normale humane fibroblaster og myogene celler

For at vurdere effekten af ​​WFA på STS celle overlevelse, gennemførte vi Annexin V /FACS analyser. STS celler blev behandlet med stigende koncentrationer af WFA (0-5 uM) i 4 timer og 24 timer; en betydelig induktion af apoptose var tydelig selv inden for kort tidshorisont, især når høje doser blev brugt ( 2,5 uM, s 0,05, figur 2A). En dosis- og tidsafhængig stigning i tumorcelle apoptose blev observeret i alle testede celler. Apoptose induktion blev også afspejlet i den observerede stigning i aktiverede caspase 3 og PARP spaltning (Western blot-analyse [WB] Figur 2B)

A)

Annexin-V /FACS analyser, der påviser markeret. WFA-induceret apoptose i STS-celler (sorte søjler repræsenterer 4 timer af WFA behandling og grå søjler repræsenterer 24 h);

B)

WFA (1 pM /24 timer) inducerer caspase-3 (Casp-3) aktivering spaltning og PARP i STS celler (WB-analyse);

C)

STS celler er resistente over for anoikis sammenlignet med normale humane dermale fibroblaster (NHDF). WFA (1 uM /24 timer) inducerer apoptose i både fastgjort og flydende STS celler;

D)

Transmission (TEM) fotografier skildrer STS celle apoptose (store pil-cellekernekondensation, lille pil-cytoplasmatisk blæredannelse) som reaktion på WFA. Nekrose demonstreres i flydende STS celler;

E)

NHDF er mere modstandsdygtige over for virkningerne af WFA (IC50: 3,7 pM ± 0,15) sammenlignet med STS celler. Grafer repræsenterer gennemsnittet af tre gentagne forsøg ± SD.

Dernæst vi vurderet om WFA-induceret apoptose kunne tilskrives tumorcelle tab af adhæsion og adskillelse fra dyrkningspladen, hvilket resulterer i anoikis. Normale humane dermale fibroblaster (NHDF) blev underkastet en omfattende apoptose ved dyrkning i suspension, mens STS-celler var resistente over for anoikis og kunne observeres ingen signifikant stigning i apoptose (figur 2C). WFA øget apoptose af begge er bundet og flydende STS celler.

WFA-induceret apoptose blev yderligere bekræftet ved anvendelse transmissionselektronmikroskopi (TEM). Tegn på apoptose, herunder chromatinkondensation og cytoplasma krympning, var tydelig i løbet 4 timer. Efter 24 timer blev markeret apoptose observeret, sammen med tab kernemembranen og cytoplasmatisk blæredannelse; Disse effekter blev bemærket i både fastgjort og flydende STS celler. Flydende nekrotiske STS celler blev også observeret (~20-30% af de samlede flydende celler).

Sidste, vi evaluerede effekten af ​​WFA på normale mesenkymale celler (figur 2E og S3). Primære kulturer af NHDF og humane intestinale glatmuskelceller (HISMC) blev behandlet med stigende doser af WFA i 24 timer. I modsætning til vores observationer i STS celler, falder i celle nummer og morfologiske ændringer var tydelige ved mikroskopi efter høje doser af WFA ( 2,5 uM). Middel ± SD WFA IC

50 værdier var 3,7 uM ± 0,15 og 3,2 uM ± 0,21 for NHDF og HISMC hhv. Disse værdier var mere end 9 gange højere end observeret i STS celler. Tilsvarende WFA inducerede en signifikant lavere apoptose i disse normale celler (P 0,05). Taget sammen antyder disse data at WFA er en potent proapoptotiske forbindelse. STS celler er meget følsomme over for WFA, mens normale mesenkymale celler er mere modstandsdygtige over for dens virkninger.

WFA ophæver STS celle migration og invasion

Vi næste evaluerede effekten af ​​WFA på STS celle migration og invasion. STS celler blev forbehandlet med lave doser af WFA (0,5 uM) i 4 timer, på hvilket tidspunkt WFA blev vasket forsigtigt af og en ridse sårhelende assay blev udført. Vi observerede et markant fald i migration (figur S4A). Desuden blev modificerede Boyden kamre bruges til at kvantificere effekten af ​​WFA om migration og invasion. STS celler blev forbehandlet med en lav dosis af WFA (0,5 uM) i 4 timer. Efter seponering af WFA blev cellerne vasket og talt; kun levedygtige celler blev yderligere udnyttet. WFA signifikant hæmmede migration og invasion i alle STS undersøgte celler (P 0,05, figur s4b).

En potentiel advarsel til disse eksperimenter er, at virkningen demonstrerede kunne afspejle de antiapoptotiske eller vækst-hæmmende virkninger af WFA stedet dens direkte virkninger på motilitet og /eller invasion. For at løse denne mulighed, i forbindelse med de ovennævnte eksperimenter, vi forbehandlet STS celler med en lav dosis af WFA (0,5 uM i 4 timer) eller DMSO (kontrol); ved seponering af WFA blev cellerne vasket og talt, og levedygtige celler blev re-belagt. Celletælling ved afslutningen af ​​forsøget viste kun en lille reduktion ( 10%) i antallet af levedygtige WFA-behandlede celler i forhold til antallet af kontrol-behandlede celler (data ikke vist). Sammen disse resultater tyder på, at WFA ophæver STS celle motilitet og invasion.

WFA inducerer vimentin nedbrydning og vimentin knockdown nedsætter cellernes følsomhed over for WFA

En nylig undersøgelse identificeret vimentin som muligt WFA molekylære target [30]. Derfor vurderede vi effekten af ​​WFA på vimentin udtryk og nedbrydning. WFA behandling resulterede i et fald i fuld længde vimentin niveauer og forøget ekspression af vimentin nedbrydningsprodukter i alle m afprøvet (figur 3A) celler. WFA effekt på vimentin er dosis og tidsafhængig; høje WFA koncentrationer resulterer i vimentin spaltning efter kun 4 timer af behandlingen, mens vimentin nedbrydning er bemærket efter 24 timer med lavere doser.

A)

WFA behandling (5 uM /4 h) resultater i reducerede fuld længde (FL) vimentin niveauer og forøget ekspression af vimentin nedbrydningsprodukter (VDP) i alle STS celler testet. En WFA dosisafhængig effekt i SKLMS1 celler behandlet i 4 timer er også vist. Vimentin spaltning bemærket sekundært til lave WFA koncentrationer efter 24 timers behandling;

B)

Anti-vimentin SMARTpool siRNA (20 nM) fremkalder et markant fald i vimentin udtryk i SKLMS1 celler (WB). Vimentin knockdown væsentlige blokerer WFA-induceret (1 uM /24 timer) apoptose;

C)

Endogen vimentin blev først slået ned i SKLMS1 celler ved hjælp af anti-vimentin antisense phosphordiamidat morpholino oligomerer. Efter knockdown, vimentin blev kraftigt igen udtrykkes i cellerne (WB). Svarende til resultaterne af siRNA Knockdown, anti-vimentin morpholino oligomerer signifikant blokerer WFA-induceret (1 uM /24 timer) apoptose. Re-udtryk for vimentin genskaber SKLMS1 følsomhed over for WFA;

D)

STS celler (SKLMS1 og PLS1) udtrykker signifikant højere niveauer af opløselig vimentin sammenlignet med normale mesenkymale celler (glatte muskelceller: HA-SMC og HC-SMC og fibroblaster: NHDF). (NT siRNA = ikke rettet mod siRNA, Vim siRNA = anti-vimentin siRNA smartpool; NT morpholino = ikke målretning morpholino, Vim KD = vimentin knockdown)

For at afgøre, om virkningen af ​​WFA på STS celler er i det mindste delvist medieret gennem vimentin, vi valgt at bruge en vimentin knockdown tilgang. Anti-vimentin SMARTpool siRNA fremkaldte et betydeligt fald i vimentin udtryk i SKLMS1 celler (WB, figur 3B). Vimentin knockdown

per se

inducerede ikke signifikant apoptose i STS celler sammenlignet med mock eller ikke-targeting siRNA transfektion. Som forventet pr ovenstående eksperimenter, WFA behandling resulterede i signifikant apoptose i mock og ikke-targeting siRNA transficerede celler. Imidlertid vimentin knockdown blokeret væsentlige WFA-induceret apoptose. Sammen antyder disse data, at WFA-induceret vimentin nedbrydning er nødvendig for øget terapeutisk effekt.

For at bekræfte den potentielle rolle af vimentin i WFA-induceret apoptose, brugte vi en rednings eksperimenterende tilgang. Endogen vimentin blev først slået ned i SKLMS1 celler ved hjælp af anti-vimentin antisense phosphordiamidat morpholino oligomerer. Disse morpholinos målrette vimentin præ-mRNA, således at den tvungne re-ekspression af vimentin ved transfektion af en vimentin konstruere resistente over for den kontinuerlige tilstedeværelse af morpholino oligomerer. Efter knockdown, vimentin blev kraftigt igen udtrykkes i cellerne (WB, figur 3C); celler blev behandlet med WFA eller DMSO som kontrol og underkastet Annexin V /FACS-analyse. Svarende til resultaterne af siRNA knockdown, anti-vimentin morpholino oligomerer behandling signifikant blokeret WFA-induceret apoptose. Re-udtryk for vimentin restaureret SKLMS1 følsomhed over for WFA (figur 3C).

Både STS celler og normale mesenkymale celler udtrykker vimentin. Som vist i figur 2, WFA inducerer mere signifikante pro-apoptotiske virkninger i STS-celler sammenlignet med normale mesenkymceller (dvs. fibroblaster og muskelceller). De tidligere offentliggjorte data, der er beskrevet ovenfor (30) identificerede WFA at binde sig til tetramert, opløselig vimentin. Således har vi forsøgt at vurdere niveauerne af denne vimentin fraktion i normale vs. STS celler. Som vist i figur 3D, tumorceller udtrykker signifikant højere niveauer af opløselig, fri vimentin sammenlignet med normale mesenchymal-celler. Dette fund giver en mulig forklaring på vores observerede differential WFA effekter.

WFA-induceret vimentin nedbrydning er caspase-afhængig

Vimentin nedbrydning sker almindeligvis gennem aktivering af caspase vej. At vurdere, om WFA-induceret vimentin nedbrydning er et resultat af caspase-spaltning, vi forbehandlet STS med Z-VAD (Promega, Madison, WI), en pan-caspaseinhibitor, før WFA terapi (i 24 timer). Z-VAD forbehandling resulterede i nedsat vimentin nedbrydning sammenholdt med lavere niveauer af både kløvet caspase-3 og aktiveret PARP (Figur 4A). Desuden Z-VAD forbehandling signifikant ophævet WFA-induceret apoptose (efter 24 timers WFA behandling) i STS-celler (figur 4B). Dernæst efter vimentin knockdown hjælp morpholino oligoer blev SKLMS1 celler transficeret til at udtrykke enten vildtype vimentin eller vimentin muteret ved caspase spaltningssteder (D85N og D259N). WFA (1 uM) inducerede markant apoptose i vildtype vimentin transficerede celler, hvori vimentin nedbrydning og caspase-3-aktivering blev observeret (figur 4C). Imidlertid observerede vi en signifikant fald i WFA-induceret apoptose i celler, der udtrykker det muterede vimentin, og vi har bemærket en dramatisk nedgang i både vimentin nedbrydning og caspase-3-aktivering (figur 4C). Tilsammen tyder disse data en mulig WFA-induceret ond cirkel, hvor WFA binding til vimentin fremkalder dens nedbrydning af caspaser og sagde nedbrydning resulterer i yderligere caspase aktivering og apoptose.

A)

Pretreatement (4 h), i SKLMS1 celler med Z-VAD (en pan-caspaseinhibitor) resulterer i nedsat WFA-induceret (24 timer) vimentin nedbrydning i forbindelse med lavere niveauer af både kløvet caspase-3 og aktiveret PARP;

B)

Z-VAD (4 h) forbehandling signifikant ophæver WFA-induceret (24 timer) apoptose i SKLMS1 celler;

C)

Vimentin slået ned SKLMS1 celler blev transficeret til at udtrykke enten vildtype vimentin eller vimentin muteret ved caspase spaltningssteder (D85N og D259N). WFA (1 uM /24 timer) inducerer markant apoptose i vildtype vimentin transficerede celler, hvori kan påvises vimentin nedbrydning og caspase-3-aktivering (WB). Men et signifikant fald i WFA-induceret apoptose i celler, der udtrykker det muterede vimentin, er bemærket såvel som en nedgang i både vimentin nedbrydning og caspase-3-aktivering. (WT Vim = vildtype vimentin, Mut Vim = muteret vimentin, Vim FL = fuld længde vimentin, VDP = vimentin nedbrydningsprodukter)

WFA-induceret molekylære deregulering er, i det mindste delvis, medieret af vimentin

Flere molekylære mekanismer er tidligere blevet foreslået at ligge til grund WFA anti-tumorigene virkninger, herunder hæmning af AKT-phosphorylering [27], ophævelsen af ​​NF-KB-funktion [20], [31], og direkte proteosomal hæmning [21] . Vi først forsøgt at evaluere, om disse molekylære deregulering forekomme i STS-celler som respons på WFA behandling. Vi observerede en WFA dosis- og tidsafhængig formindskelse i Pakt niveauer, men ikke total AKT niveauer, i STS-celler (figur 5A). Tilsvarende blev en dosisafhængig formindskelse i NF-KB (p65) også demonstreret, selvom dette fald først skete efter 24 timers behandling. NF-KB-aktivitet, på den anden side, blev vist at blive inhiberet tidligt efter behandlingen, hvilket tyder på andre end faldet NF-KB-proteinekspression påvirker NF-KB-aktivitet mekanismer. Desuden fandt vi en markant dosis- og tidsafhængig akkumulation af ubiquitinerede proteiner, støtte WFA-induceret proteosomal hæmning i disse celler.

A)

WFA behandling fremkalder en dosis- og tid – afhængig fald i Pakt uden effekt på den samlede AKT. Ligeledes bliver et dosisafhængigt fald i NF-KB (p65) proteinekspression også set, selvom dette fald kun forekommer efter 24 timers behandling. NF-KB-aktivitet i PLS1 celler, som afbildet i grafer repræsenterer luciferase reporter analyseresultater, er vist at blive inhiberet tidligt efter behandling (4 h). En markant dosis- og tidsafhængig akkumulering af ubiquitinerede proteiner er også vist;

B)

Vimentin knockdown i SKLMS1 celler ophæver WFA (2,5 uM /24 timer) -induceret Pakt hæmning, NF-KB protein fald, og øgede niveauer af protein ubiquitinering. Tilsvarende vimentin Knockdown blokke WFA (1 uM /4 timer) -induceret fald i NF-KB-aktivitet. Grafer repræsenterer gennemsnittet af tre gentagne forsøg ± SD.

Vores resultater tyder på en central rolle for vimentin i cellernes respons på WFA. Således har vi forsøgt at evaluere, om effekterne af WFA på disse forskellige veje kan, i det mindste delvis, være formidlet gennem vimentin. SKLMS1 celler blev transient transficeret med anti-vimentin siRNA eller ikke-targeting siRNA og derefter behandlet med WFA. Vimentin knockdown ophævet WFA-induceret Pakt hæmning, NF-KB-protein fald og aktivitet blokade, og forhøjede niveauer af protein ubiquitinering (figur 5B). Disse eksperimenter giver yderligere bevis, at virkningerne af WFA medieres gennem vimentin og fremhæve nye potentielle vimentin funktioner.

WFA inducerer apoptose i endotelceller dyrket i STS-condition medier

Analogt til faste maligniteter, STS bestå af både tumor- og tumorassocierede normale celler; STS vækst, migration, og formidling afhænger krydstale mellem disse to rum. STS er generelt meget vaskulære og angiogene, hvilket resulterer i øget metastatisk potentiale. Tidligere data antyder, at WFA kunne harbor antiangiogeniske egenskaber [17], [30]. For yderligere at udvide disse indledende observationer og vurdere de potentielle antiangiogene virkninger af WFA i forbindelse med STS mikromiljø, vi evaluerede effekten af ​​WFA på endotelceller dyrket i regelmæssig kontrol medium (mangler angiogene faktorer, efterligner hvilende endotelceller), og på endotelceller dyrket i STS-konditioneret medium (CM, efterligner prolifererende angiogene endotelceller). Vi brugte både human endotel (HDMEC) og murine endotelceller (LEC) og observeret en signifikant højere WFA-induceret væksthæmning i endotelceller dyrket i STS-CM end i kontrol medium (gennemsnit ± SD WFA IC

50: 0,42 pM ± 0,16 vs. 1,4 pM ± 0,04 i HDMEC og 0,38 uM ± 0,09 vs. 2,3 pM ± 0,1 i LEC; P 0,05, figur 6A). Tilsvarende WFA inducerede højere niveauer af apoptose i endotelceller dyrket i STS-CM end i kontrol medium (figur 6B).

A)

En signifikant højere WFA-induceret (24 timer ) vækstinhibering ses i endotelceller (human dermale mikrokar endotelceller-HDMEC og murine lunge endotelceller-LEC) dyrket i STS konditioneret medium (CM) end i kontrol regelmæssig medium (RM);

B)

WFA (1 pM /24 timer) inducerer højere niveauer af apoptose i endotelceller dyrket i STS-CM end i kontrol medium;

C)

WFA (1 pM /24 timer) inducerer signifikant højere vimentin nedbrydning og caspase-3 aktivering i endotelceller dyrket i STS-CM end i hvilende endotelceller;

D)

WFA (1 uM) ophæver migration og invasion af endotelceller dyrket i STS-CM;

E)

WFA (2 mg /kg) resulterer i et betydeligt fald i det gennemsnitlige antal CD31-positive (røde) blodkar i forhold til at styre DMSO behandling i en

in vivo

Gelfoam assay . CD-31 (rød) /TUNEL (grøn) dobbelt farvning afslører endotelcelle apoptose i WFA-behandlede mus. Grafer repræsenterer gennemsnittet af tre gentagne forsøg ± SD. (Vim FL = fuld længde vimentin, VDP = vimentin nedbrydningsprodukter)

Endotelceller er mesenchymal oprindelse og dermed udtrykke vimentin, så vi evaluerede effekten af ​​WFA på vimentin udtryk og spaltning i både almindelige medier og STS-CM. Interessant WFA inducerede signifikant højere vimentin nedbrydning og caspase-3 aktivering i endotelceller dyrket i STS-CM end i hvilende endotelceller (Figur 6C). Dernæst vi evaluerede effekten af ​​WFA på endothelcellemigration og invasion. Svarende til den tidligere beskrevne eksperimentelle fremgangsmåde anvendes med STS-celler anvendte vi levedygtige endotelceller forbehandlet med kortsigtet WFA (4 timer) i modificerede Boyden kammer assays. Som forventet, STS-CM forbedret endothelcellemigration og invasion. Mere vigtigt, WFA ophævet migration og invasion af endotelceller dyrket i STS-CM, men ikke fra dem, der dyrkes i almindelig medium (figur 6D).

Sidste, at bekræfte, at den observerede WFA antiangiogeniske effekt opstår

in vivo

så godt, vi udførte en Gelfoam angiogenese assay Gelfoam svampe blev inkuberet i STS-CM og implanteres subkutant i flankerne af SCID-mus. To dage efter implantation blev mus behandlet med i.p. WFA (2 mg /kg, n = 4) eller DMSO (n = 4) i 10 på hinanden følgende dage; ved forsøgets afslutning blev Gelfoams udskåret og underkastet IHC-analyse (figur 6E). WFA behandling resulterede i et signifikant fald i det gennemsnitlige antal CD31-positive blodkar sammenlignet med kontrolgruppen DMSO behandling (41 ± 7,2 vs. 6 ± 5,3 henholdsvis; P 0,05). CD-31 /TUNEL dobbelt farvning afslørede endotelcelle apoptose i WFA-behandlede mus. Disse resultater tyder på, at WFA potentielt ophæver cellevækst, hæmmer migration og invasion, og inducerer apoptose i prolifererende endotelceller i STS mikromiljø.

epiteloprindelse kræftformer følsomhed over for WFA forstærkes i celler udviser epitelial til mesenkymale overgang ( EMT)

Vores centrale hypotese er, at celler, der udtrykker vimentin forventes at demonstrere en højere WFA følsomhed. I modsætning til STS, behøver de mere almindelige epitel oprindelse kræftformer ikke naturligt udtrykke vimentin. betydelige data viser dog, at både invasion og metastase kritisk kan afhænge af erhvervelse af en “mesenkymale” fænotype af begyndende kræft celle [32], [33], [34]. Et af kendetegnene ved denne epitelial til mesenkymale overgang, induceres vimentin udtryk. Under hensyntagen hertil, vi analyserede vimentin udtryk i et panel af karcinom cellelinjer og vurderet deres svar på WFA. Tre af cellerne (MCF7, HT29, og TMK1) udviste ingen vimentin mRNA og proteinekspression, og de to andre (MDA231 og A549) udtrykt vimentin (figur 7A). Celler, der udtrykker vimentin var signifikant mere følsomme over for WFA end dem, der ikke udtrykker vimentin (gennemsnit ± SD WFA IC

50 værdier i MDA231 og A549-celler var 1,3 uM ± 0,42 og 1,8 uM ± 0,37 henholdsvis og 2,9 uM ± 0,31, 7,8 pM ± 2,34, 3,1 uM ± 0,18 i MCF-7, HT29, og TMK1 celler, henholdsvis; P 0,05). Tilsvarende WFA (1 uM i 24 timer) fremkaldte en signifikant højere apoptotisk sats i vimentin-udtrykkende carcinomceller (P 0,05, figur 7B). WB analyse afslørede yderligere vimentin nedbrydningsprodukter i MDA231 celler sammen med forbedrede spaltede caspase-3 og aktiveret PARP ekspressionsniveauer (Figur 7C). I modsætning hertil blev der kun minimal eller ingen ekspression af spaltet caspase-3 og aktiveret PARP demonstreret i MCF7 og HT29-celler, hhv. De data, der præsenteres her yderligere at støtte den rolle, vimentin som WFA molekylært mål, hvilket tyder på mulige terapeutiske effekt af WFA på epitelial kræft udviser EMT fænotyper.

A)

WFA-inducerede vækst hæmning svarer til vimentin udtryk niveau i epitelial kræft oprindelse celler;

B)

WFA (1 uM i 24 timer), fremkalder en signifikant højere apoptotisk sats i vimentin-udtrykkende carcinomceller;

C)

WB analyse demonstrerer vimentin nedbrydning MDA231 celler sammen med forbedrede spaltede caspase-3 og aktiveret PARP ekspressionsniveauer.